This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].

1. FROS와 복제를 차단 <ol><li> 복제 막힘을 유도 <ol><li> E.의 신선한 야간 문화를 희석 OD를 600 ㎚ = 희석 복합 배지에서 0.01로 TETO 어레이 pKM1 18 실시 대장균 (0.1 % 트립 톤, 0.05 % 효모 추출물, 0.1 %의 NaCl이 0.17가 M KH 2 PO 4, 0.72 MK 2 HPO 4) 항생제는 필요 선택. 참고 :이 시스템과 호환되지 않습니다으로 선택을 위해 테트라 사이클린을 추가하지 마십시오. 필요한 샘플 당 10 ml의에 해당 문화의 볼륨을 확인합니다. 예를 들어,도 1의 실험 디자인 배양 부피 60 mL로한다. </li><li> OD 600 nm의 = 0.05-0.1까지 진탕 30 ° C에서 성장. 유도되지 않은 제어 역할을하고 pKM1에서 TetR-YFP의 생산을 유도하기 위해 남아있는 문화를 0.1 % 아라비 노스를 추가하는 10 ml의 샘플을 제거합니다. 유도되지 않은 및 유도 모두 계속 증가문화. 1 시간 후, (섹션 2 참조) 형광 현미경을 이용하여 유도 배양 각 셀 내의 단일 초점의 존재를 확인한다. </li><li> 유도 세포 (세포의 70 % 이상이 단일 초점을) 차단이 확인되면, OD600nm에서 기록 및 2-D 젤 (섹션 3 참조)에 의해 분석을 위해 7.5 ml의 샘플을 채취. 유도되지 않은 제어 문화에서 동등한 샘플을 가져 가라. </li></ol></li><li> 복제 막힘 해제 <ol><li> 복제 블록을 해제 차단 된 세포의 10 ml의 샘플에 무상 유도의 anhydrotetracycline (AT)의 100 NG ml의 -1을 추가합니다. 10 분 동안 30 ° C에서 성장과 세포 밀도 (1 ㎖), 현미경 분석 (10 μL) 및 중립 중립 2 차원 아가 로스 젤 (7.5 ㎖)에 대한 샘플을 계속합니다. </li></ol></li><li> Replisome의 축소를 유도 <ol><li> 세포는 dnaB의 TS 또는 dnaC 시액으로 온도에 민감한 대립 유전자를 포함하는 경우 그 deactiva이 필요합니다기 42 ° C로 차단 된 세포를 포함하는 플라스크를 이동합니다. 필요한 시점에서 분석을 위해 샘플을 채취 (예, 1 시간 배양 후). 세포를 1 시간 동안 42 ° C에서 배양 한 후, 10 분 (도 1 참조), 30 ° C로 세포 이동. 주 : 세포 재시작 분석 30 ° C로 전환 될 수있다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig1.jpg" /> 그림 1 :. FROS 복제 블록 및 릴리스 실험 절차의 개요 E. Teto의 배열을 운반하는 대장균 균주는 30 ° C에서 성장하고 있습니다. 세포는 0.05 위의 OD를 600 ㎚에 도달 할 때, TetR-YFP 생산은 아라비 ​​노스로 유도된다 (아라; 0.1 %). 유도되지 않은 세포의 모집단이 30 ° C에서 컨트롤 역할을 할 성장을 계속합니다. 2 시간 (2.1 참조) - 유도 된 세포 샘플 하나 후 형광 현미경을 통해 분석된다. 복제가 있다면차단 확인, 시료 시험관 (3.1 참조)로 나타낸 2-D 겔 분석 (옵션) 생존력 실험에 대해 수행된다. 복제가 차단 (AT; 0.1 μg의 / ㎖) anhydrotetracycline 제거 할 수 있고, 세포를 10 분 이상으로 하였다. 세포 (예 dnaB TS) 온도에 민감한 대립 유전자를 운반하는 경우,이 적절한 분석을 위해 42 ° C로 차단 된 세포를 이동하여 비활성화 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. 형광 현미경 <ol><li> 현미경 슬라이드 상에 용융 아가로 오스 (물 1 %)의 500 μl를 피펫 팅하여 아가로 오스 패드를 준비; 아가로 오스 응고되기 전에 즉시 coverslip에 오버레이. 필요할 때까지 4 ° C에서 젖은 조직에서 슬라이드 (들)을 저장합니다. </li><li> 아가로 오스가 고형화되면, 아가 패드 피펫으로부터 박테리아의 10 μl를 커버 슬립을 제거패드의 중심 상에 시각화 배양시 세포의 이동을 방지한다. 시료 (약 5 분) 건조되면, 커버 슬립을 교체합니다. 커버 슬립에 침지 기름 한 방울을 놓고 광학에서 슬라이드를 배치합니다. </li><li> 100X 배율에서 위상 현미경을 사용하여 세포를 시각화합니다. <ol><li> 이미징 소프트웨어 내에서 획득 대화 상자에서 100 밀리 초에 노출되는 시간을 설정합니다. 획득을 선택하여 이미지를 캡처합니다. 무대를 이동하지 마십시오. 획 득 대화 상자에서 카메라에 연결된 외부 셔터의 조명으로 YFP을 선택합니다. 1000 밀리 초에 exporsure 시간을 설정합니다. 무대 조명의 전원을 끄십시오. 획득을 선택하여 형광 이미지를 캡처. 참고 : 시간은 사용하는 광원, 현미경과 카메라에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> 위상 및 형광 이미지를 오버레이, 컬러 디스플레이 메뉴 내에서 결합을 선택합니다. 색으로 대화 상자를 결합 녹색 성분 및 BL 같이 위상 이미지로 YFP 이미지를 선택UE 구성 요소입니다. 결합 색상을 클릭합니다. 인구가 성공적으로 세포의 대부분은 세포 당 하나의 포커스가 있는지 여부를 설정하여 복제 차단했다 여부를 결정합니다. 참고 : 시각적으로 EYFP 생산의 차이를 식별에 추가 아라비 노스없이 컨트롤에서 샘플 비교에 유용합니다. </li></ol></li></ol> 3. DNA 추출 / 아가로 오스 플러그 <ol><li> 단계 1.1.3과 1.2.1에서 7.5 ml의 배양 샘플에 아 지드 화 나트륨 (0.1 %의 최종 농도)를 추가합니다. 적어도 5 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 주 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이다. 작업을 시작하기 전에 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하고 모든 안전 예방 조치 문구를 읽고 이해하기 전에는 그것을 처리하지 않습니다. </li><li> 10 분 펠릿 세포에 대한 세포에게 5,000 XG를 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 페트 IV (PIV) 버퍼 200 μL에 펠렛을 재현 탁 (10 mM 트리스 : 염산 (PH 8.0), 1 M의 NaCl). 마이크로 원심은 (13, 2 분 동안 000 XG)는 세포 펠렛합니다. 디뜨는을 scard. 이 단계, -20 ° C에서 펠렛 더 공정 또는 상점에서. </li><li> 50 ° C에서 50 μL의 PIV 및 장소에서 가장 낮은 세포 밀도로 세포를 재현 탁. 최종 세포 밀도가 각 튜브에서 동일하므로 다른 모든 샘플은, PIV의 볼륨을 조절 (50 μL에 재현 탁 예 샘플 1 (OD를 600 ㎚ = 0.128), 샘플 2 54 μL에 재현 탁 (OD를 600 ㎚ = 0.138)). <ol><li> PIV 갓 제조 된 0.8 % 아가 용액을 같은 부피 추가 (최종 농 0.4 %. 예를 들어, 샘플 1 내지 50 ㎕의 샘플이 54 μL). 샘플, 아가로 오스와 PIV가 응고를 방지하기 위해 50 ° C 이상인지 확인합니다. </li></ol></li><li> 적절한 유리 발수 또는 실리콘 솔루션의 40 μL와 현미경 슬라이드를 취급합니다. 이 건조 될 때까지 휴지로 슬라이드를 문질러. 주 :이 사전에 수행 할 수 있고, 처리 된 슬라이드를 실온에서 장기간 보관. </li><li> t의 20 μl의 방울을 배치그는 슬라이드 셀 / 아가로 오스 서스펜션은 반구형이다 플러그를 생성한다. 참고 : (50 μL의 PIV에 재현 탁) 첫 번째 샘플은 하나의 슬라이드에 5 플러그를 생성합니다. </li><li> 플러그 고화 한 경우에는, 미세 원심 분리 관에 부드럽게 밀어 1 mL의 세포 용해 완충액 (10 mM 트리스 - 염산 [pH를 8, 1 M의 NaCl, 100 mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA), 0.2 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.5 %를 추가 N-Lauroylsarcosine 나트륨 염 (Sarkosyl), 100 μg의 용액에 1 - 리소자임, 50 μg의 ml로 - 하나의 RNase A). 2 시간 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 세포 용해 완충액을 제거하고 1 ㎖의 EDTA / Sarcosyl / 테 K (ESP) 용액 (0.5 M EDTA, 1 % N-Lauroylsarcosine 나트륨 염 (Sarkosyl), 1 mg의 용액 1 - 테 K)를 추가한다. 하룻밤 또는 플러그가 투명 할 때까지 50 ° C에서 품어. 제 밤새 배양이 필요한 경우, 약 18 시간 후 새로운 버퍼와 ESP 솔루션을 대체. </li><li> 제거ESP 버퍼 각각의 세척과 30 분의 평형을 허용, 12 ml의 트리스 EDTA (TE) 버퍼 (10 mM 트리스 - 염산, 1 mM의 EDTA, pH를 8.0)와 플러그 5 회 반복한다. 1 ml의 TE 버퍼 4 ° C에서 보관. </li></ol> 4. 중립 중립 2 차원 젤 전기 영동 <ol><li> 신선한의 microfuge 튜브에 단계 3.8에서 아가로 오스 플러그를 전송하고 제한 효소 버퍼 (1 배 농도)의 150 μl를 추가합니다. 제한 효소 25-100 추가 유닛 (EcoRV로의 예를 들면, 60 단위 ()도 3a 참조). 6 ~ 8 시간 동안 37 ° C에서 다이제스트. </li><li> 4 ° C에서 약 25 × 25 cm의 젤 트레이에 1X 트리스 / 붕산염 / EDTA (TBE)의 0.4 % 아가 로스 젤 (300 ml)에 붓는다. 약 웰 플러그의 지름과 동일한 폭 있도록 빗살입니까. 겔이 설정되면, 빗살를 제거하고 실온으로 겔을 이동. </li><li> t 웰의 측면에 대해 플러그의 평탄한 슬라이드 위치 잘로 소화 아가 플러그를 밀어그는 DNA는 젤을 입력합니다. 매 초마다 우물에 동일한 방식으로 하나의 플러그를 삽입합니다. </li><li> 위치에 플러그를 밀봉하는 웰에 0.4 % 아가로 용융 피펫. </li><li> 비어있는 웰에 부하 1킬로바이트의 DNA 사다리 다시 사다리와 샘플 사이의 간극을두고, 실온에서 밤새도록 1X TBE에에서 (16 시간, 55 V)을 겔을 실행. </li><li> 20 분 동안 에티 디움 브로마이드 (0.3 μg의 용액 -1)를 함유하는 수욕에서 겔 얼룩. 참고 : 에티 디움 브로마이드가 강력한 돌연변이와 독소로 간주됩니다. 작업을 시작하기 전에 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하고 모든 안전 예방 조치 문구를 읽고 이해하기 전에는 그것을 처리하지 않습니다. </li><li> 심지어 레인의 양측에 과잉 아가 로스를 포함 최소화 잘라 긴 파장의 UV transilluminator가 갖는 DNA를 시각화하고 직선과 각 레인 단편을 잘라. 주 : 관심의 단편을 5.5 킬로바이트 인 경우, 예를 들어, approximat 5 킬로바이트에서 DNA 단편을 포함하는 7.5 cm 단편을 잘라엘리 12킬로바이트 (그림 3A 참조). </li><li> DNA 이동의 방향에 90 °로 겔 트레이에서 적출 젤 레인을 놓습니다. 참고 : 3 젤 조각의 두 행은 25 × 25 2cm 젤 트레이에 들어갈 수 있습니다. 겔 레인의 첫 번째 행은 12.5 cm에서 트레이 번째 행의 상부에있다. </li><li> 두 번째 차원 젤 (0.3 μg의 ㎖의 -1 에티 디움 브로마이드와 1X TBE 0.9 %)에 대한 아가로 오스 300 ml의를 준비합니다. 아가로 오스가 50 ° C로 냉각 될 때, 자신의 위치를​​ 응고 겔 조각 주위에 용융 아가 피펫. 겔 슬라이스로 적어도 레벨 깊이로 트레이에 남아있는 아가로 오스를 따르십시오. </li><li> 젤이 응고되면 DNA가 약 10cm를 마이그레이션 할 때까지, 220 V에서 0.3 μg의 ㎖의 -1 에티 디움 브로마이드를 포함하는 1 배 TBE 4 ° C에서 electrophorese. 4 시간이 5.5 kb의 단편 충분하지만 작은 조각은 적은 시간이 필요합니다 있습니다. </li><li> 게놈 DNA는 본 U 인 블록 절제(도 3c 참조)도 표시되지 않은 DNA를 포함하도록 상기 겔을 포함하는 금속 눈금자의 가장자리 부를. </li></ol> 5. 남부 하이브리드 <ol><li> 솔루션 준비 <ol><li> 본 antibody 완충액 (0.125 M HCl 용액)을 준비한다. 참고 :이 버퍼가 다시 최대 1 개월 실온에서 안정 될 수있다. </li><li> 변성 버퍼 (1.5 M의 NaCl, 0.5 M 수산화 나트륨)를 준비합니다. 주 : 변성 버퍼가 다시 한번 실온에서 최대 3 개월 동안 안정 할 수있다. </li><li> 중화 완충액 (1.5 M의 NaCl, 0.5 M 트리스)을 준비한다. HCl로 pH를 7.5로 조정합니다. 주 : 중화 완충액 번 다시 실온에서 최대 3 개월 동안 안정 할 수있다. </li><li> 단계 5.2.4과 5.2.6에 사용 - 10 배 염 나트륨 시트르산 (SSC) 버퍼 (8 0.15 M 트라이 구연산 나트륨, 1.5 M의 NaCl은, pH가 7) 준비합니다. 이 버퍼에서 (단계 5.2.9에서 사용하기 위해) 2 배 SSC 주식을합니다. 참고 : 10 배의 SSC와 배 SSC a를3개월 동안 실온에서 안정한 재. </li><li> 수정 교회 및 길버트 혼성화 완충액 19 준비 (0.5 M 인산 완충액 [pH가 7.2, 7 % (/ v)의 소듐 도데 실 설페이트 (SDS), 10 mM의 EDTA w). 사용하기 전에 완전히 용해 65 ° C에서 둡니다. </li></ol></li><li> 이전 <ol><li> 로커 또는 궤도 쉐이커상에서 RT에서 10 분 동안 본 antibody 용액 절제된 겔 블록을 헹군다. 아가로 오스 블록의 손상을 방지하기 위해 낮은 교반 속도를 유지합니다. </li><li> 30 분 동안 변성 버퍼 짧게 증류수 후 겔 블록을 헹군다. 증류수에 다시 잠시 헹군 후, 실온에서 교반과 함께 30 분 동안 중화 완충액 겔 블록을 배양한다. </li><li> 겔 (들)의 정확한 크기를 나일론 막 잘라. 미래의 단계로 막을 배향을 지원하기 위해 오른쪽 상단 모서리에 별명을 잘라. 참고 : 두 젤 블록 (6 샘플)은 하나의 막에 가시화 될 수있다. </li><li> 그럴 필요로 충분히 10 배 SSC를 부어님은 밤새 건조하지 않도록. 약 5cm 버퍼의 수준 이상으로 플랫폼을 만듭니다. 플랫폼에 10 배 SSC와 장소 3MM 크로마토 그래피 용지 3 매를 포화. 가에 막 젤 들어갈만큼 충분히 긴 양쪽 끝에서 버퍼에 몰입 할 넓은되도록 크로마토 그래피 종이를 잘라. </li><li> 포화 크로마토 그래피 종이 위에 젤 (들)을 놓습니다. 에 의해 통과 전송 중에 젤을 버퍼를 방지하기 위해 플라스틱 랩과 젤을 잡습니다. 조심스럽게 겔 (들)의 상단에 절단 막을 누워. 부드럽게 막에 걸쳐 병 또는 혈청 학적 피펫을 롤링하여 막과 젤 사이에 기포를 제거합니다. </li><li> 멤브레인과 동일한 크기로 3MM 크로마토 그래피 용지 세 장을 잘라. 배 SSC로 크로마토 그래피 용지 포화 멤브레인의 상부에 배치했다. 형성 공기 방울을 제거합니다. </li><li> 스택 종이 고체 지지체 다음에 블로 팅 페이퍼의 상단에 적어도 5cm 높은 수건 (아프로23 × 16 센티미터 막에 대한 1kg의 ximate 무게). 전송이 밤새 진행 할 수 있습니다. </li><li> 막에 DNA를 가교 UV의 1,200 J / m 2 막 (DNA면을 위로)를 노출. 이 단계 이전에 세척하지 마십시오. </li><li> 오점 이미지에 높은 배경을 방지하기 위해 2 배 SSC에서 철저하게 막을 씻어. 4 ° C에서 플라스틱 포장 및 저장에 포장, 하이브리드에 대한 즉시 얼룩을 사용하여 (5.3 참조) RT 그것을 건조. </li></ol></li><li> 이종 교잡 <ol><li> 예열 하이브리드 오븐 및 55 ° C에 병입니다. </li><li> 100 μg의 ml의 추가 -1 소 혈청 알부민 (BSA), 10 μg의 ml로 -1 비특이적 DNA (예를 들어 연어 정자 DNA)을 미리 가온 혼성화 버퍼. </li><li> 하이브리드 버퍼의 경우에도 적용이 가능하도록 막을 올리고 경우, 위쪽으로 향하게 멤브레인의 DNA 바인딩면 메쉬 나일론의 비슷한 크기의 사각형에 오점을 배치합니다. 긴 가장자리를 따라 오 롤. 슬라이드오점가 / 하이브리드 병 내부에 메쉬. 오점을 풀다하기 위해 예열 하이브리드 버퍼의 적절한 금액을 추가 (예 : 23 X 16cm 2 막 30 ㎖). </li><li> 1 시간 동안, 병을 회전 예열 된 오븐에서 인큐베이션. </li><li> 13 μL의 부피를하기 클레 나우 단편 및 H 2 O에 대한 버퍼를 관심 영역으로 정제 된 PCR 생성물 상동 50 ng의 랜덤 헥사 머 프라이머 (150)의 NG를 혼합함으로써 상기 프로브를 준비한다. 3 분 후 얼음에 즉시 배치 끓인다. 1 ㎜의 dCTP / dGTP의 / dTTP를 믹스 1 μL, 알파 인산염 (α 32 P-으로 dATP)에 클레 나우 단편 (5U) 50 μCi를의 데 옥시 아데노신 5&#39;- 삼인산 방사성 표지 1 μl를 추가합니다. </li><li> 1 시간 동안 실온에서 품어. 밀리미터의 dNTP 믹스 1의 1 μL와 클레 나우 단편의 1 μl를 추가합니다. 실온에서 20 분을 품어. </li><li> 5 분 동안 프로브를 끓여 및 하이브리드 튜브에 바로 추가 할 수 있습니다. 회전, 55 ° C에서 하룻밤 하이브리드. </li><li> 홍보를 가만히 따르다막에서 OBE. 주 : 프로브 번 재사용 될 수있다. </li><li> 예열 낮은 엄격 세척 완충액으로 간단히 막을 린스 (2 × SSC, 0.1 % (W / V) SDS). 신선한 낮은 엄격 세척 버퍼를 추가하고 회전 55 ° C에서 5 분 동안 품어. 반복. </li><li> 중간 엄격 세척 완충액으로 두 번 씻어 (1X SSC, 0.1 % (W / V) SDS) 회전으로 ​​55 ° C에서 10 분 동안. </li><li> 높은 엄격 세척 버퍼에 두 번 씻으 (0.1X의 SSC 0.1 % (W / V) SDS) 회전에 55 ° C에서 5 분. </li><li> 초과 액체를 제거하기 위해 조직과 막과 DAB를 제거합니다. 사전 블랭킹 저장 형광체 화면에 노출 카세트에 플라스틱 포장과 장소에 남아있는 습기가없는 보장 플라스틱 랩에 싸서. 카세트를 닫고 형광체 이미 저를 사용하여 시각화하기 전에 적어도 2 시간 동안 노출. </li></ol></li></ol>

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	<li>Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+stalling+at+natural+impediments.">Replication fork stalling at natural impediments.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).</li><li>Gupta, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+complexes+are+the+primary+sources+of+replication+fork+pausing+in+Escherichia+coli.">Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).</li><li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro.">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).</li><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+fork+dynamics+in+Escherichia+coli+DNA+replication.">Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).</li><li>Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+stalling+and+cell+cycle+arrest+in+UV-irradiated+Escherichia+coli.">Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).</li><li>Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+replication+reduces+RecA-mediated+repair+of+UV-damaged+plasmids+introduced+into+competent+Escherichia+coli.">Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli.</a> Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).</li><li>Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ruvA+and+ruvB+mutants+specifically+impaired+for+replication+fork+reversal.">ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal.</a> Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).</li><li>Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+Escherichia+coli+chromosome+arms+locate+to+separate+cell+halves.">The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves.</a> Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).</li><li>Lau, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+organization+of+replicating+Escherichia+coli+chromosomes.">Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes.</a> Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).</li><li>Gordon, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+and+low+copy+plasmid+segregation+in+E.+coli:+visual+evidence+for+distinct+mechanisms.">Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms.</a> Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).</li><li>Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+controlled+Escherichia+coli+replication+fork+stalling+and+restart+at+repressor-bound+DNA+in+vivo.">Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo.</a> EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).</li><li>Payne, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+blockage+by+transcription+factor-DNA+complexes+in+Escherichia+coli.">Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).</li><li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+replication+origins+on+ARS+plasmids+in+S.+cerevisiae.">The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae.</a> Cell. 51 (3), 463-471 (1987).</li><li>Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+UV-induced+replication+intermediates+in+E.+coli+using+two-dimensional+agarose-gel+analysis.">Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis.">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).</li><li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+replication+fork+regression+and+processing+in+Escherichia+coli.">DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli.</a> Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).</li><li>Mettrick, K. A., Grainge, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+blocked+replication+forks+in+vivo.">Stability of blocked replication forks in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Church, G. M., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequencing.">Genomic sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).</li><li>Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+process+stalled+replication+forks.">Multiple pathways process stalled replication forks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).</li><li>Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+proteins+and+rescue+of+arrested+replication+forks.">Recombination proteins and rescue of arrested replication forks.</a> DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).</li><li>Carl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+with+temperature-sensitive+synthesis+of+DNA.">Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA.</a> Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).</li><li>Nawotka, K. A., Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoretic+method+for+mapping+DNA+replicons.">Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons.</a> Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).</li><li>Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+psoralen+interstrand+cross-links+from+DNA+of+Escherichia+coli:+mechanism+and+genetic+control.">Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control.</a> J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo...

DNA 복제 동안 replisome 그 진행을 저해 DNA의 장애물에 직면하고있다. DNA 병변과 간격을 포함한 피해뿐만 아니라 비정상적인 구조는 1 진행에서 replisome를 방지 할 수 있습니다. 최근,이 DNA에 결합하는 단백질 포크 진행 2 복제 장애의 가장 일반적인 원인 인 것으로 밝혀졌다. 핵 단백질 블록과 replisome의 발생에 따라 이벤트의 기술은 이미 공지 된 위치에서 살아있는 세포의 염색체 이러한 블록을 유도하는 무능력에 의해 제한되었다. 시험 관내 분석은 운동 동작에 대한 이해를 강화했다 그것이 핵 단백질 막힘 3뿐만 아니라 4,5- replisome 자체의 기계적인 세부 사항을 충족하는 활성의 replisome. 복제의 수리 현재 이해는 일반적으로 생체 6-8에서 플라스미드 DNA를 사용하여 손상 에이전트로 자외선을 수행하고 연구한다 </s&gt;입니다. 그것은 일반적으로 이러한 연구로부터 이해되는 생체 핵 단백질 블록을 발견 한 후 복제 블록 내의 별개의 원인으로 인해 복구 경로 내에서 분자 수준의 변화가 아직 여전히 존재 여부, DNA의 복구에 관여 할 수있는 단백질 동안 결정한다. 여기서, 우리는 핵 단백질 블록 형광 리프레 조작 시스템 (FROS)를 이용하여 염색체의 특정 위치에 설정 될 수있는 시스템을 설명한다. 우리는 E.의 변형을 이용 염색체에 도입 구 (240) TETO 사이트의 어레이를 갖고 대장균. 어레이 내의 각 TETO 사이트는 어레이 내에 RECA 매개 재결합을 방지함으로써 배열의 안정성을 증가시키기 위해 측면 10 bp의 랜덤 시퀀스를 가진다. 이 배열하고, 그것의 변형이 원래 E.를 이해하는 데 사용 된 대장균 염색체 역학 10,11하지만 preve에 적응했다NT를 생체 내 복제 12. 어레이 안정적 유지하고 TetR (10, 12)에 의해 결합 될 때 복제 포크의 100 %에 가까운 차단하는 것으로 밝혀졌다. 22 사이트 복제의 90 %를 차단하기에 충분한 보유하면서이 짧은 배열 생체 13 덜 효과적 이었지만 체외 유사한 LACO 어레이의 사용은 몇으로 발견했다. 핵 단백질의 차단을 만들 배열을 적용하려면 리프레 서 단백질은 매우 그 다음로드 블록을 만들 배열에 결합 최적화 된 조건 하에서 과잉 생산해야합니다. 테트 리프레의 형광 태그 변형이 사용되는 경우, 막힘의 형성, 및 후속 릴리스는 형광 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있다. 각 셀 복제 상태는 하나의 초점은 상기 어레이의 하나의 복사본 만이 상기 셀 내에 존재하는 다수의 초점 복제 활성을 나타내는 것을 의미한다 본 병소의 수에 의해 표시된다. 이 활성 재핵 단백질 막힘이 replisome 배열을 통해 진행을 위해 충분히 운영자 사이트 TetR의 결합 친 화성을 감소 무상 유도의 추가에 의해 반전 될 때 습곡 사용할 수 있습니다. 리프레 단백질은 여전히​​ 배열 이제 여러 복사본이 가시화 될 수있는 충분히 높은 친화력을 가진 DNA에 결합 할 수있다. 핵 단백질 막힘의 이벤트의 더 복잡한 세부 중성 중립 이차원 아가 로스 겔 전기 영동 및 서던 하이브리드 14-16를 사용하여 발견 될 수있다. 이러한 기술은 인구 전체 DNA 구조의 분석을 허용한다. 잠재적 이벤트 동안 형성되고 복제 중간체는 가시화 될 수 있으며, 수리되지 않은 남아있다. 제한 효소 및 프로브 이용를 변화시킴으로써, 중간체는 어레이 영역뿐만 복제 포크 (17, 18)를 회귀 때 어레이의 업스트림뿐만 가시화 될 수있다. 그만큼회귀는 replisome 해리 이후에 일어난다; 선행 및 후행 초기 스트랜드 사방 DNA 구조 (a 할러데이 접합)에 생성 된 템플릿 가닥 동시에 재 어닐링으로 서로 주형 가닥과 어닐링 분리. 이 블록 (18)을 만나면 복제 포크 안정 아니라고 도시 된 본 시스템. 또한 replisome 부품의 온도 민감성 유도체가 붕괴되면 복제 포크 리로딩 방지하는데 이용 될 수있다. 블록이 설정되면, 스트레인은 ​​replisome의 동기 비활성화 및 재로드의 제어 방지를 보장하기 위해 비 - 허용 온도로 이동시킬 수있다. 이 온도 - 유도 된 비활성화는 주어진 시간에 붕괴 집단 내의 모든 포크를 보장하고 replisome는 DNA를 처리하는 방법, 축소, 어떤 재 요구 될 때 발생하는 평가를 허용DNA 복제 과정을 시작한다. 여기에 설명 된 시스템의 장점은 핵 단백질 블록 완전히 가역적이다; 따라서, 핵 단백질 블록으로부터 복구하는 세포의 능력에 따라야 할 것이다. 세포에 anhydrotetracycline의 첨가는 복제 포크를 진행 할 수있게 꽉 리프레의 결합을 완화되고 세포 생존 능력을 회복. 막힘의 경감은 5 분 후에 중립 중립 이차원 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 가시화, 10 분 이내 현미경으로 할 수있다. 또한, 생존 분석 복제 막힘 회복 및 증식을 계속하는 균주의 능력을 표시 할 수있다. 여기에 설명 된 실험 절차에 사용되는 균주의 유전 적 배경을 변경함으로써, 막힘이 유형 복구 경로를 해명 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16922</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92144</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>For induction of TetR-YFP production</td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>Release of replication bloackage</td></tr><tr><td>Axioskop 2 Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>452310</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>eYFP filter set</td><td>Chroma Technology</td><td>41028</td><td>Visualization of YFP</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-AG</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>MetaMorph&amp;nbsp; Software (Molecular Devices)</td><td>SDR Scientific</td><td>31282</td><td>Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>For agarose plugs and gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Original Glass Water Repellent (Rain-X)</td><td>Autobarn</td><td>DIO1470</td><td>For agarose plug manufacture</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>VWR</td><td>VWRC103157P</td><td>TE, TBE buffer component</td></tr><tr><td>Ethylene diaminetetraacetic acid</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA180</td><td>0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Bacteriostatic agent</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>TE buffer component</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5125</td><td>Cell lysis and ESP buffer component</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>6300</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>AM0706</td><td>ESP buffer component</td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 Cell</td><td>BioRad</td><td>1704507</td><td>Electrophoresis system</td></tr><tr><td>UV transilluminator 2000</td><td>BioRad</td><td>1708110</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>BioRad</td><td>1610433</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>VWR</td><td>PROL20185.360</td><td>TBE component</td></tr><tr><td>Hybond-XL nylon memrbane</td><td>Amersham</td><td>RPN203S</td><td>Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used</td></tr><tr><td>3MM Whatman chromatography paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030690</td><td>Southern blotting</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td>95-0031-01/02</td><td>Crosslinking of DNA and hybridization</td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid from salmon sperm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31149</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Denaturation buffer component</td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>VWR</td><td>PROL27833.363</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>Amresco</td><td>227</td><td>Wash buffer component</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Random Hexamer Primers</td><td>Bioline</td><td>BIO-38028</td><td></td></tr><tr><td>Klenow fragment</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td></td></tr><tr><td>Storage Phosphor Screen</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GEHE28-9564-76</td><td>BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Visualization of blot</td></tr><tr><td>Hybridization bottle</td><td>UVP</td><td>07-0194-02</td><td>35 mm x 300 mm</td></tr></tbody></table>

inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system

밀접하게 결합 단백질과 다양한 병변을 포함하여 DNA에 존재하는 장애물, 심각한 세포의 복제 기계의 진행을 억제 할 수 있습니다. replisome의 실속 복제 포크의 붕괴로 이어지는 염색체의 어느 부분 또는 전체의 해리가 발생할 수 있습니다. 이 붕괴로부터의 복구는 셀에 정확하게 완전한 염색체 복제 및 이후 분할에 대한 필요성이다. 복제를 DNA 포크를 복원하고 수 있도록 자리를 차지할 붕괴가 발생하면 따라서 세포가 진화하고 다양한 메커니즘은 높은 충실도 완료합니다. 이전에, 박테리아에서 이러한 복제 보수 경로는 알려진 위치에 국소 없다는 단점이 UV 손상을 이용하여 연구되었다. 이 원고 실속 복제 FO 붕괴를 유도 할 수있는 부위 특이 단백질의 블록을 생성하는 형광 리프레 조작 시스템 (FROS)을 이용하는 시스템을 개시대장균에서 RKS. 복제 상태는 형광 현미경 및 DNA 복제 중간체를 사용하여 하나의 살아있는 세포에서 가시화 될 수있는 방법을 프로토콜 세부 2 차원 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분석 될 수있다. replisome 성분 (예 DnaBts)의 온도 민감성 돌연변이 복제 포크 동기 붕괴를 유도하는 시스템에 포함될 수있다. 더욱이, 이러한 프로세스에 관련된 재조합 단백질 및 헬리의 역할은이 시스템에서 유전자 녹아웃을 이용하여 연구 할 수있다.

FROS는 살아있는 세포의 12, 18 시각화 복제 중간체 있도록 유도 성, 부위 특이 적 핵 단백질 블록이다. 세포를 채취하는 일반적인 실험 디자인은도 1에 도시된다. 유전 적 배경 샘플링 및 변화의 타이밍이 같은 블록의 복구를위한 연구 다기능 시스템을 만든다. 회로도는 이전에 18 사용 된 같은 dnaB 시액 및 dnaC의 TS 등 온도에 민감한 ...

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Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

사이트 특정 복제 막힘의 유도<i&gt; E. 대장균</i&gt; 형광 리프레 운영자 시스템을 사용하여

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

inducing-site-specific-replication-blockage-e-coli-using-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

8.9K 조회수.  University of Newcastle. We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

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Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

연구

유전학

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

생체공학

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol for transferring gene deletion mutations from one Escherichia coli strain to another by using generalized transduction with the bacteriophage P1. This method requires that the mutation be selectable (e.g., based on gene disruptions using antibiotic cassette insertions). Such antibiotic cassettes can be mobilized from a donor strain and introduced into a recipient strain of interest to quickly and easily generate a gene deletion mutant. The antibiotic cassette can be designed to include flippase recognition sites that allow the excision of the cassette by a site-specific recombinase to produce a clean knock-out with only a ~100-base-pair-long scar sequence in the genome. We demonstrate the protocol by knocking out the tamA gene encoding an assembly factor involved in autotransporter biogenesis and test the effect of this knock-out on the biogenesis and function of two trimeric autotransporter adhesins. Though gene deletion by P1 transduction has its limitations, the ease and speed of its implementation make it an attractive alternative to other methods of gene deletion.

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Here we present a protocol for the use of pre-existing antibiotic resistance-cassette deletion constructs as a basis for making deletion mutants in other E. coli strains. Such deletion mutations can be mobilized and inserted into the corresponding locus of a recipient strain using P1 bacteriophage transduction.

Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

생물학

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

유전자 규정의 단일 분자 이미징<em&gt; 생체에</em&gt; 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

모델 시아 노 박테리아 종의 표시 및 Markerless 돌연변이의 생성

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

DNA 이중 가닥 휴식에서 전사 활동의 살아있는 세포 화상 진찰

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

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