우리는 리옹 인사 - 엔터프라이즈 네트워크의 iGEM 팀 (Viviane Chansavang, 마틸다 Dumond, 알렉산더 Duprey, 멜라니 Geffroy, Clémence Gonthier, 마고 Jaulin, 아루 레이 하겐, Goki 리, 토마스 Poinsot, 베릴 Royer - 버트 란드, 줄리 Soula, 마이클 Vonzy의 다른 회원들에게 감사 , 피에르 이브 Zundel, Soufiane Bouhmadi, 올리비에 Brette, 게일 Chambonnier, 로라 Izard, Aurianne Kroiss, 필립 Lejeune, 아그네스 Rodrigue, 아르노 Rondelet, Sylvie Reverchon와 발레리 Desjardin)의 재정적 인 지원을위한 후원자 (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation 인사, 엔터프라이즈 네트워크 - 리옹 (Lyon)과 Biosciences 인사 - 리옹 (Lyon)의 부), 중요한이 원고의 읽기, 스트레인 선물 박사 CC의 Sze를위한 F. Wisniewski - 염료. 작살 줄에 달린 부표 B.는 박사 학위를받은 지역 론 알프에서 교제.

1. Curli 오페론의 Biobrick 설계 및 합성 <ol><li> 유전자 조직을 결정하고 curli 유전자의 내생 전사와 병진 신호를 현지화. 이러한 정보는 해당 RegulonDB 또는 EcoGene B 등의 전문 데이터베이스에 수집 및 관련 출판물의주의 독서를 통해 완료됩니다. 데이터 관리 및 silico의 preanalysis의는 복제 관리자 소프트웨어를 C로 수행되었다. </li><li> 관련 코딩 시퀀스를 선택합니다. curli 합성 (csgB 및 csgA 인코딩 섬유 단량체)와 수출 (csgE csgF와 csgG, curlin 분비물 복잡한 인코딩)를위한 다섯 절대적으로 필요한 유전자의 집합은 합성 오페론을 구성하는 선정되었다. FASTA 형식의 데이터베이스에서 선택한 시퀀스를 추출합니다. csgGFE 클러스터는 E.의 안티센스이기 때문에 대장균의 게놈은 그 역 보수 counterp에이 시퀀스를 변환&gt; 프로세스 분자&gt; 분자를 반전 복제 관리자 도구 작업을 사용하여 예술. 기능 &quot;Ligate&quot;(클론&gt; Ligate)을 사용하여 csgBA 뒤에 csgEFG 순서를 붙여 넣습니다. </li><li> 해당 발기인을 추가합니다. 발기인 P RCN의 통제하에 다섯 선택한 curli 유전자를 배치함으로써 curli는 코발트와 니켈의 존재에 이상 생산 될 것으로 예상하고 있습니다. RCN 궤적은 니켈과 공동 해독 (rcnA)와 같은 종류의 금속 - 레귤레이터 (rcnR)에 대한 책임 유출 펌프를 인코딩합니다. RcnR는 rcnA의 표현과 니켈 및 공동 19에 대한 응답으로 자신의 유전자를 제어합니다. rcnR의 CDS를 포함 RCN 순서는 전체 RCN intergenic 지역 플러스 rcnA의 41 첫번째 세포핵은 csgBAEFG 괴물 같은 순서 (전체 구조의 순서가 보조 데이터로 제공됩니다 그림 1)의 placedin 프런트했다. </li><li> 전사를 최적화신호. 완벽한 ribosome 구속력이 사이트 (또는 완벽 RBS = AAGGAGGTATATA)은 csgBA의 DNA 시퀀스의 첫 번째 ATG 앞에 추가되었습니다. 두 번째 완벽한 RBS는 csgEFG 순서의 앞에 추가되었습니다. csgB 및 csgF 및 csgG 유전자에 대한 내생 RBS가 보존되었습니다. </li><li> iGEM ​​표준을 맞추려면 장치는 에코 RI에 대한 제한 사이트, 태평양 표준시 I (접두사)와 SPE I 및 Xba I (접미사)를 포함, 표준 BioBrick 접두사와 접미사으로 둘러싸인해야합니다. 장치 D의 각 끝 부분에 해당 시퀀스를 붙여 넣습니다. </li><li> 모든 에코 RI, 태평양 표준시 I, SPE I 및 장치 Xba I 인식 사이트를 제거합니다. 자세한 조립 공정을 촉진하기 위해 BioBrick 부분 자체는 이러한 제한 사이트 중 하나를 포함 할 수 없습니다. 장치의 silico 제한 분석에서 한 PST 나는 csgA 순서에서 사이트 rcnR 순서에서 한 PST I 사이트를 공개csgE 유전자의 하나 에코 RI 사이트입니다. 이 사이트는 각각 장치 순서 (보충 자료)의 위치 80 (Mut1), 1340 (Mut2) 및 1830 (Mut3)를에 위치하고 있으며, 침묵 돌연변이에 의해 다음과 같이 수정되었습니다. Mut1 PST I 사이트는 CGTCTG에서 변경 CTGCAG Mut2 PST I 사이트는 CAGCAG에서 변경 CTGCAG GAATT에서 변경 Mut3 에코 RI 사이트 GAATTC </li><li> 복제 관리자 소프트웨어 (운영&gt; 프로세스 분자&gt; 번역 분자)를 사용하여 번역 시뮬레이션을 통해 실행합니다. 야생 유형 curli 단백질과 합성 오페론으로 인코딩 된 단백질 사이의 완벽한 호몰 로지을 확인하기 위해 순서 정렬 프로그램 BLAST를 사용하십시오. </li><li> 합성 오페론를 주문하십시오. 상업 유전자 합성 서비스는 전 세계적으로 수많은 기업에서 사용할 수 있습니다, 우리의 파트너 Genecust (룩셈부르크)였습니다. 인공 오페론 (3,165 BP) 4 μg은 몇 주 후 접수 및 pUC57 (pIG2)에 삽입되었다. </li></ol>2. 폴리스티렌에 점착성의 박테리아를 시각화하고 정량화 <ol><li> M63 최소한의 매체 (포도당 0.2 %)의 2 ML과 24 잘 폴리스티렌 판의 각 우물을 입력하고 야간 문화의 106 세포 각 우물을 예방. 흔들림없이 18-48 시간에 30 ° C에서 박테리아를 성장. 각 열 (4 우물)는 양상을 나타냅니다. 필요할 때 적절한 코발트의 양 (25-100 ㎜)과 항생제 (암피실린 100 μg.L -1)을 추가합니다. 24 잘 접시의 3 첫번째 행 3 반복 평균하여 점착성의 세균을 수량화하는 데 사용됩니다, 마지막 행 왼쪽은 biofilm을 시각화하는 데 사용됩니다. </li><li> 24 잘 플레이트의 3 첫번째 행 : 각 잘 들어, planktonic 세포를 포함하는 표면에 뜨는을 복구합니다. </li><li> 조심스럽게 한 M63의 ML과 수영장 2.2에서 얻은 초기 표면에 뜨는있는 한 ML 세척)과 잘 각각 씻어. 이 수영장은 수영장 세포 (= S)로 언급됩니다. </li><li> 한 ML O에서 biofilm을 복구스크랩와 등을 아래로 pipetting하여 F M63 (= B). 와동 15 초. 각 양상에 해당하는 준수 비율을 제공하는 600 나노 미터 (OD600)에서 광학 밀도의 표면 부착 수영 박테리아의 수를 추정합니다. </li><li> 준수의 비율은 수식을 사용하여 계산됩니다 Bx100 / (3xS + B). </li><li> 만 24 잘 접시의 마지막 행의 경우 : planktonic 전지를 폐기하십시오. </li><li> M63 접시의 바닥에 개발 한 biofilm의 1 ML을 씻어. </li><li> 80 1 시간에 열려있는 판을 건조 ° C. </li><li> 잘 표면 첨부 박테리아를 시각화하는 물과 다양한 세차 다음 각에서 2 분 동안 20 % 크리스탈 바이올렛 100 μl를 추가합니다. 세 독립 assays (접시)는 재현성을 보장하기 위해 수행해야합니다. </li></ol> 3. 현미경으로 유리에 점착성의 박테리아를 시각화 <ol><li> 형광 섀시를 얻을. E. 어떤 constitutivel 대장균 SCC1 전자 스트레인y는 MG1655 20 플라스미드 베어링 합성 curli 오페론에 적합한 호스트 부모 부담로부터 관찰 할 수있는 차이가 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하고 있습니다. </li><li> S23 부담을 얻기 위해 pIG2 플라스미드 (에코 RI / PST I pUC57 플라스미드의 사이트에 삽입 = 합성 curli 오페론)을 SCC1을 변환 할 수 있습니다. 제어 변종에게 S24 21 얻을 수 플라스미드 제어 (pUC18)에 SCC1을 변환 할 수 있습니다. </li><li> S23과 컨트롤의 밤 precultures (S24) 30의 변종 ° M63 포도당을 보충 매체 (0.2 %) 및 암피실린 (100 μg.L -1)에서 C를 성장. </li><li> precultures 100 μl와 페트리 접시에서 동일한 매체 15 ML의 예방. 코발트 (예 : 25 μM)의 적절한 농도를 추가하고 코발트없이 부정적인 컨트롤을 잊지 마세요. 각 페트리 접시 3 사각 유리 coverslip을 소개합니다. 떨지 않고 30 ° C에서 하루 아침에 품다. </li><li> 아프로 coverslip을 제거페트리 접시와주의 깊게 배수 m. 모든 박테리아 잔류 물을 닦아으로 70 °의 에탄올를 임신 작은면 물건을 낮은 얼굴을 조심스럽게 닦아주십시오. 공 촛점 관찰은 coverslip의 추가 고정 할 수 있도록 몇 밀리미터에 두 상부 끝을 청소하십시오. </li><li> 점착성의 박테리아는 형광 현미경으로 직접하지만 신속하게 시각화하지만, 조심스럽게 샘플의 건조 방지 할 수 있습니다. </li><li> 공 촛점 관찰를 들어, 얼굴을 배치 biofilm이 적용 위쪽 얼굴을 유리 슬라이드에 coverslip을 입금. biofilm 그런 다음 광택이있는 유리 슬라이드에 고정되어있는 큰 coverslip,로 덮여 있습니다. biofilm 이제 낮은 얼굴에 수 있도록 설정을 반전. </li><li> 공 촛점 레이저 현미경으로 설치를 놓습니다. 오른쪽 Axioplan2 LSM510 (Zeiss) 공 촛점 레이저 현미경은 Platim 플랫폼 F에서 사용되었다. </li><li> 설정합니다. 일으키다 488 nm의에서 GFP 및 범위의 세균 형광 500-600 nm의 수집<html> . 공 촛점 모드를 스캔 레이저의 이미지를 획득을위한 40x 기름 침지 목표를 사용합니다. 1 μm의 단계를 사용하여 고체 표면에서 성장 매체와 인터페이스에 biofilms의 전체 입체 구조를 검사합니다. </li><li> IMARIS 소프트웨어 (Bitplane, 스위스 취리히)의 입체 투영을 수행합니다. 통계 세로 섹션을 따라 평균 Z 값의 분석에 의해 biofilm의 두께를 결정합니다. 다른 곳에서 22에 설명 된대로 biofilm의 biovolumes의 정량화는 공 촛점 Z-스택에서 추출 할 수 있습니다. </li></ol> RegulonDB는 전사 단위, 발기인 및 시그마 유형, 유전자 및 ribosome 바인딩 사이트, 터미네이터, 특정 전사 규제 당국의 구속 사이트뿐만 아니라, 규제 문구로 자신의 조직에 오페론의 구조 및 분해에 대한 기계론의 정보를 제공합니다.동부 표준시 = &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp B EcoGene 데이터베이스는 E.에 대한 최신 정보가 포함되어 있습니다 대장균 K-12 게놈과 광범위한 유전자 참고 문헌을 포함하여 프로테옴 시퀀스. 주요 EcoGene의 초점은 번역 시작 사이트의 재평가되었습니다. <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> C <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> d 개 <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> 춘 차우 Sze, 난 양은 기술 대학, 싱가포르의 전자 선물. F Platim 현미경 플랫폼 UMS3444 BioSciences 모이는 - 리옹 수드.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

중요 단계 이 합성 생물학의 접근에서 가장 중요한 단계는 유전자 디자인입니다. 합성 유전자 디자인은 효율적인 시스템 생산을 보장 할 수 세심한 할 수 있습니다. 핵 유출의 바이오 정화, 자신의 분비 시스템에 관련된 단백질을 인코딩 섬유 단량체 세 유전자를 인코딩 두 유전자는 소설 응용 프로그램을위한 새로운 기능 단위를 만들려면 강력한 금속 inducible 발기인으로 조립...

비 생물 적 지원 세균 준수는 bioremediation, biocatalysis 또는 미생물 연료 전지에서 중요한 역할을 담당하고 있습니다. Bioremediation 공정은 유기 물질을 저하하거나 금속 분포 (고정, 휘발) 또는 분화를 수정 미생물의 용량을 사용합니다. 이러한 유익한 활동은 산업 및 국내 폐기물의 오염 물을 치료하기 위해 개발 된 인공 시스템에서도 수중 및 지상 생태계에서 관찰하지만 수 있습니다. 미생물 활동의 강도와 품질뿐만 아니라 미생물의 라이프 스타일 (자유 부동 또는 biofilm에 포함)에, physico - 화학 요소에 따라 달라집니다. biofilm 형성은 다양한 메커니즘에 의해 biocides에 대한 저항력을 증진 신진 대사와 연결되어 있습니다. 이러한 현상 따라서 대부분의 bioremediation 프로세스에 권장됩니다. 또한, biofilm 형성을 제어 할 수 엔지니어링 대장균 세포가 성공적으로 적용되었습니다biochips 2-3에서 전체 셀 센서를 고정. 금속의 높은 농도에 대한 미생물의 적응은 셀에 금속을 집중 할 수 다양한 세포 외 기질 구성 요소에 같은 흡착과 같은 메커니즘, 유출 펌프의 작동 또는 특정 이동 통신 사업자를 통해 발생합니다. 유전 공학을 통해이 박테리아 활동을 증폭하는 것은 특히 Raghu 외 의해 설명 된대로 약한 수량에 높은 독성 금속의 경우, 실험실 규모의 금속 오염의 효율적이고 저렴한 치료를 할 수 있습니다. 2,008 4. 세균 개선이 경우에는 이온 교환 수지를 사용하여 클래식 화학 공정에 비해 경쟁력과 비용을 절약 방법을 나타냅니다. 저자는 E. 설명 대장균 섀시는 유 전적으로 여러 사본을 변형하여 다음의 플라스미드 수 있도록 과잉을 유출 펌프 인코딩 유전자 rcnA을 패고, 그리고에 의해 코발트 이해와 첫 보존을위한 설계코발트에 대한 우대 이해와 전송이 있습니다. 이러한 긴장은 방사능이 유출 치료 이온 교환 수지에 대한 효율적인 대안으로 보이지만 핵심 해결되지 않은 문제는 프로세스 (4)의 말에 오염 된 세균의 회복입니다. 우리 연구의 목적은 유리 또는 플라스틱과 같은 비 생물 적 지원에 대항 할 수있는 맞춤 디자인 스트레인 할 수 엔지니어링하는 것이했습니다. adhesins 및 그람 박테리아에서 확인 자기편 fimbriae의 전체 세트 사이, 우리는 curli 생산을 허용하는 시스템을 설계하기로 결정했습니다. Curli는 E.에서 돌출 얇은 (2-5 나노 미터 직경)와 매우 aggregative 아밀로이드 섬유 아르 비 결정과 불용성 매트릭스 5-7로 대장균 및 살모넬라 균의 표면. Curli도 비 생물 적 표면과 biofilms 8 개발의 식민지에 참여하고 있습니다. Curli 최근 수은 이온에게 9 바인딩 게재되었습니다. Amyloids은 실제로 높은 가지고하는 것으로 알려져 있습니다이러한 잘라 내기 : 2 금속 이온에 대한 친화력 +, 아연 2 +와 철 3 + 10. 이 속성은 더 이상 금속 오염 유출 물들의 정화를 개선 할 수 있습니다. CSG 클러스터는 curli 섬유의 생산을 책임지고 두 divergently 베꼈 operons (그림 1)의 형성되어 있습니다. csgB, csgA 및 csgC 유전자는 두 curli의 subunits, CsgA 및 CsgB을 인코딩 감각의 오페론를 구성합니다. CsgC는 curli의 biogenesis 시스템 내에서 산화 환원 활동에 참여하고 기공 동작 11 CsgG에 영향을 보인다. 그러나, curli - 생산 박테리아의 대부분의 csgC의 부재는 해당 단백질이 curli의 biogenesis 제어 만 secundary 수준을 제공했음을 나타냅니다. 시스템을 단순화하기 위해, 우리는 유전자의 최소 수와 작동하도록 선택되었습니다. csgDEFG는 규정 및 운송에 필수적인 단백질을 operonencodesCsgA와 CsgB의 세포 표면에. CsgD는 csgBAC 오페론의 전사 활성이며, curli의 fimbriae 및 셀룰로오스 12 다른 biofilm 구성 요소의 생산을 제어하여과 억제 편모 생산 13의 biofilm 형성의 제어에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. CsgE, CsgF과 CsgG는 주요 curli subunit 단백질 CsgA은 수용성 단백질로 분비되는 통해 외부 - 막에 curli 특정 분비 장치를 구성합니다. CsgA의 중합은 막에 바인딩 nucleator 단백질 CsgB (14에서 검토)에 생체에 따라 달라집니다. 여러 두 구성 요소 시스템을 포함하는 복잡한 규제 경로는 curli 유전자 발현 15-16을 제어하는 표시되었습니다. 이러한 복잡한 규정은 박테리아가 환경 단서에 대한 응답으로 curli 생산을 통해 두꺼운 biofilms를 형성 할 수 있지만, 산업용 애플리케이션을위한 제어하기가 어렵습니다. 메트로폴리스의 회복을 촉진하기산업 과정에서 박테리아를 알이 - 박제, 고체 지원 세균 고정은 참으로 잘 정의 된 매개 변수 (들)에 의해 제어해야합니다. curli의 점착성의 속성들은 아밀로이드 자연 17에 연결되어 bioremediation 프로세스를 개선하는 데 사용할 수 있지만, 간단하고 쉽게 제어 장치가 만들어 져야한다. 이 일곱 유전자 18 사이, 5 세트가 절대적으로 curli 합성 (csgB 및 csgA 인코딩 섬유 단량체)와 수출 (csgE csgF와 csgG, curli 분비물 복잡한 인코딩)에 대한 유전자 필요는 합성 오페론을 구성하는 선정되었다. curli의 &quot;자연&quot;규정, 설계 및 합성 된 강력하고 코발트 - overinducible 발기인 (그림 2)의 통제하에이 5 CSG ​​유전자를 포함하는 합성 오페론을 탈출 할 수 있습니다. curli 인코딩 지역의 단계별 분석 및 기능 SYN에 대한 설계 절차thetic 오페론이 설명되어 있습니다. 폴리스티렌과 유리에 세균 준수를 시각화하고 정량화하는 방법에는 다음 두 가지 방법이 설명되어 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> 합성 P RCN이 포함 된 3,165 BP EcoRI / PstI 조각과 pUC57 (pMB1 오라, 2710 BP) - csgBAEFG 오페론을, 앰프 연구 </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> 앰프 R, (pMB1 오라, 2686 BP) Multicopy 플라스미드 </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP 태그 MG1655, CC Sze의 선물) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> CoCl 2 </td><td> 시그마 </td><td></td><td> 0,1 M 주식 솔루션은 실온에서 보관 </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </TD&gt; </tr><tr><td> 24 잘 판 </td><td> Nunc </td><td> 55,429 </td><td> 폴리스티렌 24 잘 접시 </td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

여기에 설명 된 방법은 E. 디자인을 변경해에 구성 강하고 금속 overinducible 발기인의 통제하에 curli 유전자의 최소 수를 조립하여, 그리고 세균 준수의 결과 이득을 시각화하고 정량화에 대장균을 준수 속성. 이 방법은 적절한 엔지니어링 추상화의 원리 및 합성 생물학의 표준화 및 BBa_K540000 Biobrick의 결과 (가장 새로운 Biobrick 장치, 설계, iGEM 2011) 적용됩니다. 첫 번째 단계는 야생 타입 스트레인의 준수 능력을 증가에 따라서 금속에 대한 응답으로 curli의 과잉에 전념 합성 오페론의 디자인으로 구성합니다. 원래 curli 오페론은 전사와 병진 신호를 최적화하고 curli의 &quot;자연&quot;규정을 탈출하기 위해 silico에 바뀌 었습니다. 이 방법은 성공 curli 생산의 현재 이해를 테스트 할 수있었습니다. MoreoveR은, 간단한 금속 규제​​ 발기인으로 내생 복잡한 발기인 (10 개 이상의 전사 규제가 확인)를 전환하여 curli 규정을 단순화하는 것은 제어 할보다 쉽게​​ 준수합니다. 두 번째 단계는 간단한 방법의 구현으로 준수 능력의 질적 및 양적 평가를 포함하고 있습니다. 이러한 방법은 biofilm 형성에 관여 생물학적 구조에 관계없이 자기편 박테리아의 큰 범위에 적용됩니다. 24 잘 폴리스티렌 판에 준수 테스트 크리스탈 바이올렛 염색 후 세균 biofilm의 빠른 사전 시각화를 제공합니다. 이 질적 시험은 준수의 비율을 정량화하여 날카롭게 할 수 있습니다. 이러한 방법은 매우 간단하지만, 좋은 반복성과 재현성을 모두 이전 한 설명으로 만 크리스탈 바이올렛 염색보다 더 정확합니다. 형광 또는 레이저 믿어으로 유리 슬라이드에 GFP 태그 박테리아의 시각화ocal 현미경은 현상을 직접 관찰하여 24 잘 판 테스트를 얻은 결과를 강화 할 수 있습니다.

E.의 야생 타입 CSG 시퀀스의 silico 특수 효과의 전사와 병진 신호의 최적화와 관련된 대장균 K12는 단일 합성 curli 오페론 P RCN-CSG는 그림 3 (보조 데이터의 전체 순서)에 표시된 설계 할 수있다. 프로토콜 2 프로토콜 3 curli 생산과 관련된 준수를 시각화하고 정량화하는 데 사용되었습니다. 24 잘 폴리스티렌 판에 크리스탈 바이올렛 염색 (protocole 2) 각도의 하단에...

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Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

합성 오페론 인코딩 모두 분비 장치와 curli 섬유의 구조 단량체의 디자인이 설명되어 있습니다. 이 amyloids와 자기편 고분자의 과잉은의 준수 측정 게인을 할 수 있습니다<em&gt; E. 대장균</em&gt; 섀시<sup&gt; 1</sup&gt;. 준수를 시각화하고 정량화하기 쉬운 방법이 설명되어 있습니다.

단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K 조회수.  Université de Lyon. 합성 오페론 인코딩 모두 분비 장치와 curli 섬유의 구조 단량체의 디자인이 설명되어 있습니다. 이 amyloids와 자기편 고분자의 과잉은의 준수 측정 게인을 할 수 있습니다 E. 대장균 섀시 1. 준수를 시각화하고 정량화하기 쉬운 방법이 설명되어 있습니다.

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Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

룽 공학을위한 절차

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

연구

생체공학

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing material properties 1. Normal voice production relies on healthy tissue and vocal folds, and occurs as a result of complex coupling between aerodynamic, structural dynamic, and acoustic physical phenomena. Voice disorders affect up to 7.5 million annually in the United States alone 2 and often result in significant financial, social, and other quality-of-life difficulties. Understanding the physics of voice production has the potential to significantly benefit voice care, including clinical prevention, diagnosis, and treatment of voice disorders.
Existing methods for studying voice production include in vivo experimentation using human and animal subjects, in vitro experimentation using excised larynges and synthetic models, and computational modeling. Owing to hazardous and difficult instrument access, in vivo experiments are severely limited in scope. Excised larynx experiments have the benefit of anatomical and some physiological realism, but parametric studies involving geometric and material property variables are limited. Further, they are typically only able to be vibrated for relatively short periods of time (typically on the order of minutes).
Overcoming some of the limitations of excised larynx experiments, synthetic vocal fold models are emerging as a complementary tool for studying voice production. Synthetic models can be fabricated with systematic changes to geometry and material properties, allowing for the study of healthy and unhealthy human phonatory aerodynamics, structural dynamics, and acoustics. For example, they have been used to study left-right vocal fold asymmetry 3,4, clinical instrument development 5, laryngeal aerodynamics 6-9, vocal fold contact pressure 10, and subglottal acoustics 11 (a more comprehensive list can be found in Kniesburges et al. 12)
Existing synthetic vocal fold models, however, have either been homogenous (one-layer models) or have been fabricated using two materials of differing stiffness (two-layer models). This approach does not allow for representation of the actual multi-layer structure of the human vocal folds 1 that plays a central role in governing vocal fold flow-induced vibratory response. Consequently, one- and two-layer synthetic vocal fold models have exhibited disadvantages 3,6,8 such as higher onset pressures than what are typical for human phonation (onset pressure is the minimum lung pressure required to initiate vibration), unnaturally large inferior-superior motion, and lack of a "mucosal wave" (a vertically-traveling wave that is characteristic of healthy human vocal fold vibration).
In this paper, fabrication of a model with multiple layers of differing material properties is described. The model layers simulate the multi-layer structure of the human vocal folds, including epithelium, superficial lamina propria (SLP), intermediate and deep lamina propria (i.e., ligament; a fiber is included for anterior-posterior stiffness), and muscle (i.e., body) layers 1. Results are included that show that the model exhibits improved vibratory characteristics over prior one- and two-layer synthetic models, including onset pressure closer to human onset pressure, reduced inferior-superior motion, and evidence of a mucosal wave.

The methodology for fabricating synthetic vocal fold models is described. The models are life-sized and mimic the multi-layer structure of the human vocal folds. Results show the models to self-oscillate at pressures comparable to lung pressure and demonstrate flow-induced vibratory responses that are similar to those of human vocal folds.

합성, 멀티 레이어, 셀프 진동 보컬 접어 모델 제작

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

밀도 그라데이션 Multilayered 중합 (DGMP) : 멀티 칸 만들기위한 소설 기법, 조직 공학을위한 사용자 정의 공사장 공중 발판

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

의 광학 검출<em&gt; E. 대장균</em메조 포러스 실리콘 바이오 센서에 의해&gt; 박테리아

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

에 내장 혈관 신생에 의하여 조직 공학<em&gt; 생체</em&gt; 조직 공학 상공 회의소

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

단일 벽 탄소 나노 튜브에 바이오 모방 고분자와 공학 분자 인식

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

살아있는 세포를 엔지니어하는 합성 생물학을 사용하여 해당 프로그램 자료와 인터페이스

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...