This work was supported by "Spanish Ministry of Economy and Competitiveness" [grant number BIO2014-5258P], "European Commission" by the H2020 programs [grant numbers TBVAC2020 643381].

모든 마우스는 통제 된 조건 하에서 유지와 질병의 징후가 관찰되었다. 실험 연구는 실험 동물의 보호와 관할 지역 윤리위원회의 승인과 유럽 국가 지침과 일치 하였다. BCG 덴마크어의 정량화 글리세롤 주식 및 결핵균의 H37Rv 1. 준비 주 : 설명 된 모든 프로토콜은 BSL3 조건 하에서 수행 하였다. <ol><li> BCG 덴마크어 또는 H37Rv 균주의 해동 냉동 글리세롤 주식 및 트윈 80 0.05 % (v / v)로 및 ADC (알부민, 포도당, 카탈라제) 10 % (v / v)의 보충 7H9 매체 (10) 10ml에 100 μl를 접종. </li><li> 배양 로그 상에 성장 될 때까지 37 ℃에서 일주일 동안 정적 조건에서 인큐베이션. </li><li> 신선한 배지 200㎖에 10 ml의 문화를 전송하여 세균 배양을 확장 할 수 있습니다. 20 추가 품다정적 조건에서 일. </li><li> g X 2500에서 15 분 동안 50 ml의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 전송합니다. </li><li> 상층 액을 버리고 잔류 볼륨에서 세균 펠렛을 재현 탁. (- 튜브 당 15 10) 각각의 튜브 멸균 3 mm 직경의 유리 구슬에 추가합니다. </li><li> 소용돌이 적극적 위해 1 분 동안 세균 덩어리를 떼어 놓다합니다. 트윈 80 0.05 %와 PBS 10 ml의 각 펠렛을 재현 탁 (v / v)로. </li><li> 가장 큰 세균 단위 및 유리 구슬이 정착 할 수 있도록 10 분 동안 튜브를 남겨주세요. </li><li> 하나의 신선한 50 ml의 원심 분리기 튜브 (최종 복구 된 볼륨 38 ㎖)에 작은 덩어​​리와 하나의 박테리아 및 전송 볼륨을 포함하는 4 튜브의 각에서 상층 액 9.5 mL로 복구 할 수 있습니다. 400 × g으로 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 15 %의 최종 글리세롤 농도를 수득 한 신선한 50 mL의 원심 분리 튜브 (주로 단일 박테리아를 함유 함) 상등액 35 mL를 복구 및 글리세롤로 50 % (V / V) PBS 15 mL로 추가 (V / V). </li><li> 부드럽게 믹스냉동에 적합한 튜브에 1 ㎖의 분량 씩 배포 할 수 있습니다. -80 ° C에서 보관 (한 많은 약 50 분취 글리세롤 주식을 제공합니다). </li><li> 글리세롤 주식을 정량화하기 위해, 동결 후 글리세롤에게 일을 해동하고 PBS 900 μl를 포함하는 별도의 1.5 ml의 튜브에 일곱 10 배 연속 희석을 수행합니다. </li><li> 플레이트 55 mm 직경 배양 접시에서 제조 된 ADC 10 % (v / v)의 보충 7H10 고체 한천 배지 (10)의 각 희석액 100 ㎕. </li><li> 조심스럽게 3mm 직경의 유리 구슬 (접시 당 약. 10)를 추가하고 부드럽게 동등하게 한천 접시 위에 볼륨을 배포 판을 흔들어. 구슬을 취소하고 파라 필름으로 한천 플레이트를 밀봉. </li><li> 37 ° C 21 일 동안 품어 단일 콜로니를 정확하게 구별 할 수있는 희석에 집락 형성 단위를 (CFU)를 계산하여 세균 농도를 결정한다. </li></ol> 2. 마우스 예방 접종 <ol><li> 사전 정량 BCG 글리세롤을 해동하고 사전에 PBS에 희석이 현탁액이다. 동물 당 투여 량을 고려하여 최종 부피를 계산하는 것은 피하 투여 100 μL (피하 접종 ml의 당 107 CFU) 및 비강 내 투여 (비강 예방 접종에 대해 2.5 × 10 7 CFU) 40 μL이다. </li><li> 이소 플루 란과 산소의 혼합물로 쥐를 마취하는 설치류에 대한 전문 마취 워크 스테이션을 사용합니다. 마취 챔버 내에 마우스를 유지하는 마취 2 % 이소 플루 란을 유도하는 5 %를 사용한다. (기타 수락 마취 방법이 사용될 수있다). </li><li> 피하 백신 투여에 세균 현탁액 (107 CFU / ㎖) 1 ㎖의 26 G 바늘을 1 mL를 주사기를 채운다. 공기 방울을 제거합니다. </li><li> 층류 후드 내부에 발생하기 쉬운 위치에 평평한 표면에 마취 마우스를 놓고 마우스의 측면에 피하에게 백신 100 ㎕ (106 CFU / 복용량을) 다시 접종. 케이지에 마우스를 반환하고 prope 수 있도록 그것을 모니터RLY는 마취에서 회복. </li><li> 각 마우스 행정부 사이의 주사기 바늘을 변경합니다. 상술 한 바와 같이 기포를 제거했다. </li><li> 비강 내 투여의 경우, 후드 안쪽에 누운 자세에서 마취 마우스를 놓습니다. </li><li> 마이크로 피펫으로 2.5 × 107 CFU / ㎖로 현탁액의 20 μl를 가져 가라. 마우스의 볼륨을 숨을 쉴 수 있도록 방울 사이의 시간을두고 접종 드롭하여 드롭 전체 볼륨이 입금 될 때까지 두 개의 콧 구멍 사이에 배치 참고 :. 마우스는이 절차를 수행하는 동안 호흡 곤란으로 고생 할 수 있습니다 그들이에 남아 있어야하므로 가급적으로 방지하기 위해 다음 중 하나를 관리하다 전에 각 드롭 동화. </li><li> 또 다른 20 μL와 마이크로 피펫을 재 작성하고 작업을 반복합니다. 마우스가 첫 번째 접종 후 마취에서 깨어 시작되면, 이전에 두 번째로 마취 실에 넣습니다. 케이지에 마우스를 반환하고 올바르게 복구되었는지 확인마취에서. </li></ol> H37Rv 스트레인 3. 마우스 비강 도전 <ol><li> 미리 정량 H37Rv 글리세롤을 해동하고 ㎖의 당 2,500 CFU의 세균 현탁액을 준비하기 위해 PBS에 희석. 동물 당 투여 량을 고려하여 최종 부피를 계산하면 40 μL이다. </li><li> 2.5에 설명 된대로 H37Rv는 비강 접종 - 2.7. 마우스 당 최종 도전 선량이 10 CFU / 40 μL이다. </li></ol> 폐에서 유도 된 면역 반응 4. 분석 <ol><li> 폐 세포 현탁액 주 : 폐 백신 유발 적응성 면역 반응의 평가는 단일 세포 현탁액의 생성을 필요로한다. 이를 위해, 우리는 GentleMACS 티슈 dissociator를 사용한다. <ol><li> 자궁 경부 전위 (또는 다른 승인 된 인도적인 방법)에 의해 마우스를 희생와 마우스가 점멸 반사의 존재를 확인하기 위해 안구에 접촉 죽은 확인합니다. </li><li> 층류 후드 내부에서 L을 추출멸균 가위와 집게를 사용하여 깨끗한 표면에 배치 ungs. 면도 폐 기관지 및 결합 조직을 제거하고 (처리 될 때까지 얼음 상에 유지) PBS로 1.5 ㎖의 튜브에 폐를 옮긴다. </li><li> pH가 7.4, 150 mM의 NaCl을, 5 밀리미터의 KCl, 1 mM의의 MgCl 2, 1.8 mM의 CaCl2를 10 mM의 HEPES-NaOH를 5 mL를 함유 기관 해리 (C-dissociator 튜브)에 대한 적절한 튜브에 폐를 배치, 휴대 정지를 생성하려면 완충기. </li><li> 콜라게나 D 100 ㎎ / ㎖ 100 ㎕ (2 ㎎ / ㎖ 최종 농도)과의 DNase I 20,000 IU / ㎖의 40 μl를 (160 IU / ml의 최종 농도를 추가합니다. 주 : 콜라게나 D 또는 DNaseI의 스톡 솔루션은 각각이 1 ㎜ (V / V), 20 mM 트리스 - 염산 pH를 7.5의 Y의 MgCl 동결 PBS 효소 또는 글리세롤 50 % 용해 제조된다. </li><li> 조직 dissociator에 튜브를 놓고 폐 조각에 대해 사전 정의 된 프로그램 m_lung_01를 사용합니다. 30 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 인큐베이션 튜브. </li><li> 장소 일전자 상기 dissociator 튜브 및 단일 세포 현탁액에 완전한 폐 균질화에 대해 사전 정의 된 프로그램 m_lung_02를 사용합니다. </li><li> 50 mL의 원심 분리 튜브에 장착 된 70 ㎛의 나일론 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액을 통과한다. RPMI 1640 배지 10 ㎖로 스트레이너 씻으십시오. </li><li> 원심 분리기 세포 400 XG에 5 분간 및 상층 액을 버린다. </li><li> 버퍼를 용균 적혈구의 1 ML을 추가 텍싱하여 혼합하고 실온에서 1 분 동안 품어. </li><li> 400 X g에서 5 분 동안 RPMI 1640 배지 및 원심 분리기 세포의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 완전 RPMI 1640 배지에 0.5 ㎖ 중의 재현 탁 된 세포를 10 % 열 - 불 활성화 된 태아 송아지 혈청 (FCS), 2 mM의 L 글루타민, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 100 IU / ㎖ 페니실린, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올을 첨가. 주 : FCS 30 분 동안 56 ℃에서 배양하여 비활성화된다. </li><li> 세포를 카운트 10 7 세포 / ml의 최종 세포 밀도에 도달하는 전체 RPMI에게 1640 배지를 추가합니다. 주 : 세포 수를 들어, 우리는 자동 세포 계수기를 사용한다. </li><li> U-바닥 96 웰 멸균 접시에 세포 현탁액을 100 μl를 배포 (10 6 세포 / 웰). </li><li> 상업 H37Rv 정제 된 단백질 유도체 15 ㎍ / ㎖ (PPD) (5 μg의 / ml의 최종 농도)로 전체 RPMI 1640 배지의 잘 50 μL /를 추가합니다. </li></ol></li><li> ELISA에 의해 사이토 카인 결정을위한 뜨는 수집 <ol><li> 4.1.14에서 37 ° C에서 48 시간 5 % CO 2 판을 품어. </li><li> 5 400 XG에 분, 상층 액 100 ㎕를 복구하기위한 원심 분리기 판. </li><li> -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 각각 IFNγ에 대한 분석 버퍼와 IL17A 결정에 상층 액을 1/10 및 1/2 희석. 제조업체 지침 (ELISA 개발 키트)에 따라, 상업 EL​​ISA 키트와 사이토 카인 농도를 결정합니다. </li></ol></li><li> 사이토 카인의 결정에 대한 세포 내 얼룩유동 세포 계측법에 의해 CD4 + 세포 -producing <ol><li> 4.1.14에서 37 ° C에서 18 시간 5 % CO 2 판을 품어. </li><li> 각 웰 (10 μg의 / ml의 최종 농도)에 Brefeldin 1 ㎎ / ㎖ (DMSO에 용해 주)의 1.5 μl를 추가 여섯 추가 시간 동안 배양한다. </li><li> 3200 XG에서 1 분 동안 4.3.2에서 접시를 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 10 % FCS (1/500)를 RPMI 1640에 희석 항 - 마우스 CD4-FITC의 50 μL와에 재현 탁 세포를 4 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> , 3,200 XG에서 1 분 동안 4.3.4에서 접시를 원심 분리기 뜨는을 버리고 100 μL / 웰의 고정 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 20 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> permeabilization 용액 150 μL / 워시로 두 번 세포를 씻으십시오. 참고 : 10 배 농축 재고 1X 작업 용액을 제조 탈 이온수로 희석한다. </li><li> 안티 마우스 IFNγ-APC 및 항 - 마우스 IL17A - APC.Cy7의 50 μL에 재현 탁 세포는 permeabil에 희석화 용액 (1/250 모두 항체). </li><li> 실온에서 1 시간 동안 품어. </li><li> permeabilization 용액 150 μL / 워시로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 유동 세포 계측법 획득을위한 PBS 200 μL에 재현 탁 된 세포. </li></ol></li></ol> 기관지 폐포 세척에서 면역 글로불린 5. 분석 (BAL) <ol><li> BAL 샘플 획득 <ol><li> 자궁 경부 전위 (또는 다른 승인 된 인도적인 방법)에 의해 마우스를 희생와 마우스가 점멸 반사의 존재를 확인하기 위해 안구에 접촉 죽은 확인합니다. </li><li> 확인 완전히 절제하지 않도록하고, 적절한 정밀 멸균 집게와 가위를 사용하여 기관을 노출하고기도에 작은 상처를 수행합니다. BAL 샘플을 오염시킬 수있는 출혈을 일으킬 않도록주의하십시오. </li><li> 기관에 얼음처럼 차가운 PBS 800 μL와 멸균 1 ML의 주사기에 연결된 정맥을 소개합니다. </li><li> PBS를 폐하고 연구에 천천히 접종폐 붕괴를 방지하기 위해 매우 느리게 주사기의 피스톤을 후퇴 Ecover 주방 BAL 볼륨. 참고 : (500) 600 μL의 복구 만족입니다. </li><li> 1.5 ML 튜브에 BAL 볼륨을 전송하고 그 혈액 (처리까지 얼음에 유지)에 오염되지 않은 나타내는, BAL은 채색 유지 확인합니다. </li><li> 새로운 튜브에 5 400 XG에 분 및 전송 상등액을위한 원심 분리기 BAL 샘플. </li><li> -80 ° C에서 보관 상층 액. </li></ol></li><li> BAL 상층 액에서의 IgA의 결정 참고 : 사용 된 모든 시약은 RT에 있습니다. <ol><li> M. (10 μg의 / ㎖) PBS에 희석 PPD 100 ㎕와 코트 고 단백질 결합 폴리스티렌 평면 바닥 96 웰 플레이트 결핵 - 특정의 IgA 결정, 또는 전체의 IgA 결정을 위해 PBS에 10 배 희석 BAL의 상층 액 100 ㎕와. </li><li> 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> 뜨는을 취소하고 D에 종이 타월에 접시를 누릅니다공예. 200 μL / PBS 잘 씻으시오. </li><li> 200 μL / 웰의 소 혈청 알부민 (BSA) PBS-트윈 80, 0.05 % (부피 / 부피) (블로킹 완충액) (V / w) 1 %로 차단. </li><li> 실온에서 1 시간을 품어. </li><li> 200 μL / PBS-트윈 80 0.05 % (v / v)의 (세척 버퍼) 잘 한 번 씻으십시오. </li><li> PPD를 코팅 우물에 희석 BAL의 상층 액 100 μl를 추가합니다. 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션. 참고 : 전체의 IgA 결정은 PPD 별의 IgA와 병렬로 수행 할 경우,이 배양 동안 100 μL 세척 버퍼 전체의 IgA 우물을 둡니다. </li><li> 세척 buffer.0170004 200 μL / 웰로 3 회 세척 </li><li> 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)의 100 μl를 추가 버퍼 (1 / 10,000) 차단에 희석 항 - 마우스의 IgA를 π 공역 계. </li><li> 1 시간 RT를 품어. </li><li> 세척 완충액 200 μL / 웰로 5 회를 씻으십시오. </li><li> 3,3 100 ㎕ / 웰 추가 &#39;, 5,5&#39;- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB). t 실온에서 20 분 인큐베이션그는 어두운. </li><li> 100 μL / 웰의 H 2 SO 4 0.5N를 추가합니다. 파장 450 nm에서 분광 광도계 플레이트를 읽었다. </li></ol></li></ol> 폐 6. 세균 부하 결정 <ol><li> 폐 균질화 및 도금 <ol><li> 네 주 공격 후, 자궁 경부 전위 (또는 다른 승인 된 인도적인 방법)에 의해 마우스를 희생와 마우스가 점멸 반사의 존재를 확인하기 위해 안구에 접촉 죽은 확인합니다. </li><li> 층류 후드 내부의 평면 및 소독 표면에 고정 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. </li><li> 절개를 확인하고 흉부 영역을 볼 수 떠날 가슴 영역에서 피부를 제거합니다. </li><li> 갈비뼈를 잘라 멸균 가위와 집게를 사용하여 폐와 심장을 수확. 깨끗한 표면에 장기를 놓습니다. </li><li> 심장, 기관지 및 결합 조직을 제거하여 폐를 청소하고 1 ㎖ 탈 이온수에 1.5 ㎖의 튜브에 폐를 전송할(처리 될 때까지 얼음에 유지). </li><li> 탈 이온수 1 ml를 포함, - (dissociator 튜브 M) 장기 균질화에 대한 적절한 튜브에 각 마우스의 폐를 전송하는 멸균 집게를 사용합니다. </li><li> 조직 dissociator에 튜브를 놓고 폐를 균질화하는 미리 정의 된 프로그램 RNA_1를 사용합니다. </li><li> 900 μL에 희석 폐 균질 100 ㎕를 시작으로 1.5 ml의 튜브에 5 ~ 10 배 연속 희석을 확인합니다. </li><li> 플레이트 희석은 1.11-1.14에 설명 된대로. </li></ol></li><li> PCR에 의해 BCG와 H37Rv 사이의 차별화 참고 : 비강 내 경로에 의해 BCG 접종 그룹에 해당하는 6.1.6에서 판에서, 우리는 CFU가 백신 수여 예방 효과가 맞습니다 평가로 간주하도록 BCG와 H37Rv 사이의 안목 PCR에 의해 식민지의 대표 번호를 분석 고유 H37Rv합니다. RD9이 PCR 표적 증폭, BCG와 M. 너와 다른 게놈 영역berculosis, H37Rv에 대한 2618 bp의 및 BCG (11)에 대한 465 염기쌍의 단편을 제공. <ol><li> PCR 튜브에 (9 μL / 샘플)을 배포 한 후 표시로 샘플 당 볼륨이있는 모든 샘플에 대한 마스터 믹스 재고를 준비합니다. 참고 : 버퍼 5 배 : 2 μL. 앞으로 프라이머 25 μM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC) : Taq 중합 효소에게, μl의 5 단위 / 0.32 μL : 0.32 μL는 프라이머 25 μM (GCCCAACAGCTCGACATC)를 역 0.04 μL, 탈 H 2 O : 6.32 μl를. </li><li> 멸균 된 이쑤시개로 콜로니를 터치 마스터 믹스를 함유하는 PCR 튜브에 샘플 이쑤시개 젖어. </li><li> 다음 프로그램으로 PCR을 실행 : 10 분 ~ 95 ° C (이 단계는 박테리아 중단을 유발하는 것입니다), 10 분, 95 ° C, 1 분, 95 ° C에서 35주기 (30 초 (이 단계는 박테리아 혼란을 유발하는 것입니다) 58 ° C와 4 분 72 ° C에서)에서. </li><li> 단편을 시각화 티듐 브로마이드 실행 샘플을 1 % 아가 로스 겔에서 PCR 샘플을로드. </l난&gt; </ol></li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+enhances+vaccine-induced+protection+against+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice.">Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> PLoS One. 8 (10), e78312 (2013).</li><li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+Th17+cells+in+Peyer's+patches+is+responsible+for+the+induction+of+T+cell-dependent+IgA+responses.">Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses.</a> Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).</li><li>Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+lung+mucosal+Th17-mediated+responses+induce+polymeric+Ig+receptor+expression+by+the+airway+epithelium+and+elevate+secretory+IgA+levels.">Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels.</a> J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Although current vaccine against tuberculosis, BCG, is the most widely administered vaccine in history, tuberculosis remains one of the leading causes of death and morbidity from infectious diseases worldwide. This paradox is explained by the lack of protection of this vaccine against pulmonary tuberculosis, the responsible form of transmission. New vaccination approaches effective against pulmonary forms of the disease are urgently needed, as they would have the greatest impact on disease transmission globally.
<p c...

결핵 (TB)는 TB 놀라운 세계 보건 문제 일 수 있습니다 세계에서 HIV보다 더 많은 관련 사망의 원인이되는 주요 감염 질환 중 하나 다 약제 내성 균주의 증가 증가와 결합이다. 새로운 진단 도구,보다 효과적이고 독성이 적은 약물, 새로운 안전하고 효과적인 결핵 백신은 특히 개발 도상국에서, 긴급한 필요하다. 감쇠 Bacille 칼 메트 - GUERIN은 (BCG)은 현재 전 세계적으로 1970 년대 이후 출생시 피내 투여 된 TB, 대한 전용 허가 백신 살고있다. BCG는 아이들의 질환 (수막염 및 속 립성 결핵)의 심한 형태의 예방에 효과적인 것으로 간주되지만, 질병 전파 (2)의 책임 폐결핵에 대한 일관성 효과를 보여 주었다. TB 감염의 자연 경로를 모방 폐 예방 접종은 로컬 호스트 면역 반응을 프라이밍위한 매력적인 접근 방식을 나타냅니다에스. 피하 또는 피내 경로 3-6에 비해 이와 관련하여, 다른 관련 TB의 동물 모델에서 다양한 전임상 작품 폐 면역화 다음 큰 백신 효능을 보여 주었다. 그럼에도 불구하고, 폐 예방 접종에 의해 유발 보호 메커니즘은 잘 이해되지 않습니다. 지난 몇 년 동안, 여러 작품 IL17 점막 백신에 의한 예방 효과에 대한 결핍 된 마우스 모델에서와 같이, TB-특정 점막 면역 반응의 중요한 요소로 IL17 중재 응답으로 지적은 7,8를 손상된다. 최근에 우리는 BCG 관리는 DBA / 2 마우스, 피하 BCG 예방 접종 9 후 보호의 부족을 특징으로하는 마우스 변형을 보호 비강 처음으로 보여 주었다. 이러한 결과는 호흡기 결핵 예방 접종은 피내 BCG가 pulmon에 대한 효과로 간주됩니다 발병 국가에서 TB의 비율을 감소 시키는데 더 효과적 일 수 있다고 제안진 TB.

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9 broth</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Enrichment</td><td>BD</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Scharlau</td><td>TW00800250</td><td></td></tr><tr><td>3-mm diameter Glass Beads</td><td>Scharlau</td><td>038-138003</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm</td><td>BD</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>C tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>M tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Applichem</td><td>A3778,0100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x concentrated</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100x concentrated</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter</td><td>Millipore</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Scepter Cell Counter Sensors, 40 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>PHCC40050</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD</td><td>Statens Serum Institut (SSI)</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IFN-&amp;gamma; ELISA development kit&amp;nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3321-1H</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL17A ELISA development kit&amp;nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3521-1H</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>BD</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A</td><td>BD</td><td>560821</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-mouse IFNg</td><td>BD</td><td>554413</td><td></td></tr><tr><td>LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4&amp;rdquo;</td><td>UNIMED</td><td>27.134</td><td>Used as trachea cannula for BAL</td></tr><tr><td>high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP</td><td>NUNC</td><td>430341</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, from bovine serum</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgA (&amp;alpha;-chain specific)&amp;minus;Peroxidase antibody</td><td>Sigma</td><td>A4789</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;,5,5&amp;prime;-Tetramethylbenzidine (TMB)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq DNA Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td>The kit Includes Buffer 5x</td></tr></tbody></table>

protective efficacy and pulmonary immune response following subcutaneous and intranasal bcg administration in mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

피하 및 비강 :이 작품은 BCG의 관리의 두 경로의 비교에 대해 설명합니다. 피하 전세계 BCG 현재 임상 경로 인 피내, 비슷하다. 백신의 비내 경로 M.의 감염 천연 경로를 모방하는 것을 목표 목적으로 결핵은 폐에 직접 병원체의 주요 표적 장기를 면역 반응을 유도한다. 그림 1은 다음 워크 플로를 설명?...

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Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

보호 효능 및 폐 면역 반응은 마우스에 피하 및 비강 BCG 관리에 따라

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

protective-efficacy-pulmonary-immune-response-following-subcutaneous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.5K 조회수.  University of Zaragoza. We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

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A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

Mycobacteria의 가능성을 측정하는 기능 전체 혈액 분석은 리포터 - 진 BCG 또는 M. TB (BCG 태그 사용 럭스 / M. TB 럭스)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

연구

면역학 및 감염병학

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of vaccine to lymph nodes where antigen presenting cells can interact with lymphocytes for generation of the wanted immune responses. The strength and the type of immune responses induced also depend on the density or frequency of interactions as well as the microenvironment, especially the content of cytokines. As only a minute fraction of peripherally injected vaccines reaches the lymph nodes, vaccinations of mice and humans were performed by direct injection of vaccine into inguinal lymph nodes, i.e.&#160;intralymphatic injection. In man, the procedure is guided by ultrasound. In mice, a small (5-10 mm) incision is made in the inguinal region of anesthetized animals, the lymph node is localized and immobilized with forceps, and a volume of 10-20 &#956;l of the vaccine is injected under visual control. The incision is closed with a single stitch using surgical sutures. Mice were vaccinated with plasmid DNA, RNA, peptide, protein, particles, and bacteria as well as adjuvants, and strong improvement of immune responses against all type of vaccines was observed. The intralymphatic method of vaccination is especially appropriate in situations where conventional vaccination produces insufficient immunity or where the amount of available vaccine is limited.

Prophylactic and therapeutic vaccination often fails to stimulate strong immune responses due to week drainage of the vaccine to lymph nodes and consequently poor involvement of immune cells. By direct injection of vaccine to lymph nodes, so-called intralymphatic injection, vaccine efficacy can be strongly improved and vaccine doses can be reduced.

마우스의 Intralymphatic 면역 및 예방 접종

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

의학

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석<em&gt; 소 결핵균</em&gt; Bacille 칼 메트 - GUERIN

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for protection against children&#39;s severe TB meningitis and some forms of disseminated TB, but fails to protect against pulmonary TB, which is the most prevalent form of the disease. Promising strategies to improve BCG currently rely either on its transformation with genes encoding immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-specific antigens and/or complementation with genes encoding co-factors that would stimulate antigen presenting cells. Major limitations to these approaches include low efficiency, low stability, and the uncertain level of safety of expression vectors. In this study, we present an alternative approach to vaccine improvement, which consists of BCG complementation with exogenous proteins of interest on the surface of bacteria, rather than transformation with plasmids encoding corresponding genes. First, proteins of interest are expressed in fusion with monomeric avidin in standard E. coli expression systems and then used to decorate the surface of biotinylated BCG. Animal experiments using BCG surface decorated with surrogate ovalbumin antigen demonstrate that the modified bacterium is fully immunogenic and capable of inducing specific T cell responses. Altogether, the data presented here strongly support a novel and efficient method for reshaping the current BCG vaccine that replaces the laborious conventional approach of complementation with exogenous nucleic acids.

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

A novel technique for rapid antigen display on a bacterial surface is presented, which involves surface biotinylation followed by exposure to proteins of interest in fusion with monomeric avidin. Loading BCG with selected antigens successfully improves its immunogenicity, suggesting that surface decoration can replace traditional genetic approaches.

외 인 항 원 비 유전 표면 장식 Avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 진 균 bovis BCG 백신에의 표현

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

인간 T 세포 회수 응답에서 Vivo에서 공부 하는 흡입 물집 프로토콜

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, including metabolites, lipids, proteins, and nucleic acids, several groups have evaluated either the native or recombinant versions of bEVs for their protective potency as subunit vaccine candidates. Unlike native EVs, recombinant EVs are molecularly engineered to contain one or more immunogens of interest. Over the last decade, different groups have explored diverse approaches for generating recombinant bEVs. However, here, we report the design, construction, and enrichment of recombinant mycobacterial EVs (mEVs) in mycobacteria. Towards that, we use Mycobacterium smegmatis (Msm), an avirulent soil mycobacterium as the model system. We first describe the generation and enrichment of native EVs of Msm. Then, we describe the design and construction of recombinant mEVs that contain either mCherry, a red fluorescent reporter protein, or EsxA (Esat-6), a prominent immunogen of Mycobacterium tuberculosis. We achieve this by separately fusing mCherry and EsxA N-termini with the C-terminus of a small Msm protein Cfp-29. Cfp-29 is one of the few abundantly present proteins of MsmEVs. The protocol to generate and enrich recombinant mEVs from Msm remains identical to the generation and enrichment of native EVs of Msm.

This protocol details the enrichment of native mycobacterial extracellular vesicles (mEVs) from axenic cultures of Mycobacterium smegmatis (Msm) and how mCherry (a red fluorescent reporter)-containing recombinant MsmEVs can be designed and enriched. Lastly, it verifies the novel approach with the enrichment of MsmEVs containing the EsxA protein of Mycobacterium tuberculosis.

마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

Micro-CFU 방법을 사용한 결핵 판정 가속화

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic. The disease is caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb). The Mycobacterium bovis strain Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), the only TB vaccine, is the oldest licensed vaccine in the world, still in use. Currently, there are 12 vaccines in clinical trials and dozens of vaccines under pre-clinical development. The method of choice used to assess the efficacy of TB vaccines in pre-clinical studies is the enumeration of bacterial colonies by the colony-forming units (CFU) assay. This time-consuming assay takes 4 to 6 weeks to conclude, requires substantial laboratory and incubator space, has high reagent costs, and is prone to contamination. Here we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), that offers a simple and rapid solution to analyze M.tb vaccine efficacy results. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. Moreover, to evaluate the efficacy of a TB vaccine, samples may be obtained from a variety of sources, including tissues from vaccinated animals infected with Mycobacteria. We also describe an optimized method to produce a unicellular, uniform, and high-quality mycobacterial culture for infection studies. Finally, we propose that these methods should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB.

저자 스포트라이트: 결핵 백신 효능 및 항원 제시 분석의 효율적인 평가를 위한 CFU 결정 최적화 

The determination of colony-forming units (CFU) is the gold-standard technique for quantifying bacteria, including Mycobacterium tuberculosis which can take weeks to form visible colonies. Here we describe a micro-CFU for CFU determination with increased time efficiency, reduced lab space and reagent cost, and scalability to medium and high throughput experiments.

결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

보호 효능 및 폐 면역 반응은 마우스에 피하 및 비강 BCG 관리에 따라

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Mycobacteria의 가능성을 측정하는 기능 전체 혈액 분석은 리포터 - 진 BCG 또는 M. TB (BCG 태그 사용 럭스 / M. TB 럭스)

마우스의 Intralymphatic 면역 및 예방 접종

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석

외 인 항 원 비 유전 표면 장식 Avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 진 균 bovis BCG 백신에의 표현

인간 T 세포 회수 응답에서 Vivo에서 공부 하는 흡입 물집 프로토콜

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축

결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay

결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay