저자는 사진을 찍는 그들의 도움 마린 마누엘과 올리비아 골드만-Szwajkajzer 감사합니다. 저자는 또한 원고를 교정하기위한 아르 준 Masukar과 토비아스 복을 주셔서 감사합니다. 금융 지원은 라 공들인 (HYPER-국방부, ANR-2010 BLAN-1429-01)을 부어 직원은 국립 제공 한은 NIH - NINDS (R01NS077863)의 티에리 Latran 재단 (OHEX 프로젝트), 근육 병증에 대한 프랑스 협회 ( 승인 번호 16026) 및 대상 ALS는 기꺼이 인정한다. 펠릭스 리로이는 고등 사범 학교, Cachan의에서 &quot;Contrat 박사&quot;의받는 사람이었다.

실험은 유럽 지침 (609분의 86 / CEE 및 2010-63-UE)과 프랑스 법률에 따라 수행하고, 파리 데카르트 대학 윤리위원회에 의해 승인되었다. 1. 척수 조각 준비 <ol><li> 다음 매일 용액 또는 사전에 일일를 준비합니다. 밤새 보관하는 경우, 95 % O 2 5 % CO 2와 거품과는 밀폐 병에 냉장 보관하십시오. <ol><li> 저 나트륨 인공 뇌척수액 (ACSF) + 준비 : 3 밀리미터의 KCl을 1 ㎜의 NaH 2 PO 4, 230 mM의 수크로오스, 26 mM의 NaHCO3을 0.8 mM의 CaCl2를 8mm로의 MgCl 2, 25 mM의 글루코스, 0.4 mM의 아스코르브 산, 1 ㎜ 나 - kynurenate, 2 mM의 나트륨 - 피루브산. 95 % O 2, 5 % CO 2 (PH 7.4)와 거품. 나-kynurenate 자주 용해하기 어려운 때문에, 재료 표에 나열된 하나를 구입해야합니다. </li><li> K-글루코 네이트 SOLU 준비기 : KOH으로 pH 7.4으로 조정 된 130 mM의 K 글루코 네이트, 15 mM의 KCl을 0.05 mM의 EGTA, 20 mM의 HEPES, 25 mM의 글루코스, 1 mM의 나트륨 - kynurenate, 2 mM의 피루브산 나트륨 -. </li><li> ACSF 준비 : 130 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 KCl을, 2 mM의 CaCl2를, 1 ㎜의 MgCl 2, 1 ㎜의 NaH 2 PO 4, 26 mM의 NaHCO3을 25 mM의 글루코스, 0.4 mM의 아스코르브 산, 2 mM의 나트륨 피루 베이트. 95 % O 2, 5 % CO 2 (PH 7.4)와 거품. </li><li> 절개의 시작에 앞서, K 글루코 네이트 용액 80 ㎖에 2 % 한천을 용해하고, 60 ° C로 보온. </li></ol></li><li> 심장 내 관류 <ol><li> 시대에 P2에서 P11에 이르기까지, 여성과 남성 쥐에이 준비를 수행합니다. </li><li> 25 mM의 나트륨 펜토 바르 비탈 (50 ㎎ / ㎏) 0.1 ㎖를 복강 내 주사하여 마우스를 마취. </li><li> 바늘 또는 테이프를 사용하여, 실리콘 가득 큰 페트리 접시의 뒷면에 마우스를 고정. 해부 현미경을 사용하여해부의 나머지 부분에 대한 전자. </li><li> 흉골의 끝을 잡고 가슴을 들어 올려 미세 가위를 사용하여 조리개를 잘라. 그런 마음을 노출 갈비뼈를 절단하여 양쪽 가슴을 엽니 다. </li><li> 27G 바늘과 좌심실을 천공하기 전에 우심방을 잘라. </li><li> 얼음처럼 차가운 낮은 나 +의 ACSF와 관류. 30 초 후, 낮은 나 + ACSF는 아트리움에서 흐르는 볼 수 있습니다. 나트륨의 낮은 양의 급상승로부터 세포를 방지하고 해부하는 동안 세포 죽음을 줄일 수 있습니다. </li><li> 혈액이 배출 될 때 간은 노란색으로 변할 때까지 해부 현미경으로 심장에 바늘을 들고 보관하십시오. </li></ol></li><li> 척수의 해부 <ol><li> 동물의 목을 벨과 그 뱃속에 넣어. </li><li> 빨리 다시 (그림 1A1)의 피부를 제거합니다. 두 컷 어깨 통해 가슴 케이지 (그림 1A2)을 추락합니다. 그런 리터로 코드를 잘라동물의 아래쪽에서 리브의 시작하여 척추를 분리하기 위해 꼬리 섹션 가능한 흐름. 다시 동물 플립 여전히 갈비뼈에 붙어있는 내장을 제거합니다. </li><li> , 다른 척추 열을 이동시켜 작은 실리콘 가득한 페트리 접시과 지느러미 사이드 (그림 1A)를 누르고 4 곤충 핀을 사용합니다. </li><li> 지느러미 측의 추궁 절제술을 수행하고 주동이의 끝 (그림 1B)에서 척수를 노출하는 동안 지속적으로 (약 4 ° C에서) carbogen - 버블 ACSF와 동물을 관류. 이렇게하려면 뼈와 척수 사이의 미세 가위의 끝을 삽입하고 백질 멀리해야하고, 주동이의 끝에서 조금씩 뼈를 잘라. 각면에 다른 뼈의 대역 이미 절단 (그림 1B1)를 멀리 유지하기 위해 핀셋을 사용하는 동안. </li><li> 가장 작은 가능한 스프링 가위와 핀셋을 사용하여, 경질을 들어 올려 컷가위로 척수 손상을 방지하기 위해 양쪽에 경질의 느슨한 부분을 잡고있다. rostro - 꼬리 축을 따라 잘라. 참고 : 두라는 반 투명 연속 막이다 이 나이에 피아 교인이 너무 허약하고 해부와 슬라이스 (그림 1B2) 동안 떨어져 올 것이다. </li><li> 경질 제거 사용되면 무딘 유리 또는 플라스틱 팁 부드럽게 하프 컷 척주에 의해 형성된 홈의 왼쪽에있는 코드를 밀어 입쪽 측부터 우측 복부와 등쪽 뿌리 잘라 그들은 (적어도 몇 mm, 그림 1B2) 코드를 입력 곳에서 멀리. </li><li> 항상 입쪽에서 꼬리로 이동, 왼쪽의 동작을 반복한다. 왼손잡이 경우, 왼쪽에서 시작하여 오른쪽으로 이동합니다. </li></ol></li><li> 한천에 포함 <ol><li> 척주에서 코드를 슬립. 아래 핀 작은 곤충 핀을 사용하여지느러미와 코드가 최대 표면과 섬세 멤브레인의 조각 여전히 부착 (그림 1C1)을 제거합니다. </li><li> 정리하면, 양쪽 끝 (그림 1C2)을 트림. 코드를 조작하고 방향을주의해야 할 코드의 앞쪽 부분에 굽 곤충 핀을 삽입합니다 (그림 1C2에 화살표). 이어서 빙냉 K 글루코 네이트 용액에 척수 옮긴다. 참고 :이 솔루션은 CSF의 세포 내 성분을 모방와의 motoneurons (26)을 절단됩니다되면 삼투압 충격의 죽어가는 세포를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 척수는 세포 내 솔루션 내에서되면, 건조 화장실에서 한천로 비커를 타고 얼음과 물의 혼합물에 식혀. </li><li> 온도를 측정하는 동안 교반하십시오. 온도가 38 °에 도달하면 곤충 핀을 잡고, 척수 젖어 아래로 주동이의 측면을 배치 C. 척수가 성으로되어 있는지 확인raight 가능한 한 멀리 꼬리 부분, 벽에서 약간 위쪽 (그림 1D1). </li><li> 한천은 가능한 한 빨리 응고 할 수 있도록 얼음과 물의 혼합물에서 비커를 남겨주세요. 확인이 코드가 가능합니다 (그림 1D1)만큼 직선으로되어 장소에 유지하고 확인합니다. </li></ol></li><li> 슬라이스 <ol><li> 응고 후, (도 1D2의 화살표) 블록의베이스 코드의 요부와 35 °의 각도로되는 방식으로 척수를 포함하는 한천 블록을 잘라. 등쪽면은베이스 (그림 1D2)에서 멀리 직면해야한다. 참고 :이에서 나오는 복부 뿌리에 motoneuron 풀의 연속성을 유지하기위한 절차의 중요한 단계이다. </li><li> 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 vibratome의 챔버로 블록을 붙인다. K-글루코 네이트 용액에 담가 및 유지 관리 slushed 냉동 K-글루코 네이트 솔루션을 추가목욕 (2 ℃ 이하) 냉장. </li><li> (곡률과 큰 직경에 의해 식별) 요추 영역의 400 μm의 두께 슬라이스 - 350 컷. 적절한 방향 (1.4.1를 참조하십시오.)에서 복부 표면에 지느러미로부터 절단 및 조각 지속적으로 더 주동이를 만들기 위해 블레이드를 사용합니다. 일반적으로 2 mm 이상 연장 복부 뿌리를 가진 4-5 적합한 조각이있다. 10 ° 각도, 70 Hz의 진동 주파수와 슬라이스의 10mm / 분 속도 : 다음 매개 변수를 사용합니다. </li></ol></li><li> 잠복 <ol><li> 34 ° C에서 ACSF에 조각을 전송합니다. 약 30 분 후, RT까지 냉각 슬라이스와 기록 세션을 시작한다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> 그림 1. 해부 A1 :. 지느러미 열을 노출 뒤의 피부를 제거 A2 :. 어깨와 갈비뼈 절단는 등의 열 B1을 확보하기 : 실리콘 채워진 페트리 접시에 고정 된 척추 열 (최대 지느러미 쪽, 왼쪽 꼬리 쪽) B2 :. 노출 해부 척수와 같은 C1을 :. 척수 고립 . (주동이의 측면 왼쪽) C2 : 삽입 할 준비가 척수 (최대 복부 측면, 왼쪽 주동이의 측면). 주동이의 측면에 작은 곤충 핀을 참고 D1 :.. 한천 비커에서 척수 (주동이의 측면 다우, 바닥을 향하도록 복부 측면) D2 : 내장 척수와 컷 한천 블록. 35 ° 각도를 블록의베이스와 요추 확대 (화살표)와 척수 양식을합니다. 스케일 바 1cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. 상공 회의소에 슬라이스를 배치 참고 : 쉬게ntral 뿌리는 가변 크기입니다. <ol><li> (40)에서 사전에 170 μm의에 이르기까지 다양한 팁 직경 다양한 피펫의 상자를 준비합니다. 흡입 피펫을 준비 긴 테이퍼 많은 피펫을 준비합니다. 다이아몬드 나이프를 사용하여, 서로 다른 위치에 상처를 만든다. 그 다음 해부 현미경, 핀셋 팁을 타격하여 휴식. </li><li> 기록 현미경에서 실을 제거하고 해부 현미경으로 배치합니다. </li><li> 흡입 자극 전극에 장착 될 수있는 충분한 길이 (2 mm 이상)의 복부 루트를 포함하는 슬라이스를 선택한다. 복부 뿌리 슬라이스 상향 (그림 2A)의 올바른 방향을 선택하고 조각 (그림 2B) 주변의 한천의 나머지 부분을 남기면서 섬세 복부 뿌리 주변의 한천을 잘라. 참고 : 한천이 조각보다 더 확고하기 때문에,이 조각의 앵커의 스레드가 한천보다는 이렇게 슬라이스하고 A에 휴식을 할 수 있습니다nchor는 조직을 손상하지 않습니다. 슬라이스의 앵커의 스레드 (그림 2c에 빨간색으로 표시) motoneuron 풀 위에 있는지 확인합니다. </li><li> 현미경에 백 챔버를 탑재하고 연속적 일의 속도로 ACSF 기록 챔버를 관류 - RT에서 2 ㎖ / 분. 유리 피펫 ACSF 채우고 주사기에 연결을 사용하여, 복부 루트 (도 2c에서 화살표) 중 하나를 흡인. 복부 루트 좋은 자극을 달성하기 위해, 피펫 팁을 복부 주위 루트 빡빡 할 필요가있다. 하나의 기둥은 자극 전극 (패치 클램핑 전극에 연결된 레퍼런스 또는) 욕 중에서 다른 하나이어야한다. </li><li> 목적하는 세포 유형의 패치 클램프 기록을 달성하고 10 previsouly 바와 같이 복부 루트 자극의 효과를 기록한다. <ol><li> 여기서, 데이터 수집을위한 증폭기를 사용한다. 3 kHz에서 전체 셀 녹음을 필터링합니다. 10 kHz에서 디지털화. curre 다리 저항을 보정NT-클램프 모드. </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> 그림 2. 복부 루트 준비 A : 복부 루트가 위를 향 한천에 포함 된 요추 척수 조각 B :.. 한천 C에서 해방 복부 뿌리와 요추 척수 조각 : 단단히 (화살표) 복부 뿌리 주위에 배치 자극 전극과 요추 척수 조각 . 마우스 기자 R26 톰 (17). 스케일 바 1mm로 교차 chrna2-Cre 호텔 마우스 (28)의 적색 형광을 발현하는 렌쇼 세포의 위치를 확인합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<ol>
	<li>Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After-potentials+and+excitability+of+spinal+motoneurones+following+antidromic+activation.">After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation.</a> J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).</li><li>Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+electrophysiological+abnormalities+in+lumbar+motoneurons+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).</li><li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+currents+in+visually+identified+motoneurones+of+neonatal+rat+spinal+cord.">Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord.</a> J Physiol. 423, 27-46 (1990).</li><li>Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+activity+of+rat+spinal+cord+motoneurons+in+slices.">Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices.</a> J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).</li><li>Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventrolateral+origin+of+each+cycle+of+rhythmic+activity+generated+by+the+spinal+cord+of+the+chick+embryo.">Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo.</a> PLoS One. 2 (5), e417 (2007).</li><li>Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+monosynaptic+contacts+between+type-identified+alpha-motoneurons+in+the+cat.">Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat.</a> Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).</li><li>Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+direct+synaptic+interconnections+between+cat+spinal+alpha-motoneurons+via+the+recurrent+axon+collaterals:+a+morphological+study+using+intracellular+injection+of+horseradish+peroxidase.">Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase.</a> Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).</li><li>Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+excitatory+interactions+between+spinal+motoneurones+of+the+cat.">Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat.</a> J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).</li><li>Ichinose, T., Miyata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+excitation+of+motoneurons+in+the+isolated+spinal+cord+of+newborn+rats+detected+by+whole-cell+recording.">Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording.</a> Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+excitatory+postsynaptic+ionotropic+receptors+coactivated+at+the+motoneuron-Renshaw+cell+synapse.">Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+effects+of+centripetal+impulses+in+axons+of+spinal+ventral+roots.">Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots.</a> J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+as+a+mechanism+in+central+inhibition.">Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition.</a> Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+and+on+the+nature+of+central+inhibition).">Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition).</a> Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).</li><li>Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+excitability+changes+in+lumbar+motoneurons+of+transgenic+SOD1G85R+and+SOD1G(93A-Low)+mice.">Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice.</a> J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).</li><li>Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+postnatal+maturation+of+electrical+properties+in+spinal+motoneurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).</li><li>Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+alteration+of+motoneuronal+morphology+induces+hyperexcitability+in+the+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).</li><li>Hadzipasic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+degeneration+of+a+physiological+subtype+of+spinal+motor+neuron+in+mice+with+SOD1-linked+ALS.">Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li><li>Manuel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li><li>Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+motoneuron+firing+by+recurrent+inhibition+in+the+adult+rat+in+vivo.">Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo.</a> J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+dynamically+set+the+recruitment+and+firing+properties+of+F-type+motoneurons+in+neonatal+mice.">Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice.</a> J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+composition+and+kinetics+of+the+Renshaw+cell+heteromeric+nicotinic+receptors.">Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+shaping+the+slow+nicotinic+synaptic+current+at+the+motoneuron-renshaw+cell+synapse.">Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).</li><li>Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-dependent+use+of+co-released+inhibitory+transmitters+at+central+synapses.">Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses.</a> J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).</li><li>Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+afferent+synapses+on+developing+and+adult+Renshaw+cells.">Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells.</a> J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).</li><li>Perry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firing+properties+of+Renshaw+cells+defined+by+Chrna2+are+modulated+by+hyperpolarizing+and+small+conductance+ion+currents+Ih+and+ISK.">Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK.</a> Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).</li><li>Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+electrical+properties+of+ventral+horn+neurons+in+rat+spinal+cord+slices.">Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices.</a> J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).</li><li>Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electrical+properties+and+prediction+of+motor-unit+type+of+medial+gastrocnemius+motoneurons+in+the+cat.">Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat.</a> J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).</li><li>Cooper, S., Sherington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gower's+tract+and+spinal+border+cells.">Gower's tract and spinal border cells.</a> Brain. 63, 123-124 (1940).</li><li>Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+the+spinothalamic+and+related+tracts.">Experimental study of the spinothalamic and related tracts.</a> Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).</li><li>Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+projections+to+the+cerebellum+in+the+mouse.">Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).</li><li>Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-,+T-,+and+H-type+currents+shape+intrinsic+firing+of+developing+rat+abducens+motoneurons.">A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons.</a> J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).</li><li>Dourado, M., Sargent, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+nicotinic+receptors+underlying+Renshaw+cell+excitation+by+alpha-motor+neurons+in+neonatal+rat+spinal+cord).">Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord).</a> J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).</li><li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse.">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li><li>Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specific+ions+in+glutamate+neurotoxicity.">The role of specific ions in glutamate neurotoxicity.</a> Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

그것은, 신뢰할 수있는 포괄적이고 구체적인 방법으로 하나의 척추 세그먼트에서 motoneuron 풀과 렌쇼 세포의 일방적 인 자극을 허용하기 때문에 척수의 경사 슬라이스가 중요합니다. 또한, 기록의 motoneurons의 빠른 우아하고 비 모호한 식별 할 수 있습니다. 다음으로, 우리는 다른 슬라이스 준비 방법에 비해이 기술의 장점을 강조하며, 우리는이 절차를 수행하는 동안 피할 수있는 가장 일반적인 함...

역사적으로, 날카로운 전극을 사용 motoneuron 녹음은 고양이 나 쥐 1이나 마우스 2에서 격리 된 전체 척수에 큰 동물 생체 내에서 실시 하였다. somas 필요한 밀봉과 motoneuron에 직접 액세스를 요구 1980 년대 패치 클램프 녹음 기술의 출현은, 시각적 인지도하에 달성 될 수있다. 따라서, 척수 슬라이스 제조 용이 1990 세 이후 달성되었다. 그러나, 초기 슬라이스 준비는 종종 복부 뿌리의 자극을 허용하지 않았다. 우리가 아는 한, 두 연구는 가로 조각의 복부 뿌리를 성공적으로 자극을보고, 아무도는 마우스 4,5에서 얻은되지 않았다. motoneuron 풀은 복부 루트를 벗어나지 축삭을 유지하는 - (P11 P2)이 문서에서 우리는 신생아 쥐의 생존 척수 조각을 달성하기 위해 기술을 제시한다. 벤트RAL 루트 자극은 같은 복부 루트에서 배출되는 motoneuron 풀의 somas에 다시 antidromic 활동 전위를 트리거합니다. 또한 motoneuron 담보 타겟 다른 운동 신경원 6-10 및 11-13 렌쇼 세포를 여기. 단지의 motoneurons은 복부 뿌리를 자신의 축삭을 보낼 수 있기 때문에, 우리의 motoneurons (10)를 식별 physiologicaly하는 간단하고 확실한 방법으로 antidromic 활동 전위의 기록을 사용합니다. motoneuron 신원을 확인하기 위해 잠재적으로 비 포함되거나 잘못된 전기 생리 학적 및 criterions에를 사용하는 것 외에도, 척수 운동 신경원에 대한 최근의 연구는 또한 사후 지루하고 시간 소모적 16 염색에 의존. 이러한 식별은 보통 기록 세포 샘플에 대해 수행된다. 다른 식별 전략은 내인성 운동 신경원 형광을 발현하는 마우스 선에 의존 <sup&gt; 17 ~ 19. 이 연구는 이미 유전자 변형 마우스 줄을 사용하여 필요한 경우 마커의 발현은 여전히 ​​변수 또는 그러나 유전자 인코딩 된 마커를 사용하여 젊은 나이에 어려울 수 있습니다. 대안 적으로, antidromic 활동 전위 기록은 셀 기록의 시작에서 모든 마우스에서 일상적으로 수행 될 수있다. 고양이, 쥐와 마우스에서 손상 척수 준비 작업 실험자은 확실하게 1950 년대 1,2,20,21 이후 같은 식별 기술을 사용했다. 최적의 조건에서 우리는 기록의 motoneurons의 거의 모든에서 antidromic 활동 전위를 유도 할 수 있었다. 또한, 복부 루트 자극을 확실하게 다른 운동 신경원 22, 23 또는 이들의 타겟을 자극하기 위해 사용될 수있다. 렌쇼 세포 10,24,25. 우리는 여기에 motoneuron somas antidromic에서 활동 전위 기록 형태 복부 루트 자극의 응용뿐만 아니라 렌쇼 세포의 자극을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>Na-kynurenate</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td><td>dissolves better then other brands</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>sucrose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Quality Biological</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>ascorbic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>Alomone</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>gluconic acid</td><td>Sigma</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Cesium hydroxide solution</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>A-M Systems</td><td>Isolated Pulse Stimulator Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden</td><td>Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

the preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation

척수 조각에서 전기 생리 녹음은 네트워크 속성에 휴대 질문의 넓은 범위를 조사 할 가치있는 기술을 입증했다. 우리는 젊은 쥐 (- P11 P2)의 척수의 가능한 경사 조각을 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 준비에서의 motoneurons은 축삭은 척수의 복부 뿌리에서 나오는 유지한다. 이 축색 돌기의 자극은 척수 내에서 motoneuron의 somas과 흥미로운 motoneuron의 담보 침입 다시 전파 활동 전위를 이끌어. antidromic 활동 전위의 기록은 다른 식별 방법을 능가 motoneuron 정체성을 특성화하기 위해, 즉시 확정하고 우아한 방법입니다. 또한, motoneuron의 담보를 자극하는 기타 운동 신경원 또는 R와 척수 내에서 운동 신경원의 담보 타겟을 자극하는 간단하고 신뢰성있는 방법은세포를 enshaw. 이 프로토콜에서는, 우리는 복부 루트 자극의 결과는 motoneuron somas뿐만 아니라 렌쇼 세포 여기에서 antidromic 녹음을 제시한다.

Antidromic 활동 전위를 사용하여 Motoneuron 정체성의 확인 셀 타겟팅 의 motoneurons은 복부 혼 (그림 2C에 빨간색으로 표시)에서 발견된다. 복부 루트를 형성하는 축삭의 번들에서 시작하고 번들이 완전히 분산과 하나가 (20 μm의 위, 긴 소마 축) 큰 세...

Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation at JoVE.com

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

우리는 젊은 쥐에서 척수의 경사 조각을 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 준비는 복부 뿌리의 자극 수 있습니다.

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

the-preparation-oblique-spinal-cord-slices-for-ventral-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K 조회수.  Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes.  우리는 젊은 쥐에서 척수의 경사 조각을 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 준비는 복부 뿌리의 자극 수 있습니다. 

비디오: The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

장어 Reticulospinal 축삭의 급성 해리는 개별 기능 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 녹음을 활성화하는

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

연구

신경과학

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the development of several animal models of these neuromuscular disorders has provided the scientific community with different therapeutic scenarios aimed at delaying or reversing the progression of these conditions. By taking advantage of the retrograde machinery of neurons, one of these approaches has been to target skeletal muscles in order to shuttle therapeutic genes into corresponding spinal cord motor neurons. Although once promising, the success of such gene delivery approach has been hampered by the sub-optimal number of transduced motor neurons it has so far shown to yield. Motor end plates (MEPs) are highly specialized regions on the skeletal musculature that are in direct synaptic contact to the spinal cord &#945; motor neurons. In this regard, it is important to note that, so far, the efforts to retrogradely transfer genes into motor neurons were made without reference to the location of the MEP region in the targeted muscles. Here, we describe a simple protocol 1) to reveal the exact location of the MEPs on the surface of skeletal muscles and 2) to use this information to guide the intramuscular delivery and subsequent optimal retrograde transport of retrograde tracers into motor neurons. We hope to utilize the results from these tracing experiments in further studies into investigating retrograde transport of therapeutic genes to spinal cord motor neurons through the targeting of MEPs.

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

모터 엔드 플레이트 함께 근육 주사 : 직접 모터 뉴런에 셔틀 트레이서에 대한 최소 침습 접근

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

리듬-액티브의 준비 체 외 신생아 설치류 Brainstem-척수와 얇은 슬라이스

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological characteristics in the intact spinal network and holds significant advantages relative to classical in vitro or extracellular recording techniques. An advantage of in vivo intracellular recordings is that this method can be performed on adult animals with a fully mature nervous system, and therefore many observed physiological mechanisms can be translated to practical applications. In this methodological paper, we describe this procedure combined with externally applied constant current stimulation, which mimics polarization processes occurring within spinal neuronal networks. Trans-spinal direct current stimulation (tsDCS) is an innovative method increasingly used as a neuromodulatory intervention in rehabilitation after various neurological injuries as well as in sports. The influence of tsDCS on the nervous system remains poorly understood and the physiological mechanisms behind its actions are largely unknown. The application of the tsDCS simultaneously with intracellular recordings enables us to directly observe changes of motoneuron membrane properties and characteristics of rhythmic firing in response to the polarization of the spinal neuronal network, which is crucial for the understanding of tsDCS actions. Moreover, when the presented protocol includes the identification of the motoneuron with respect to an innervated muscle and its function (flexor versus extensor) as well as the physiological type (fast versus slow) it provides an opportunity to selectively investigate the influence of tsDCS on identified components of spinal circuitry, which seem to be differently affected by polarization. The presented procedure focuses on surgical preparation for intracellular recordings and stimulation with an emphasis on the steps which are necessary to achieve preparation stability and reproducibility of results. The details of the methodology of the anodal or cathodal tsDCS application are discussed while paying attention to practical and safety issues.

This protocol describes in vivo intracellular recording of rat lumbar motoneurons with simultaneous trans-spinal direct current stimulation. The method enables us to measure membrane properties and to record rhythmic firing of motoneurons before, during and after anodal or cathodal polarization of the spinal cord.

트랜스 척추 직접 전류 자극 중 유형 식별 쥐 척추 운동 신경의 생체 내 세포 내 기록

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an increasingly detailed view of the circuits underpinning spinal pain processing. However, the effects of these connections for broader network activity in the DH remain less well understood because most studies focus on the activity of single neurons and small microcircuits. Alternatively, the use of microelectrode arrays (MEAs), which can monitor electrical activity across many cells, provides high spatial and temporal resolution of neural activity. Here, the use of MEAs with mouse spinal cord slices to study DH activity induced by chemically stimulating DH circuits with 4-aminopyridine (4-AP) is described. The resulting rhythmic activity is restricted to the superficial DH, stable over time, blocked by tetrodotoxin, and can be investigated in different slice orientations. Together, this preparation provides a platform to investigate DH circuit activity in tissue from na&#239;ve animals, animal models of chronic pain, and mice with genetically altered nociceptive function. Furthermore, MEA recordings in 4-AP-stimulated spinal cord slices can be used as a rapid screening tool to assess the capacity of novel antinociceptive compounds to disrupt activity in the spinal cord DH.

The combined use of microelectrode array technology and 4-aminopyridine-induced chemical stimulation for investigating network-level nociceptive activity in the spinal cord dorsal horn is outlined.

마이크로전극 어레이를 이용한 척추 노셉티브 회로에서의 네트워크 활동 기록

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

척수 자극에 대한 운동 뉴런 반응의 이해

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

저자 스포트라이트: Advancing Spinal Cord Stimulation - Exploring the cellular responses of motor neurons through patch-clamp electrophysiology (척수 자극의 발전 - 패치클램프 전기생리학을 통한 운동 뉴런의 세포 반응 탐구) 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

척수 자극 중 운동 뉴런의 전체 세포 패치-클램프 기록을 위한 척수 절편의 생체 외 제조

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

장어 Reticulospinal 축삭의 급성 해리는 개별 기능 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 녹음을 활성화하는

모터 엔드 플레이트 함께 근육 주사 : 직접 모터 뉴런에 셔틀 트레이서에 대한 최소 침습 접근

Zebrafish의

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

리듬-액티브의 준비 체 외 신생아 설치류 Brainstem-척수와 얇은 슬라이스

트랜스 척추 직접 전류 자극 중 유형 식별 쥐 척추 운동 신경의 생체 내 세포 내 기록

생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

마이크로전극 어레이를 이용한 척추 노셉티브 회로에서의 네트워크 활동 기록

척수 자극 중 운동 뉴런의 전체 세포 패치-클램프 기록을 위한 척수 절편의 생체 외 제조

척수 자극 중 운동 뉴런의 전체 세포 패치-클램프 기록을 위한 척수 절편의 생체 외 제조