Name: intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons
Uploaded: 2015-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons at JoVE.com

이 작품은 RM에 국민 건강 및 의료 연구 센터 (NHMRC) 프로젝트 연구비 지원

여기에 설명 된 모든 실험 절차는 UNSW 호주의 동물 관리 및 윤리위원회 준수하고 국민 건강과 동물 실험에 대한 의학 연구위원회 (Medical Research Council) 호주의 규정에 따라 수행되었다. 이 프로토콜의 모든 절차는 적절한 동물 관리 및 윤리위원회의 요구에 따라 수행되어야한다. 1. 아세틸 콜린 에스 테라 제 조직 화학 염색 <ol><li> 아세틸 콜린 에스 테라 제의 반응 혼합물을 제조 <ol><li> 0.1 M 인산 완충액 (PB)에 200 ml의 아세틸 티오 콜린 요오다 이드 290 mg을 추가. 900 rpm에서 교반기로 섞는다. </li><li> 연속 교반 글리신 600 mg을 추가합니다. </li><li> 생성물이 완전히 용해 될 때까지 천천히 교반하면서 연속 반응 액에 황산구리 420 mg을 추가. </li></ol></li><li> 동물 시체의 피부를 제거 절개를하여 (조직의 공유를 통해 얻은)관류 쥐 또는 마우스의 피부, 목 지역으로부터 피부를 잡고 그 다리를지나 당겨에. 각 근육을 덮고있는 근막을 제거하거나 크게 반응 용액에 근육 섬유의 충분한 노출을 보장하기 위해 천공 중 하나입니다 있는지 확인합니다. </li><li> 반응 혼합물에 몸 전체 또는 관심의 다리를 담그고 4 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 증류수에 2 분 동안 시체를 씻으십시오. 주의 :이 단계에서는, 근육 청색 착색 모터 엔드 플레이트 (MEP들)이 하얀 점으로 볼 수있다 나타낸다. </li><li> 3 ~ 5 초 동안 10 % 암모늄 황화물의 용액에 시체를 노출. 참고 : 근육 섬유가 빠르게 갈색으로 바뀝니다과 유럽 의회 의원이 검은 얼룩 점으로 관찰 할 수있을 것입니다. 반응을 너무 빠르게 발생하여, 근육 섬유는 황화 암모늄 용액 (예, 5 %)의 낮은 농도를 사용하여 시도 MEP들 및 근섬유 구분할 너무 어둡게 염색하는 경우. 반응 시간을 얻을유럽​​ 의회 의원과 근육 섬유 사이의 최적의 대비가 하나의 샘플에서 다른 다릅니다. 그러므로 시약 정확한 노출 시간을 정의하는 것은 곤란하다. 반응은 밀접하게 모니터링과 대비가 적절한 것으로 간주 할 때 중지해야합니다. </li><li> 증류수에 교반, 시체 두 번 세척하고 부드럽게 시체 건조 두드려. </li><li> 사진 관심의 모든 근육에 대한 유럽 의회 의원이 캡처되는 것을 보장 사지의 외측과 내측 측면 모두. </li></ol> 2. 근육 주사 모터 엔드 플레이트에서 <ol><li> 마이크로 피펫 풀러와 유리 마이크로 피펫을 당겨 (플런저와 등급 Micropipette과의 사용 권장). 해부 현미경의 도움으로, 마이크로 피펫의 루멘의 내부 직경이 약 0.5 mm가되도록 포셉 쌍 마이크로 피펫의 선단을 깰. </li><li> 사용 된 모든 수술기구 갓 멸균 및 제되어 있는지 확인외과 영역에서 멸균입니다. </li><li> 플루오로 - 골드 (증류수에 5 %)와 마이크로 피펫을 채 웁니다. </li><li> 이소 플루오 란 (2 O 4 %)을 유도 챔버에 동물을 유도 anaesthetise. 반사를 바로 잡고 있는지 확인하고 유도 실에서 제거하기 전에이 없음을 확인합니다. 쥐의 주둥이를 통해 코 콘을 안전하고 마취의 유지 보수를위한 이소 플루오 란을 (O 2의 2 %) 제공합니다. 동물의 발가락을 꼬집어 부드럽게 페달 철수와 각막 반사가 모두없는 것을 확인하기 위해 동물의 눈을 누릅니다. 주 : 케타민과 xylazil의 혼합물도 사용될 수있다 (80 및 10 mg을 / kg 각각 복강 내 전달). 케타민은 일정 8 ( &quot;통제&quot;) 약물 및 준수되어야 할 것이다 약물의 구매, 사용, 저장 및 폐기와 관련된 필요한 프로토콜입니다. </li><li> 절차의 과정 동안 눈의 건조를 방지하기 위해 눈의 윤활유를 적용. </li><li> T 쉐이브argeted 사지 사용 거즈 세 클로르헥시딘의 교류 스크럽 70 % 알코올로 면도 부위를 닦아합니다. 수술 영역으로 동물을 전송합니다. </li><li> 깨끗한 underpad에 동물을 배치하고 대상 근육 (들)에 좋은 접근을 보장하기 위해 적절하게 배치합니다. </li><li> 멀리 기본 근육에서 대상 근육을 통해 피부를 들어 올려 수술 가위로 피부 절개를 만들기 위해 치아 그립 포셉 한 쌍을 사용합니다. 절개가 완전히 관심의 근육 (들)을 노출 할 수있을만큼 충분히 큰지 확인합니다. 근막에 미치는 영향을 최소화이 있는지 확인하십시오. </li><li> 정신적으로 근육 (들)에 MEP 지역의 위치와 모양을 바꾸어하는 MEP 사진을 사용합니다. 참고 : 좋은 느낌 마커가 관심의 근육 (들)에 사진에서 MEP 영역을 재현하는 데 도움 수 있습니다. </li><li> 각 S 1-2 μL의 3 ~ 4 주사, 플루오로 - 금 (MEP 지역의 전체 길이를 따라 여러 주사를 수행hould) 충분하다. 부드럽게 어떤 누출을 제거하는 근육 (들)을 닦으십시오. </li><li> 가깝게 무딘 집게로 절개 피부의 두 끝을 가져와 수술 클립 상처를 닫습니다. 상처의 전체 기간에 따라 0.1 ml의 부피 바카 인 (물 0.5 %) (또는 다른 국소 마취제)을 침투. </li><li> 오프 마취 기계의 전원을 켜고 완전히 마취에서 회복되는 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 내 근육 주사의 관리 및 동물의 관류 사이에 14 일 동안 기다립니다. </li></ol> 3. 관류 <ol><li> 복강 주사에 의해 동물에게 (150 ㎎ / ㎏ 예 Lethabarb) 펜토 바르비 나트륨 용액의 치사량을 투여. <ol><li> 페달 금단의 부재 및 각막 반사에 의해 확인 된 바와 같이 마취 깊은 레벨에 도달 할 때까지 동물을 밀접하게 감시한다. </li></ol></li><li> perfusio에 둔 해부 보드의 뒷면에있는 동물의 위치를N 싱크. </li><li> 흉골의 기반을 덮고있는 피부를 들어 올려 치아 그립 포셉 한 쌍을 사용합니다. 바로 흉골 아래 강한 수술 가위와 작은 피부 절개를 한 후 그립 흉골의 칼 모양의 연골을 집게를 사용합니다. 칼 모양의 연골을 누른 상태에서 겨드랑이에 흉골에서, 흉강의 양면에 절개를 확대. </li><li> 마음을 노출 다이어프램을 잘라. <ol><li> 혈액의 응고를 방지하기 위해 직접 심장의 정점에 헤파린의 0.ml을 주입한다. </li><li> 좌심실에 캐 뉼러의 삽입을 허용하는 정점을 차단하고 신속 haemostat의 도움으로 장소에 캐 뉼러를 클램프. </li><li> 미세 가위로 오른쪽 아트리움에 절개를 즉시 연동 펌프를 시작합니다. 아트리움에서 흐르는 액체가 혈액의 거의 무료이며 간장의 색이 밝은 갈색이 될 때까지 0.1 M PB로 관류. 이어서, SOLU으로 관류동물의 몸 전체까지 파라 포름 알데히드 (0.1 M PB의 4 %)의 기 경질된다. </li></ol></li></ol> 4. 경추 척수 해부 및 조직학 준비 <ol><li> 복부에 동물의 시체를 놓습니다. </li><li> 메스와 신체의 정중선에서 피부를 잘라 장골의 수준으로 두개골의 기지에서 그것을 반영한다. </li><li> 을 극복하고 척추의 등 부분을 노출 척추 주위 근육을 반영합니다. </li><li> 아틀라스, 두 번째 자궁 세그먼트 (즉, C2)의 뼈 극돌기를 식별하고 대응하는 기본 등의 루트를 찾기 위해 수술 rongeurs이나 집게 한 쌍을 제거합니다. <ol><li> 영구 펠트 마커로 색칠하여 오른쪽 (C2) 루트를 확인합니다. </li><li> 하나 다음 척추를 제거하고 교류 색상 (즉, C2는, C4가, C6 및 C8은 녹색과 C3에 색 수와 오른쪽 지느러미 뿌리를 표시, C5는 C7은 T1이 COL 될 수 있습니다OR 연산 파란색). </li></ol></li><li> 작은 외과 용 바늘을 사용하여 (예를 들어, 30 게이지 바늘 G)를 부드럽게 관통 척수의 하단부를 덮는 경질 내지. 종 방향 슬릿을 만들기 위해 rostrally 바늘을 이동하는 동안이 위를 향하도록 바늘의 베벨으로, 코드에서 멀리 경질을 들어 올립니다. <ol><li> 경질을 반영한다. </li></ol></li><li> 새로운 메스 블레이드 단면 또는 두 개의 세그먼트 블록으로 척수의 횡 방향으로 잘라. <ol><li> 신중 개의 인접한 뿌리 사이 메스 블레이드 반쯤 각 블록의 좌측에 작은 기준 마크를 위해선, 각각의 블록에 대해, 인 시츄 척수 세그먼트두고. 블록의 복부 측면에서 볼 수 있도록로 기준 마크가 조직을 통해 충분히 깊은 있는지 확인하십시오. 다음 해부 조직 세그먼트의 배향을 돕기 위해, 동물의 해부에 대해 전방 또는 후방 중 하나를 가리키는, 약 45 °의 각도에서 기준 마크를 확인. </li></ol></li><li> 파라 포름 알데히드 (0.1 M PB 4 %)의 용액을 포함하는 작은, 명확하게 표시된 병에 개별 블록을 수집하고 RT O / N에 둡니다. </li><li> 수크로오스 (0.1 M PB 30 %)의 용액을 함유하는 깨끗한 병에 명확히 표시된 블록을 전송하고 적어도 이틀 동안 4 ℃에서 보관. </li><li> 극저온 금형의 세그먼트를 놓고 조직 동결 매체로 덮여. 길이 방향의 조직 학적 준비를 들어,이 위를 향 등의 측면과 블록의 방향 및 극저온 금형의 블록 방향을 기준 마크를 사용합니다. </li><li> -20 ℃에서 냉동 - 금형을 동결하고 50 μm의 두께 섹션에서 저온 유지 장치로 절단. 주 : 단면에 직접 부착 현미경 슬라이드 상에 장착 및 / N을 O 건조 남아있을 수있다. 대안 적으로, 섹션 0.1 M PB 가득 48- 웰 플레이트에 부유 할 수 있고,이어서 슬라이드 조직 절편 방향을 기준 마크를 사용하여 장착. </li></ol> 5. 요추 공동RD 해부 및 조직학 준비 <ol><li> 가 돌아왔다에 동물의 시체를 놓습니다. </li><li> 동물의 복부를 따라 중간 선 절개를 수행하고 내장을 제거합니다. 척추의 복부 측면을 노출 후부 복부 벽의 근육을 해부하다. </li><li> T13 복부 루트 뼈를 종료 짧은 꼬리 가장 리브와 인접 T13 척추를 찾습니다. <ol><li> 연속 (T13)에 의해 두 개 또는 세 개의 척추 주동이을 하나를 제거 (즉, T12, T11 및 필요한 경우, T10) 미세 수술 rongeurs와는 ​​복부 코드의 복부 측면에있는 항목의 점까지 T13 복부 루트를 따라와 영구 펠트 마커를 표시합니다. </li><li> 이 시점부터, 교호 컬러로 채색, L1, L2, L3, L4, L5, L6 및 S1에 대한 복부 루트 엔트리 포인트의 위치를​​ 식별하기 위해 동일한 절차를 반복한다. </li></ol></li><li> 4.5-4.10 LUM 절에 설명 된 것과 동일한 절차를 따라척수 해부 바. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

근육 타겟팅 및 신경 근육 상태의 실험적인 치료에 해당하는 α 운동 신경에 치료 유전자의 후속 역행 전송은 새로운 전략이 아니다. 예를 들어, 이러한 전달 방법은 SOD1의 마우스 및 래트에서 1,9-12 ALS 진행의 다른 단계에서뿐만 아니라 SMA 13 마우스에서 신경 근육 퇴행을 지연시키기 위해 사용되어왔다. 유망한 동안, 이러한 유전자 치료 시나리오의 효능은 제한되었다. 이러한 관?...

이러한 운동 신경 질환과 같은 신경 학적 조건에서 결과 spinal- 자발적인 운동뿐만 아니라 뒤센 근위축증 제어의 손실 영향을받는 개인의 일상 생활에 높고 오래 지속 영향을 쇠약 상태이다. 지난 10 년간, 중지 또는 적어도 이러한 신경 근육 질환의 해로운 영향을 지연하는 것을 목표로 연구 노력은 세계의 많은 의사와 과학자에 대한 우선 순위왔다. 이와 관련하여,이 신경 근육 질환을 모방 동물 모델의 최근의 발전은 이러한 조건 1-13의 발생과 진행을 기초로 생리적 인 메커니즘 근본적인 통찰력을 구하는 수단이되어왔다. 이들 신경 근육 질환의 치료는 척수에 직접 액세스를 필요로하며, 척수 주사 14,15 의해 달성 될 수있다. 유전자 치료의 최근 발전은 또한 상단의 가로 무늬 근육을 타겟으로하고척수 1,9-13의 복부 경적 내에 위치 대응 α 운동 신경 셔틀 치료 유전자 낮은 사지. 그러나, 일단이 유망한 전략은 이들 신경의 조건의 결과를 개선하지 못했다. 그것은 이러한 불량한 결과가 될 수 있다고 결론 공정 동안, 적어도 부분적으로, 이러한 보호 유전자의 낮은 효율에 기인 한 이러한 유전자 전달 방법의 낮은 효능을 배제 할 수 없다. 모터 엔드 플레이트 (유럽 의회 의원)는 운동 신경을 α에서 발생하는 대형 주변 모터 섬유의 축삭 터미널로 들여 골격 myofibres의 전문 영역입니다. 함께, 말초 신경 섬유 종말과 유럽 의회 의원은 즉, 신경 근육 접합부, 시냅스 자극이 신경 전달 물질의 선행 성 릴리스, 아세틸 콜린에 의해 트리거하는 사이트를 형성한다. 중요한 것은, 말초 신경 섬유 및 MEP들 사이의 관계를 임시 저장 양방향이고적인는 다른 모터뿐만 아니라 멀리 신경 세포에서 대한 분자와 세포 기관의 수송을 담당하지만, 16-18 인 somata. 이러한 해부학 적 고려 사항에 비추어, 유럽 의회 의원은 해당 운동 신경에 전달 및 유전 물질의 후속 역행 전송을 위해 선택의 대상이 될 것으로 보인다. 이러한 맥락에서, 운동 신경 전달의 성공은 크게 바이러스 벡터 및 근육의 MEP들 19-20의 근육 내 주사 사이의 거리에 의존한다는 놀라운 일이 아니다. 그러나 놀랍게도, 실험실 쥐 및 마우스에 myofibres MEP 영역의 정확한 위치는, 선택의 두 종의 신경 근육 질환 모델, 최근까지 사용할 수 없었다. 우리는 쥐와 마우스 21-22 여러 앞다리 근육의 MEP 지역의 종합적인지도를 제작했다. 최근에, 우리는 MEP (R)의 조직의 세부 사항을 보여 주었다마우스 뒷다리 (23)의 여러 근육 egion 우리는 현재 쥐의 뒷다리에있는 유럽 의회 의원의 기능을 분석하고 있습니다. 우리의 손에, 이러한 근육의 전체 MEP 영역에 관한 역행 추적자의 근육 내 주사는 이전에보고 된 것보다 더 많은 척수 세그먼트에 걸쳐있다 더 레이블 모터 뉴런에 상승했다. 여기에서 우리는 외부 표면 상에뿐만 아니라 뒷다리의 깊이에 걸쳐 최저 소비 효율을 표시 위치 및 마우스와 래트 모두에서 근육 앞다리은 지난 몇 년 동안 개발 된 프로토콜을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>Fluoro-Gold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>Nil</td><td>Diluted to 5%</td></tr><tr><td>Drummond PCR Micropipets 1-10 &amp;micro;l</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td>accompanied with plungers</td></tr><tr><td>Acetylthiocholine Iodide</td><td>Sigma Life Science</td><td>A5751-25G</td><td></td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61230-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Ajax Finechem</td><td>1083-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin</td><td>Life Technologies</td><td>D-3312</td><td>Diliuted in distilled water</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Provet</td><td>ISOF00</td><td>1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour</td></tr><tr><td>Autoclip 9 mm Wound Clips</td><td>Texas Scientific Instruments, LLC</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Lethabarb Enthanasia Injection</td><td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td><td>LETHA450</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Ajax Finechem</td><td>A809-2.5L PL</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus glass slides</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulphide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1952</td><td>Diluted to 10%</td></tr><tr><td>Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)</td><td>Astrazenca</td><td></td><td>Diluted to 0.25%</td></tr></tbody></table>

intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons

척수 운동 뉴런의 무결성에 영향을주는 질환은 신경 쇠약 상태 사이. 지난 수십 년 동안, 이들 신경 근육 질환의 여러 동물 모델의 개발을 지연 시키거나 이러한 상태의 진행을 역전 겨냥한 다른 치료 시나리오와 과학계를 제공했다. 뉴런의 역행 기계 활용함으로써, 이러한 접근 중 하나는 척수 운동 뉴런에 대응하는 셔틀 치료 유전자 순서 골격근을 대상으로하고있다. 일단 유망하지만, 이러한 유전자 전달 방법의 성공은 지금까지 수득 보였다 형질 운동 뉴런의 차선 수에 의해 방해되어왔다. 모터 엔드 플레이트 (MEP들)는 운동 뉴런 α 척수 직접 시냅스 접촉 골격 근육에 고도의 전문 영역이다. 이와 관련하여,이 점에 유의하는 것이 중요하다 지금까지 노력하는 역행운동 뉴런에 전사 유전자 표적 근육 MEP 영역의 위치를​​ 참조하지 않고 제조 하였다. 여기에서는 간단한 프로토콜 1) 골격근의 표면상의 최저 소비 효율 정확한 위치를 드러내 2) 운동 뉴런으로 근육 내 전달 및 역행 트레이서 후속 최적 역행 수송을 안내하기 위해이 정보를 사용을 설명한다. 우리는 유럽 의회 의원의 타겟팅을 통해 척수의 운동 신경 세포에 치료 유전자의 역행 전송 조사에 더 많은 연구에서 이러한 추적 실험의 결과를 활용할 수 있도록 노력하겠습니다.

아세틸 콜린 에스 테라 조직 화학적 염색은 근육의 폭을 가로 지르는 운동 단부 판의 위치를 알 수있다. (1) 전체의 래트 앞다리 수행 이러한 염색의 결과를 도시한다. 그것은 암모늄 황화물 용액의 농도를 최적화하기 위해 제안된다 (예., 5~7% 대신 10 %)뿐만 아니라 시편 용액에 침지하는 시간은 근육 섬유에 비특이적 백그라운드 염색이 너무이면 과도한.도 2는...

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Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

모터 엔드 플레이트 함께 근육 주사 : 직접 모터 뉴런에 셔틀 트레이서에 대한 최소 침습 접근

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K 조회수.  University of New South Wales. The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

비디오: Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

마약, 바이러스성 벡터, 또는 세포 이식 전달 Microinjections 깊은 뇌 구조의 타겟팅

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

연구

신경과학

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice

Despite the protective role that blood brain barrier plays in shielding the brain, it limits the access to the central nervous system (CNS) which most often results in failure of potential therapeutics designed for neurodegenerative disorders 1,2. Neurodegenerative diseases such as Spinal Muscular Atrophy (SMA), in which the lower motor neurons are affected, can benefit greatly from introducing the therapeutic agents into the CNS. The purpose of this video is to demonstrate two different injection paradigms to deliver therapeutic materials into neonatal mice soon after birth. One of these methods is injecting directly into cerebral lateral ventricles (Intracerebroventricular) which results in delivery of materials into the CNS through the cerebrospinal fluid 3,4. The second method is a temporal vein injection (intravenous) that can introduce different therapeutics into the circulatory system, leading to systemic delivery including the CNS 5. Widespread transduction of the CNS is achievable if an appropriate viral vector and viral serotype is utilized. Visualization and utilization of the temporal vein for injection is feasible up to postnatal day 6. However, if the delivered material is intended to reach the CNS, these injections should take place while the blood brain barrier is more permeable due to its immature status, preferably prior to postnatal day 2. The fully developed blood brain barrier greatly limits the effectiveness of intravenous delivery. Both delivery systems are simple and effective once the surgical aptitude is achieved. They do not require any extensive surgical devices and can be performed by a single person. However, these techniques are not without challenges. The small size of postnatal day 2 pups and the subsequent small target areas can make the injections difficult to perform and initially challenging to replicate.

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular ICV and Intravenous IV Injection in Mice

This article demonstrates two very different methods of injection: 1) into the brain (intracerebroventricular) and 2) systemic (intravenous) to introduce the therapeutic agents into the central nervous system of neonatal mice.

마우스에 Intracerebroventricular을 통해 치료 대리점 납품 (ICV)과 정맥 (IV) 사출

Despite the protective role that blood brain barrier plays in shielding the brain, it limits the access to the central nervous system (CNS) which most ...

의학

Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury

Respiratory compromise due to phrenic motor neuron loss is a debilitating consequence of a large proportion of human traumatic spinal cord injury (SCI) cases 1 and is the ultimate cause of death in patients with the motor neuron disorder, amyotrophic laterals sclerosis (ALS) 2.
ALS is a devastating neurological disorder that is characterized by relatively rapid degeneration of upper and lower motor neurons. Patients ultimately succumb to the disease on average 2-5 years following diagnosis because of respiratory paralysis due to loss of phrenic motor neuron innnervation of the diaphragm 3. The vast majority of cases are sporadic, while 10% are of the familial form. Approximately twenty percent of familial cases are linked to various point mutations in the Cu/Zn superoxide dismutase 1 (SOD1) gene on chromosome 21 4. Transgenic mice 4,5 and rats 6 carrying mutant human SOD1 genes (G93A, G37R, G86R, G85R) have been generated, and, despite the existence of other animal models of motor neuron loss, are currently the most highly used models of the disease.
Spinal cord injury (SCI) is a heterogeneous set of conditions resulting from physical trauma to the spinal cord, with functional outcome varying according to the type, location and severity of the injury 7. Nevertheless, approximately half of human SCI cases affect cervical regions, resulting in debilitating respiratory dysfunction due to phrenic motor neuron loss and injury to descending bulbospinal respiratory axons 1. A number of animal models of SCI have been developed, with the most commonly used and clinically-relevant being the contusion 8.
Transplantation of various classes of neural precursor cells (NPCs) is a promising therapeutic strategy for treatment of traumatic CNS injuries and neurodegeneration, including ALS and SCI, because of the ability to replace lost or dysfunctional CNS cell types, provide neuroprotection, and deliver gene factors of interest 9.
Animal models of both ALS and SCI can model many clinically-relevant aspects of these diseases, including phrenic motor neuron loss and consequent respiratory compromise 10,11. In order to evaluate the efficacy of NPC-based strategies on respiratory function in these animal models of ALS and SCI, cellular interventions must be specifically directed to regions containing therapeutically relevant targets such as phrenic motor neurons. We provide a detailed protocol for multi-segmental, intraspinal transplantation of NPCs into the cervical spinal cord ventral gray matter of neurodegenerative models such as SOD1G93A mice and rats, as well as spinal cord injured rats and mice 11.

Neural precursor transplantation is a promising strategy for protecting and/or replacing lost/dysfunctional cervical phrenic motor neurons in spinal cord injury (SCI) and the motor neuron disorder, amyotrophic laterals sclerosis (ALS). We provide a protocol for cell delivery to cervical spinal cord ventral horn in rodent models of ALS and SCI.

루게릭병과 외상 척수 상해에서 자궁암 복부 호른를 타겟팅하는 Intraspinal 세포 이식

Respiratory compromise due to phrenic motor neuron loss is a debilitating consequence of a large proportion of human traumatic spinal cord injury (SCI) ...

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

멀티 컬러의 신경 회로 지형을 공개

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

마우스의 초음파 유도 경 흉부 심근 내 주입

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.

In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.

Miniosmotic의 주입 펌프 및 요로의 트레이서의 배달 병태 생리 학적 조건에서 뇌 조직 개편을 연구에

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Nerve Stimulator-guided Injection of Autologous Stem Cells Near the Equine Left Recurrent Laryngeal Nerve

Recurrent laryngeal neuropathy (RLN) commonly affects horses and is characterized by abnormal respiratory sounds and exercise intolerance. The recurrent laryngeal nerve shows lesions of demyelination. The benefit of applying stem cells to demyelinated nerves has been demonstrated in various animal models. The aim of the study was to test the feasibility and safety of a peri-neuronal injection of autologous muscle-derived mesenchymal stem cells to the left recurrent laryngeal nerve in healthy horses by using an electrical nerve stimulator.
Muscle-derived stems cell are obtained from five healthy Standardbred horses by sampling 20 mg of muscle tissue with a semi-automatic 14 G biopsy needle from the triceps muscle. Movements of the larynx are monitored via upper-airway video endoscopy. The left recurrent laryngeal nerve is approached with an insulated nerve block needle. Nerve stimulation is applied, starting at 2 mA, and the successful abduction of the left arytenoid is monitored. The stimulation intensity is reduced progressively. When a loss of the motor response is observed at 0.5 mA, 107 autologous muscle-derived stem cells are injected. Two examiners, who are blinded to the time point, score the laryngeal function of the horses prior to the treatment and at day 1, day 7, and day 28 after the injection of the cells. In a sixth horse, 1 mL of 2% lidocaine is injected to further confirm the correct positioning of the needle. This leads to a temporary paralysis of the left arytenoid cartilage.
This study proves that the recurrent laryngeal nerve can be approached with the help of an electrical nerve stimulator and that the electrical stimulation of the nerve is well tolerated by the horses. No modification of the laryngeal function was observed in any of the horses after the injection of the stem cells. Further studies should be conducted to describe the effects of a peri-neuronal injection of autologous muscle-derived mesenchymal stem cells to horses suffering from RLN.

Here, we present a protocol to inject autologous muscle-derived stem cells in the proximity to the recurrent laryngeal nerve with the help of an electrical nerve stimulator. This novel technique may become useful for the treatment of equine recurrent laryngeal neuropathy.

말 왼쪽된 회귀 후 두 신경 근처 헌 혈 줄기 세포의 신경 자극을 유도 주사

Recurrent laryngeal neuropathy (RLN) commonly affects horses and is characterized by abnormal respiratory sounds and exercise intolerance. The recurrent ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

마우스의 빠른 비 침습 요추 경 막내 주사를 통해 생체 siRNA의 형질과 척수에있는 유전자 넉다운에

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

생물학

<meta charset="utf8"></head><body>Electroporation and nerve injury in mouse levator auris longus muscle(마우스 거근 오리스 장근의 전기천공법과 신경 손상)

Combined In Vivo Electroporation and Short&#45;Term Reinnervation of the Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle

The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse controlling the contraction of skeletal muscle fibers to allow the coordinated movement of many organisms. At the NMJ, a presynaptic motor axon terminal contacts a muscle postsynaptic domain and is covered by terminal Schwann cells. The integrity and function of the NMJ is compromised under several conditions, including aging, neuromuscular diseases, and traumatic injuries. To analyze the potential contribution of muscle-derived proteins to NMJ maintenance and regeneration, an in vivo gene transfer strategy has been combined with the denervation of the cranial levator auris longus (LAL) muscle after mechanical nerve injury. Previous findings showed that the forced expression of control fluorescent proteins does not alter NMJ organization or neurotransmission. This procedure aims to describe a detailed method of in vivo electroporation of the LAL muscle followed by transection or crushing of the specific branch of the facial nerve innervating cranial muscles, leading to NMJ denervation and reinnervation, respectively. The combination of these experimental strategies in the convenient LAL muscle constitutes an efficient method to study the potential contribution of muscle protein overexpression or silencing in the context of short-term NMJ reinnervation.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 신경근 접합부에서 신경 손상 후 근육 단백질의 재생 역할

Here, we present a protocol that combines in vivo electroporation and denervation of the cranial levator auris longus (LAL) muscle. This procedure enables the study of the potential role of muscle-derived proteins in the regeneration of the neuromuscular synapse.

In Vivo Electroporation과 Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle의 단기 신경 재생이 결합되었습니다.

The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse controlling the contraction of skeletal muscle fibers to allow the coordinated movement of many ...