이 작품은 RM에 국민 건강 및 의료 연구 센터 (NHMRC) 프로젝트 연구비 지원

여기에 설명 된 모든 실험 절차는 UNSW 호주의 동물 관리 및 윤리위원회 준수하고 국민 건강과 동물 실험에 대한 의학 연구위원회 (Medical Research Council) 호주의 규정에 따라 수행되었다. 이 프로토콜의 모든 절차는 적절한 동물 관리 및 윤리위원회의 요구에 따라 수행되어야한다. 1. 아세틸 콜린 에스 테라 제 조직 화학 염색 <ol><li> 아세틸 콜린 에스 테라 제의 반응 혼합물을 제조 <ol><li> 0.1 M 인산 완충액 (PB)에 200 ml의 아세틸 티오 콜린 요오다 이드 290 mg을 추가. 900 rpm에서 교반기로 섞는다. </li><li> 연속 교반 글리신 600 mg을 추가합니다. </li><li> 생성물이 완전히 용해 될 때까지 천천히 교반하면서 연속 반응 액에 황산구리 420 mg을 추가. </li></ol></li><li> 동물 시체의 피부를 제거 절개를하여 (조직의 공유를 통해 얻은)관류 쥐 또는 마우스의 피부, 목 지역으로부터 피부를 잡고 그 다리를지나 당겨에. 각 근육을 덮고있는 근막을 제거하거나 크게 반응 용액에 근육 섬유의 충분한 노출을 보장하기 위해 천공 중 하나입니다 있는지 확인합니다. </li><li> 반응 혼합물에 몸 전체 또는 관심의 다리를 담그고 4 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 증류수에 2 분 동안 시체를 씻으십시오. 주의 :이 단계에서는, 근육 청색 착색 모터 엔드 플레이트 (MEP들)이 하얀 점으로 볼 수있다 나타낸다. </li><li> 3 ~ 5 초 동안 10 % 암모늄 황화물의 용액에 시체를 노출. 참고 : 근육 섬유가 빠르게 갈색으로 바뀝니다과 유럽 의회 의원이 검은 얼룩 점으로 관찰 할 수있을 것입니다. 반응을 너무 빠르게 발생하여, 근육 섬유는 황화 암모늄 용액 (예, 5 %)의 낮은 농도를 사용하여 시도 MEP들 및 근섬유 구분할 너무 어둡게 염색하는 경우. 반응 시간을 얻을유럽​​ 의회 의원과 근육 섬유 사이의 최적의 대비가 하나의 샘플에서 다른 다릅니다. 그러므로 시약 정확한 노출 시간을 정의하는 것은 곤란하다. 반응은 밀접하게 모니터링과 대비가 적절한 것으로 간주 할 때 중지해야합니다. </li><li> 증류수에 교반, 시체 두 번 세척하고 부드럽게 시체 건조 두드려. </li><li> 사진 관심의 모든 근육에 대한 유럽 의회 의원이 캡처되는 것을 보장 사지의 외측과 내측 측면 모두. </li></ol> 2. 근육 주사 모터 엔드 플레이트에서 <ol><li> 마이크로 피펫 풀러와 유리 마이크로 피펫을 당겨 (플런저와 등급 Micropipette과의 사용 권장). 해부 현미경의 도움으로, 마이크로 피펫의 루멘의 내부 직경이 약 0.5 mm가되도록 포셉 쌍 마이크로 피펫의 선단을 깰. </li><li> 사용 된 모든 수술기구 갓 멸균 및 제되어 있는지 확인외과 영역에서 멸균입니다. </li><li> 플루오로 - 골드 (증류수에 5 %)와 마이크로 피펫을 채 웁니다. </li><li> 이소 플루오 란 (2 O 4 %)을 유도 챔버에 동물을 유도 anaesthetise. 반사를 바로 잡고 있는지 확인하고 유도 실에서 제거하기 전에이 없음을 확인합니다. 쥐의 주둥이를 통해 코 콘을 안전하고 마취의 유지 보수를위한 이소 플루오 란을 (O 2의 2 %) 제공합니다. 동물의 발가락을 꼬집어 부드럽게 페달 철수와 각막 반사가 모두없는 것을 확인하기 위해 동물의 눈을 누릅니다. 주 : 케타민과 xylazil의 혼합물도 사용될 수있다 (80 및 10 mg을 / kg 각각 복강 내 전달). 케타민은 일정 8 ( &quot;통제&quot;) 약물 및 준수되어야 할 것이다 약물의 구매, 사용, 저장 및 폐기와 관련된 필요한 프로토콜입니다. </li><li> 절차의 과정 동안 눈의 건조를 방지하기 위해 눈의 윤활유를 적용. </li><li> T 쉐이브argeted 사지 사용 거즈 세 클로르헥시딘의 교류 스크럽 70 % 알코올로 면도 부위를 닦아합니다. 수술 영역으로 동물을 전송합니다. </li><li> 깨끗한 underpad에 동물을 배치하고 대상 근육 (들)에 좋은 접근을 보장하기 위해 적절하게 배치합니다. </li><li> 멀리 기본 근육에서 대상 근육을 통해 피부를 들어 올려 수술 가위로 피부 절개를 만들기 위해 치아 그립 포셉 한 쌍을 사용합니다. 절개가 완전히 관심의 근육 (들)을 노출 할 수있을만큼 충분히 큰지 확인합니다. 근막에 미치는 영향을 최소화이 있는지 확인하십시오. </li><li> 정신적으로 근육 (들)에 MEP 지역의 위치와 모양을 바꾸어하는 MEP 사진을 사용합니다. 참고 : 좋은 느낌 마커가 관심의 근육 (들)에 사진에서 MEP 영역을 재현하는 데 도움 수 있습니다. </li><li> 각 S 1-2 μL의 3 ~ 4 주사, 플루오로 - 금 (MEP 지역의 전체 길이를 따라 여러 주사를 수행hould) 충분하다. 부드럽게 어떤 누출을 제거하는 근육 (들)을 닦으십시오. </li><li> 가깝게 무딘 집게로 절개 피부의 두 끝을 가져와 수술 클립 상처를 닫습니다. 상처의 전체 기간에 따라 0.1 ml의 부피 바카 인 (물 0.5 %) (또는 다른 국소 마취제)을 침투. </li><li> 오프 마취 기계의 전원을 켜고 완전히 마취에서 회복되는 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 내 근육 주사의 관리 및 동물의 관류 사이에 14 일 동안 기다립니다. </li></ol> 3. 관류 <ol><li> 복강 주사에 의해 동물에게 (150 ㎎ / ㎏ 예 Lethabarb) 펜토 바르비 나트륨 용액의 치사량을 투여. <ol><li> 페달 금단의 부재 및 각막 반사에 의해 확인 된 바와 같이 마취 깊은 레벨에 도달 할 때까지 동물을 밀접하게 감시한다. </li></ol></li><li> perfusio에 둔 해부 보드의 뒷면에있는 동물의 위치를N 싱크. </li><li> 흉골의 기반을 덮고있는 피부를 들어 올려 치아 그립 포셉 한 쌍을 사용합니다. 바로 흉골 아래 강한 수술 가위와 작은 피부 절개를 한 후 그립 흉골의 칼 모양의 연골을 집게를 사용합니다. 칼 모양의 연골을 누른 상태에서 겨드랑이에 흉골에서, 흉강의 양면에 절개를 확대. </li><li> 마음을 노출 다이어프램을 잘라. <ol><li> 혈액의 응고를 방지하기 위해 직접 심장의 정점에 헤파린의 0.ml을 주입한다. </li><li> 좌심실에 캐 뉼러의 삽입을 허용하는 정점을 차단하고 신속 haemostat의 도움으로 장소에 캐 뉼러를 클램프. </li><li> 미세 가위로 오른쪽 아트리움에 절개를 즉시 연동 펌프를 시작합니다. 아트리움에서 흐르는 액체가 혈액의 거의 무료이며 간장의 색이 밝은 갈색이 될 때까지 0.1 M PB로 관류. 이어서, SOLU으로 관류동물의 몸 전체까지 파라 포름 알데히드 (0.1 M PB의 4 %)의 기 경질된다. </li></ol></li></ol> 4. 경추 척수 해부 및 조직학 준비 <ol><li> 복부에 동물의 시체를 놓습니다. </li><li> 메스와 신체의 정중선에서 피부를 잘라 장골의 수준으로 두개골의 기지에서 그것을 반영한다. </li><li> 을 극복하고 척추의 등 부분을 노출 척추 주위 근육을 반영합니다. </li><li> 아틀라스, 두 번째 자궁 세그먼트 (즉, C2)의 뼈 극돌기를 식별하고 대응하는 기본 등의 루트를 찾기 위해 수술 rongeurs이나 집게 한 쌍을 제거합니다. <ol><li> 영구 펠트 마커로 색칠하여 오른쪽 (C2) 루트를 확인합니다. </li><li> 하나 다음 척추를 제거하고 교류 색상 (즉, C2는, C4가, C6 및 C8은 녹색과 C3에 색 수와 오른쪽 지느러미 뿌리를 표시, C5는 C7은 T1이 COL 될 수 있습니다OR 연산 파란색). </li></ol></li><li> 작은 외과 용 바늘을 사용하여 (예를 들어, 30 게이지 바늘 G)를 부드럽게 관통 척수의 하단부를 덮는 경질 내지. 종 방향 슬릿을 만들기 위해 rostrally 바늘을 이동하는 동안이 위를 향하도록 바늘의 베벨으로, 코드에서 멀리 경질을 들어 올립니다. <ol><li> 경질을 반영한다. </li></ol></li><li> 새로운 메스 블레이드 단면 또는 두 개의 세그먼트 블록으로 척수의 횡 방향으로 잘라. <ol><li> 신중 개의 인접한 뿌리 사이 메스 블레이드 반쯤 각 블록의 좌측에 작은 기준 마크를 위해선, 각각의 블록에 대해, 인 시츄 척수 세그먼트두고. 블록의 복부 측면에서 볼 수 있도록로 기준 마크가 조직을 통해 충분히 깊은 있는지 확인하십시오. 다음 해부 조직 세그먼트의 배향을 돕기 위해, 동물의 해부에 대해 전방 또는 후방 중 하나를 가리키는, 약 45 °의 각도에서 기준 마크를 확인. </li></ol></li><li> 파라 포름 알데히드 (0.1 M PB 4 %)의 용액을 포함하는 작은, 명확하게 표시된 병에 개별 블록을 수집하고 RT O / N에 둡니다. </li><li> 수크로오스 (0.1 M PB 30 %)의 용액을 함유하는 깨끗한 병에 명확히 표시된 블록을 전송하고 적어도 이틀 동안 4 ℃에서 보관. </li><li> 극저온 금형의 세그먼트를 놓고 조직 동결 매체로 덮여. 길이 방향의 조직 학적 준비를 들어,이 위를 향 등의 측면과 블록의 방향 및 극저온 금형의 블록 방향을 기준 마크를 사용합니다. </li><li> -20 ℃에서 냉동 - 금형을 동결하고 50 μm의 두께 섹션에서 저온 유지 장치로 절단. 주 : 단면에 직접 부착 현미경 슬라이드 상에 장착 및 / N을 O 건조 남아있을 수있다. 대안 적으로, 섹션 0.1 M PB 가득 48- 웰 플레이트에 부유 할 수 있고,이어서 슬라이드 조직 절편 방향을 기준 마크를 사용하여 장착. </li></ol> 5. 요추 공동RD 해부 및 조직학 준비 <ol><li> 가 돌아왔다에 동물의 시체를 놓습니다. </li><li> 동물의 복부를 따라 중간 선 절개를 수행하고 내장을 제거합니다. 척추의 복부 측면을 노출 후부 복부 벽의 근육을 해부하다. </li><li> T13 복부 루트 뼈를 종료 짧은 꼬리 가장 리브와 인접 T13 척추를 찾습니다. <ol><li> 연속 (T13)에 의해 두 개 또는 세 개의 척추 주동이을 하나를 제거 (즉, T12, T11 및 필요한 경우, T10) 미세 수술 rongeurs와는 ​​복부 코드의 복부 측면에있는 항목의 점까지 T13 복부 루트를 따라와 영구 펠트 마커를 표시합니다. </li><li> 이 시점부터, 교호 컬러로 채색, L1, L2, L3, L4, L5, L6 및 S1에 대한 복부 루트 엔트리 포인트의 위치를​​ 식별하기 위해 동일한 절차를 반복한다. </li></ol></li><li> 4.5-4.10 LUM 절에 설명 된 것과 동일한 절차를 따라척수 해부 바. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

근육 타겟팅 및 신경 근육 상태의 실험적인 치료에 해당하는 α 운동 신경에 치료 유전자의 후속 역행 전송은 새로운 전략이 아니다. 예를 들어, 이러한 전달 방법은 SOD1의 마우스 및 래트에서 1,9-12 ALS 진행의 다른 단계에서뿐만 아니라 SMA 13 마우스에서 신경 근육 퇴행을 지연시키기 위해 사용되어왔다. 유망한 동안, 이러한 유전자 치료 시나리오의 효능은 제한되었다. 이러한 관?...

이러한 운동 신경 질환과 같은 신경 학적 조건에서 결과 spinal- 자발적인 운동뿐만 아니라 뒤센 근위축증 제어의 손실 영향을받는 개인의 일상 생활에 높고 오래 지속 영향을 쇠약 상태이다. 지난 10 년간, 중지 또는 적어도 이러한 신경 근육 질환의 해로운 영향을 지연하는 것을 목표로 연구 노력은 세계의 많은 의사와 과학자에 대한 우선 순위왔다. 이와 관련하여,이 신경 근육 질환을 모방 동물 모델의 최근의 발전은 이러한 조건 1-13의 발생과 진행을 기초로 생리적 인 메커니즘 근본적인 통찰력을 구하는 수단이되어왔다. 이들 신경 근육 질환의 치료는 척수에 직접 액세스를 필요로하며, 척수 주사 14,15 의해 달성 될 수있다. 유전자 치료의 최근 발전은 또한 상단의 가로 무늬 근육을 타겟으로하고척수 1,9-13의 복부 경적 내에 위치 대응 α 운동 신경 셔틀 치료 유전자 낮은 사지. 그러나, 일단이 유망한 전략은 이들 신경의 조건의 결과를 개선하지 못했다. 그것은 이러한 불량한 결과가 될 수 있다고 결론 공정 동안, 적어도 부분적으로, 이러한 보호 유전자의 낮은 효율에 기인 한 이러한 유전자 전달 방법의 낮은 효능을 배제 할 수 없다. 모터 엔드 플레이트 (유럽 의회 의원)는 운동 신경을 α에서 발생하는 대형 주변 모터 섬유의 축삭 터미널로 들여 골격 myofibres의 전문 영역입니다. 함께, 말초 신경 섬유 종말과 유럽 의회 의원은 즉, 신경 근육 접합부, 시냅스 자극이 신경 전달 물질의 선행 성 릴리스, 아세틸 콜린에 의해 트리거하는 사이트를 형성한다. 중요한 것은, 말초 신경 섬유 및 MEP들 사이의 관계를 임시 저장 양방향이고적인는 다른 모터뿐만 아니라 멀리 신경 세포에서 대한 분자와 세포 기관의 수송을 담당하지만, 16-18 인 somata. 이러한 해부학 적 고려 사항에 비추어, 유럽 의회 의원은 해당 운동 신경에 전달 및 유전 물질의 후속 역행 전송을 위해 선택의 대상이 될 것으로 보인다. 이러한 맥락에서, 운동 신경 전달의 성공은 크게 바이러스 벡터 및 근육의 MEP들 19-20의 근육 내 주사 사이의 거리에 의존한다는 놀라운 일이 아니다. 그러나 놀랍게도, 실험실 쥐 및 마우스에 myofibres MEP 영역의 정확한 위치는, 선택의 두 종의 신경 근육 질환 모델, 최근까지 사용할 수 없었다. 우리는 쥐와 마우스 21-22 여러 앞다리 근육의 MEP 지역의 종합적인지도를 제작했다. 최근에, 우리는 MEP (R)의 조직의 세부 사항을 보여 주었다마우스 뒷다리 (23)의 여러 근육 egion 우리는 현재 쥐의 뒷다리에있는 유럽 의회 의원의 기능을 분석하고 있습니다. 우리의 손에, 이러한 근육의 전체 MEP 영역에 관한 역행 추적자의 근육 내 주사는 이전에보고 된 것보다 더 많은 척수 세그먼트에 걸쳐있다 더 레이블 모터 뉴런에 상승했다. 여기에서 우리는 외부 표면 상에뿐만 아니라 뒷다리의 깊이에 걸쳐 최저 소비 효율을 표시 위치 및 마우스와 래트 모두에서 근육 앞다리은 지난 몇 년 동안 개발 된 프로토콜을 제시한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gold</td>
			<td>Fluorochrome, LLC</td>
			<td>Nil</td>
			<td>Diluted to 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond PCR Micropipets 1-10&#181;l</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>5-000-1001-X10</td>
			<td>accompanied with plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine Iodide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A5751-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61230-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>1083-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-3312</td>
			<td>Diliuted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Provet</td>
			<td>ISOF00</td>
			<td>1000mg/g Isoflurane inhalation vapour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm Wound Clips</td>
			<td>Texas Scientific Instruments, LLC</td>
			<td align="right">205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethabarb Enthanasia Injection</td>
			<td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td>
			<td>LETHA450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>A809-2.5L PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1952</td>
			<td>Diluted to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)</td>
			<td>Astrazenca</td>
			<td></td>
			<td>Diluted to 0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons

척수 운동 뉴런의 무결성에 영향을주는 질환은 신경 쇠약 상태 사이. 지난 수십 년 동안, 이들 신경 근육 질환의 여러 동물 모델의 개발을 지연 시키거나 이러한 상태의 진행을 역전 겨냥한 다른 치료 시나리오와 과학계를 제공했다. 뉴런의 역행 기계 활용함으로써, 이러한 접근 중 하나는 척수 운동 뉴런에 대응하는 셔틀 치료 유전자 순서 골격근을 대상으로하고있다. 일단 유망하지만, 이러한 유전자 전달 방법의 성공은 지금까지 수득 보였다 형질 운동 뉴런의 차선 수에 의해 방해되어왔다. 모터 엔드 플레이트 (MEP들)는 운동 뉴런 α 척수 직접 시냅스 접촉 골격 근육에 고도의 전문 영역이다. 이와 관련하여,이 점에 유의하는 것이 중요하다 지금까지 노력하는 역행운동 뉴런에 전사 유전자 표적 근육 MEP 영역의 위치를​​ 참조하지 않고 제조 하였다. 여기에서는 간단한 프로토콜 1) 골격근의 표면상의 최저 소비 효율 정확한 위치를 드러내 2) 운동 뉴런으로 근육 내 전달 및 역행 트레이서 후속 최적 역행 수송을 안내하기 위해이 정보를 사용을 설명한다. 우리는 유럽 의회 의원의 타겟팅을 통해 척수의 운동 신경 세포에 치료 유전자의 역행 전송 조사에 더 많은 연구에서 이러한 추적 실험의 결과를 활용할 수 있도록 노력하겠습니다.

아세틸 콜린 에스 테라 조직 화학적 염색은 근육의 폭을 가로 지르는 운동 단부 판의 위치를 알 수있다. (1) 전체의 래트 앞다리 수행 이러한 염색의 결과를 도시한다. 그것은 암모늄 황화물 용액의 농도를 최적화하기 위해 제안된다 (예., 5~7% 대신 10 %)뿐만 아니라 시편 용액에 침지하는 시간은 근육 섬유에 비특이적 백그라운드 염색이 너무이면 과도한.도 2는...

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Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

모터 엔드 플레이트 함께 근육 주사 : 직접 모터 뉴런에 셔틀 트레이서에 대한 최소 침습 접근

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

intramuscular-injections-along-motor-end-plates-minimally-invasive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K 조회수.  University of New South Wales. The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

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Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly의 근육 모터 풀에 모터 뉴런을 확인<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

연구

신경과학

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

쥐 시신경에 주입을위한 최소 침습 기술

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 신경 근육 학 분기점

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

내 시경 비 트랜스-sphenoidal 접근법: 뇌 하 수 체 Adenomas에 대 한 최소 침 습 수술

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

마우스에 인할지 모터 신경의 퇴행 성 신경 해부학 추적

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

개발 뇌에서 모터 피질의 비 침습적 변조 및 로봇 매핑

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Sciatic 신경 호감 상해의 쥐 모형에 있는 기능 평가를 위한 3D 운동학 분석

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

3차원 모터 신경 오르간성 생성

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...