저자는 도움이 토론 바스케즈 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 [KMV하는 CA097175, CA093279] 건강 / 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 국립 연구소에 의해 지원되었다; 암 예방 및 텍사스 연구소 [RP101501]합니다. 오픈 액세스 요금 자금 : 국립 연구소 건강 / 국립 암 연구소 [KMV에 CA093279].

플라스미드 기판에 TFO 지시 ICLS 1. 준비 <ol><li> 10,11 DNA 삼중 결합 완충액 [50 % 글리세롤, 10 mM 트리스 (PH 7.6), 10 mM의를 MgCl2 8 μL에 랄렌 공역 TFO AG30와 (5 μg의 플라스미드 DNA 좋은 출발점) 플라스미드 pSupFG1 몰량 부화 2] 호박색 튜브에서 40 μL의 최종 부피 DH 2 O. 로 pipetting 아래로 잘 섞는다. 12 시간 동안 37 ℃로 물을 욕조에서 반응을 품어. </li><li> 최대 전력 출력을 보장하기 위해 UVA 램프 워밍업. 파라핀 영화의 삼박자 반응을 배치하고, UVA (365 ㎚) 램프 아래에 얼음에 파라핀 필름을 배치합니다. 램프와 반응 사이의 마일 라 (Mylar) 필터를 놓습니다. </li><li> UVA가 18 J / ㎠의 총 투여 량에 대해 조사한다. 더 사용하기 위해 4 ° C에서 샘플을 저장합니다. 주의 : UVA 조사와 적절한 보호 안경과 복을 착용 할 것. </li><li> 재와 상기 제조 된 플라스미드 200 ng의 선형화제조업체를 사용하여 20 μl의 총 부피에 striction 효소 에코 R1 10 배 버퍼를 제공. 열은 65 ° C에서 20 분 동안 효소를 변성. 10,000 XG에 10 분 동안 샘플을 스핀 4 ℃에서 저장한다. </li><li> 50 배 알칼리 버퍼 [1.5 M의 NaOH, 50 mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA)]를 준비합니다. 50 ㎖ DH 2 O.에 아가로 오스의 0.5 mg을 추가 아가로 오스를 해산하고 50 ° C의 물을 욕조에 배치하는 끓인다. </li><li> 용해 된 아가로 오스의 온도가 아래로 50 ° C에 후에는 50 배 알칼리 버퍼 1 ㎖를 추가하여 혼합 한 후 젤 트레이에 젤을 붓는다. 젤은 사용하기 전에 실온에서 응고 할 때까지 기다립니다. </li><li> 선형화 된 DNA 시료를 20 ㎕의 0.5 M EDTA 4 μl를 첨가하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 6 배 알칼리 젤 로딩 버퍼 추가 (300 mM의 NaOH를 6 mM의 EDTA (승 / 18 % v)의 고 분자량 폴리 사카 라이드, 0.06 % 브로 모 크레졸 그린 DH 2 O)에 샘플 및 1 킬로바이트 DNA 사다리. 주 : 6 배 알칼리 젤 로딩 버퍼를 사용하는 것이 중요하다, 논의를 참조하시기 바랍니다. </li><li> 로드 추운 방에 젤 위에 샘플 cm 당 3.2 볼트에서 하룻밤 1X 알칼리 버퍼 (12-16 시간)에서 실행합니다. 샘플이 겔을 입력하면, 플로팅되는 것을 방지하기 위하여, 겔 위에 유리판을 배치했다. </li><li> 중화 완충액 [1 M 트리스 CL (PH 7.6), 1.5 M의 NaCl, 3M 아세트산 나트륨 (pH5.2)]을 실온에서 45 분 동안의 겔을 침지하여 시료를 중화. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 50 ml의 물에 1 %의 에티 디움 브로마이드 (EtBr로) 4 μL에 대한 DNA 젤 얼룩. 15 분 동안 물 Destain. 촬상 시스템을 이용하여 DNA를 시각화. 주의 : EtBr이 돌연변이는 강력하고 피부를 통해 흡수 될 수있다. EtBr이 직접 접촉을 피하십시오. </li></ol> 인간의 세포에서 TFO 지시 ICL 포함하는 플라스미드 2. 형질과 면역 침전 <ol><li> 플레이트 400,000 포유류 세포 (예를 들면, O U2OS둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 60mm 접시 당 steosarcoma 세포)를 형질 감염 24 시간 전에 항생제없이 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. 5 % CO 2와 37 ° C에서 하룻밤 세포를 품어. </li><li> 수욕에서 37 ° C로 형질 따뜻한 성장 배지 및 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 앞서. 실온으로 형질 감염 시약을 따뜻하게. </li><li> 10 분에 500 1 배 성장 미디어 μL (혼합 1)과 (2) 별도의 14 mL에 1 배 성장 미디어 (혼합 2) 500 μL의 플라스미드를 ICL 함유 TFO 지시 둥근 바닥 튜브 μg의와 형질 전환 시약의 30 μl를 품다 실온. </li><li> 2 믹스로 pipetting 아래로 잘 혼합 믹스 1을 추가합니다. 실온에서 25 ~ 30 분 동안 품어. </li><li> 따뜻한 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 세포의 플레이트에 걸쳐 균등하게 분배 적가 방식으로 형질 전환 혼합물을 추가한다. 접시에 성장 배지 1 ㎖를 추가하고 2 ml의에 최종 볼륨을 가지고. 우리 믹스게요. 4 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C를 인큐베이터에서 배양 플레이트를 놓습니다. </li><li> 10 % FBS와 보충 3 ㎖ 성장 미디어와 미디어를 교체하고 16 시간 동안 더 배양한다. 항생제를 사용하지 마십시오. </li><li> 대략 1 %의 최종 농도로 플레이트 당 신선한 37 % 포름 알데히드의 80 μL로 세포를 처리하고, 빛의 부재하에 실온에서 10 분 동안 배양한다. 주의 : 포름 알데히드는 독성 및 안전 지침에 따라 처리되어야한다. 포름 알데히드의 노출은 피부, 눈과 호흡 기관에 해를 입힐 수 있습니다. </li><li> 접시 당 (시판 키트에 공급) 냉장 글리신의 300 μl를 추가하고 5 분 동안 배양하여 포름 알데히드 가교을 끄다. 용지를 제거하고 차가운 PBS로 두 번 세척 한 후 microcentrifuge 관에 냉장 (4 ℃) PBS 1 ml의 근근이 살아가고에 의해 세포를 수집합니다. 항상 얼음에 샘플을 유지합니다. </li><li> 5 분 a를 4 ℃에서 원심 분리하여 세포 펠렛을 준비탁상 냉장 원심 분리기를 사용하여 13,400 XG에서 t. 피펫 밖으로 뜨는을하고 얼음에 세포 펠렛을 배치합니다. </li><li> 균일 1 ml의 냉장 (4 ℃) 버퍼 A (시판 키트에 공급)에 펠렛을 재현 탁하고 10 분 동안 얼음에 품어. 튜브를 반전 가끔 섞는다. 펠렛 세포 이전 (위의 단계 2.9 참조). </li><li> 균일하게 냉각 한 용액에 펠릿 (4 ° C) 버퍼 B를 (시판 키트에 제공) 재현 탁하고 반전 가끔 믹싱과 10 분 동안 얼음에 품어. 이전 원심 분리하여 펠렛 세포 (위의 단계 2.9 참조). </li><li> 버퍼 B. 냉각 200 μL에 다시 세포를 재현 탁하면 Micrococcal의 클레아 제 (MNase)의 2 μl를 추가하고 10 분 동안 실온에서 품어. 튜브를 쓸어 넘겨 때때로 반응을 섞는다. 얼음에 튜브를 배치하고 40 mM의 EDTA를 첨가하여 MNase 반응을 멈춘다. 펠렛 세포 이전 (위의 단계 2.9 참조). </li><li> 100 ㎕의 1 배 염색질 immunopr에 재현 탁 세포프로테아제 억제제 칵테일로 보충 ecipitation 버퍼 (칩) 버퍼 (시판 키트에 제공). </li><li> 얇은 벽의 microfuge 튜브에 재현 탁 세포를 놓습니다. 얼음에 20 초 동안 배양 한 다음 20 초 동안 물 목욕 초음파기에 그들을 떠하여 샘플을 sonicate하세요. 반복 초음파는 ~ 800-1,200 bp의 단편을 생성하기 위해 9 번 단계를 반복합니다. <ol><li> 초음파 처리 된 샘플 20 μL에 텍싱에 의해 잘 3 ㎕의 5 M NaCl을 1 μL의 RNase A. 믹스를 추가하고 30 분 동안 37 ° C에서 품어. 그 후, 2 μL 테 K를 추가하고 65 ° C에서 2 시간 동안 품어. PCR 정제 키트를 이용하여 시료를 정제. 1 % 아가 로스 겔에서 샘플을 실행하고 EtBr이 함께 시각화. 참고 : 결과 DNA의 최대 강도에서 1,000 bp의 아래에 있어야한다. </li></ol></li><li> 세 개의 튜브에 미리 냉장 실리콘 처리 된 튜브에 해물 30 μl를 추가 한 다음 추가 프로테아제 억제제와 냉장 1 배의 칩 버퍼의 70 μl를 추가합니다. 1 μ 추가각각의 튜브에 안티 - 면역 글로불린 G (IgG를) (양성 대조군으로), 안티 - 히스톤 H3, 또는 안티 HMGB1 항체의 g. 연속 회전 추운 방에서 밤새 품어. </li><li> 균일하게 추운 방에 재현 탁 단백질 G 비즈. 튜브 당 단백질 G 비즈의 4 μl를 추가하고 회전 추운 방에 또 다른 2-4 시간 동안 배양한다. </li><li> 자기 랙을 사용하여 구슬 펠렛과 뜨는을 제거합니다. 펠렛에 프로테아제 억제제 칵테일 혼합 200 μl의 1X 칩 버퍼를 추가하고 회전 추운 방에서 5 분간 씻는다. 두 번 씻어 반복합니다. </li><li> 높은 소금 1 배 칩 버퍼 (70 mM의 NaCl을 함유하는)와 하나의 추가 세척을 수행합니다. </li><li> (시판 키트에 제공됨) 160 ㎕의 용출 완충액으로 펠렛을 재현 탁하고, 30 분 동안 회전하여 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 구슬을 펠렛과 신선한 튜브에 뜨는를 수집합니다. 5 M NaCl을 6 μL와 단백질 분해 효소 K 2 μl를 추가, 65에서 하룻밤 배양기음. </li><li> PCR의 산물 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제하여, 50 μL의 2 O. DH를 사용하여 DNA를 용출 </li><li> PCR에게 관심 영역 (들)에 프라이머 세트를 사용하여 16 반응을 수행하고 EtBr이 물들 1 % 아가 로스 겔에 제품을 해결. </li></ol> 3. 수퍼 코일 분석 및 2 차원 전기 영동 아가로 스겔 <ol><li> DNA 수리 합성 버퍼를 준비한다 (45 mM의 헤 페스-KOH, pH가 7.8, 70 mM의 KCl을 7.4 밀리미터의 MgCl 2, 0.9 mM의 DTT, 0.4 mM의 EDTA, 2 mM의 ATP, 20 μM의 dNTPs, 3.4 % 글리세롤, 18 μg의 소 혈청 알부민) . -80 ° C에서 보관하십시오. 얼음과 이전에 녹여 40 밀리미터 크레아틴 인산 및 2.5 μg의 크레아틴 포스 포 키나제를 추가 사용할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 10 배 수퍼 코일 버퍼 [500 mM 트리스 (산도 8.0), 500 mM의 NaCl을, 25 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 EDTA], 및 저장을 준비합니다. </li><li> 완전히 1X 1 μL 백시 토포 이소 머라 제 I (5-15 U / μL)을 사용하여 수퍼 코일 pSupFG1 플라스미드의 DNA 300 ng의 선형화10 μl의 반응에서 수퍼 코일 버퍼입니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 얼음 헬라 무 세포 추출물 (24)를 해동. 완전히 이완 된 플라스미드로 25 μL 헬라 무 세포 추출물 및 DNA 수선 합성 버퍼에 추가한다. 잘 섞다. 믹스에 백시 니아 토포 이소 머라 제 I의 추가 1 μl를 추가하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) (1 % 최종 농도) 및 프로 티나 제 K (0.25 ㎎ / ㎖ 최종 농도)을 첨가하여 반응을 종료한다. 2 시간 동안 65 ° C에서 품어. </li><li> 1X 트리스 붕산염 EDTA (TBE) 완충액으로 1 % 아가 로스 겔을 전송. DNA 로딩 염료를 추가하고 최소 4 차선 떨어져 겔에 직접 반응을로드합니다. topoisomers를 해결하기 위해 실온에서 1 배 TBE 2 V / cm (차원 1)에 8 ~ 10 시간 동안 젤을 실행합니다. 주 : 트리스 염기 54g을 첨가함으로써 DH 2 O 1 L의 5 배 TBE 원액을 준비한다. 붕산 27.5 g과의 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 ㎖. </li><li> 1 배의이 L 준비3 μg의 / ㎖의 클로로퀸 포스페이트와 TBE. 20 분 동안이 용액 200 ㎖에 젤을 만끽 해보세요. 알루미늄 호일로 겔 트레이를 커버. </li><li> 두 번째 차원의 젤을 electrophorese하려면 시계 방향 방식으로 겔 90 °를 설정하고 양극과 음극 supercoils를 해결하기 위해 1X TBE를 포함 클로로퀸 2 V / cm에서 4-6 시간 동안 실행합니다. </li><li> 로커에 1 시간 동안 EtBr이와 젤을 얼룩. 15 분 동안 DH 2 O로 겔 Destain이어서 이미 저를 사용하여 topoisomers의 열분포를 시각화. </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+protein+1+preferentially+conserves+torsion+in+negatively+supercoiled+DNA.">High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA.</a> Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).</li><li>Betous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TLS+DNA+polymerases+eta+and+kappa+in+processing+naturally+occurring+structured+DNA+in+human+cells.">Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells.</a> Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).</li><li>Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+intrachromosomal+gene+conversion+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+microinjected+into+mouse+cells.">High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).</li><li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells.">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li><li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+number+of+2'-O-(2-aminoethyl)+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides.">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li><li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy.">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li><li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer.">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li></ol>

The authors declare no conflict of interest.

TFO 지시 ICLS의 효율적 형성이 중요한 요인에 따라 달라집니다 : 목표에 TFO의 결합 친화도에 따라 그 대상 DNA의 기판과의 TFO의 배양, 적절한 버퍼 구성 요소 (예를 들어,의 MgCl 2) 첫 번째 시간 (종속 이중 및 농도)를 사용; 둘째, UVA의 적절한 투여 량 (365 ㎚)을 조사 효율적 소라렌 가교 결합을 형성한다. 최적 삼중 형성 HPLC 또는 겔 정제 TFOs를 사용함으로써 달성 될 수있다. TFO 오염 불순...

삼중 나선 구조를 형성하는 1-5 훅 스틴 수소 결합을 통해 서열 - 특이 적 방식으로 올리고 뉴클레오티드 (TFOs) 바인드 듀플렉스 DNA를 플렉스가 형성. 플렉스 기술은 이러한 전사, DNA 손상을 복구하고 유전자 타겟팅 (참고 문헌 6-8에서 검토)와 같은 생체 분자 메커니즘의 다양한 심문 사용되고있다. TFOs는 리포터 플라스미드 9,10-에 부위 - 특이 적 손상을 유도하기 위해 널리 사용되어왔다. 우리의 실험실과 다른 사람은 이전에 플라스미드 pSupFG1 5,10-12에 supF 유전자에 사이트 별 DNA의 interstrand의 가교 (ICLS)을 유도하기 위해 소 랄렌 분자에 닿는 TFO, AG30을 사용하고 있습니다. ICLS 이러한 병변 공유 개의 DNA 가닥 가교로서 매우 독성이며, 수리되지두면 유전자 전사를 차단하고, DNA 복제 장치 (13, 14)을 방해 할 수있다. 때문에 독성 잠재력, ICL 유도 화제는 치료에 항암제로 사용되어왔다암 및 기타 질병 15. 그러나, 인간의 세포에서 ICLS의 처리 및 수리가 잘 이해되지 않습니다. 따라서, 인간 세포에서 ICLS의 처리에 관여하는 메카니즘에 대한 이해는 ICL 계 화학 요법의 효능을 개선하는 데 도움이된다. TFO 유도 ICLS 및 수리 중간체는 DNA의 나선 구조에 상당한 왜곡을 야기 할 가능성이있다. 이러한 왜곡은 정규 B 형 이중 DNA 16-20보다 더 높은 친화력으로 왜곡 된 DNA에 결합 건축 단백질에 대한 가능성이 대상입니다. 여기, 우리는 염색질 면역 (칩) 소 랄렌 교 플라스미드에 대한 분석을 통해 인간의 세포에서 ICLS와 매우 풍부한 건축 단백질 협회, HMGB1을 공부하고 인간의 소 랄렌 가교 플라스미드 DNA의 토폴로지를 변조에 HMGB1의 역할을 확인 암 세포 용 해물. HMGB1은 매우 풍부하고 재하 표현이 아닌 자신의정규 B 형 DNA 17-20보다 더 높은 친화력으로 손상된 DNA와 대안 구조화 된 DNA 기판에 결합 톤 건축 단백질. HMGB1 그러한 전사, DNA 복제 및 DNA 수선 16,21-23 여러 DNA 대사 과정에 관여한다. 우리는 이전에 HMGB1 높은 친 화성 (20)와 체외에서 TFO 지시 ICLS에 결합하는 것을 증명하고있다. 또한, 우리는 HMGB1의 부족 뉴클레오티드 절단 수리 (NER) 보조 인자 (23, 24)로 TFO 지시 ICLS의 돌연변이 처리 및 확인 HMGB1 증가 있음을 증명하고있다. 최근에, 우리는 HMGB1는 인간의 세포에서 TFO 지시 ICLS과 관련된 이러한 병변의 채용은 NER 단백질, XPA (16)에 의존하는 것을 발견했다. DNA의 음의 수퍼 코일은 NER (25)에 의해 DNA 병변의 효율적인 제거를 촉진하기 위해 표시되었습니다, 우리는 HMGB1는 TFO 지시 ICL 함유 플라스틱으로에 우선적으로 부정적인 수퍼 코일을 유도하는 것을 발견했다NER 공동 인자로서 HMGB1의 잠재적 인 역할 (들)에 대한 이해를 제공한다 (비 손상된 플라스미드 기판에 대해) 중간 기판 (16). ICLS의 처리는 완전한 인간 세포에서 알려져 있지 않다; 따라서, 본 명세서에 기재된 분자 도구에 기초한 기술과 개발 분석 차례로 암 화학 요법의 효능을 향상시키기 위해 이용 될 수있는 바와 같이 약물 표적을 제공 할 수있다 ICL 수리에 관련된 추가적인 단백질의 동정을 초래할 수있다. 여기서, 효과적인 방법은 논의 된 아가 로스 겔 전기 영동을 변성하여 플라스미드 DNA의 TFO 지시 ICL 형성의 효율성을 평가. 또한, TFO 지시 ICLS를 포함하는 플라스미드를 사용하는 기술이 설명되었다 변성 칩 어 세이를 이용하여 셀룰러 환경에서 ICL 손상된 플라스미드 HMGB1 연관을 결정한다. 또한, 손쉬운 방법은 제 도입 위상 수정을 공부구체적으로는 인간 세포 용 해물에서 ICL 손상된 플라스미드 기판상의 전자 구조적 단백질 HMGB1은 이차원 아가 로스 겔 전기 영동을 통해 수퍼 코일 분석을 수행함으로써 측정되었다. 설명 된 기술은 인간 세포에서 플라스미드의 타겟 DNA 손상 처리에 DNA 수리 및 구조적 단백질 관여의 이해를 촉진하기 위해 사용될 수있다. 우리는 플라스미드 DNA, 이후 플라스미드 칩 각각 DNA 토폴로지 변경 병변과 연관 단백질 및 단백질을 확인하는 분석을 수퍼 코일에 TFO 지시 부위 특이 랄렌 ICLS의 형성에 대한 상세한 프로토콜을 설명한다. 이러한 분석은 다른 DNA 손상 제, TFOs 플라스미드 기판 및 관심 포유 동물 세포 라인을 수행하도록 변형 될 수있다. 사실, 우리는 적어도 하나의 전위와 친 화성이 높은 고유 TFO 결합 부위는 인간 게놈 26의 모든 주석 유전자 내에 있다는 것을 보여 주었다. 방법우리 케르 및 바스, 2016 (16)에 이용되는 것처럼 지금까지, 명확성을 위해, 우리는 인간 U2OS 세포에서 특정 돌연변이 리포터 플라스미드 (pSupFG1)의 특정 랄렌 공역 TFO (pAG30)의 사용을위한 이러한 기술을 설명했다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;HMT Psoralen-AG30</td>
			<td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>HPLC (or gel) purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit</td>
			<td>Cell signaling Inc.</td>
			<td>9003</td>
			<td>Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td>PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMGB1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Gel and PCR cleanup kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquine-diphosphate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628-50G</td>
			<td>For two-dimensional agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePORTER transfection reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T201015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Topoisomerase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>38042-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blak-Ray long wave ultraviolet lamp</td>
			<td>Upland, CA</td>
			<td>B 100 AP</td>
			<td>UVA lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>EQC-1100</td>
			<td>Water bath sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar filter</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80112939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIO-RAD Chemidoc</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>XRS+ system</td>
			<td>DNA imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>Used for crosslinking&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70013073</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromocresol green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114-359</td>
			<td>DNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized tubes</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td>Low retention microfuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A74-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>InternationalLight Technologies</td>
			<td>ILT1400-A</td>
			<td>UVA dose measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human U2OS osteosarcoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-96</td>
			<td>Cultured according to supplier&#8217;s recommendation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cervical adenocarcinoma HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC-CCL-2</td>
			<td>Cultured according to supplier&#8217;s recommendation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal forward primer</td>
			<td>5&#8242;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal reverse primer</td>
			<td>5&#8242;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distal forward primer</td>
			<td>5&#8242;-aat acc gcg cca cat agc ag</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distal reverse primer</td>
			<td>5&#8242;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tools to study the role of architectural protein hmgb1 in the processing of helix distorting, site-specific dna interstrand crosslinks

높은 이동성 그룹 상자 1 (HMGB1) 단백질은 전사, DNA 복제 및 DNA 수선 등 게놈 많은 중요한 기능을 조절에 관여하는 히스톤 비 구조적 단백질이다. HMGB1은 정식 B-DNA보다 더 높은 친화력과 구조적으로 왜곡 된 DNA에 결합한다. 예를 들어, 우리는 HMGB1은 DNA가 나선의 왜곡을 야기 공유 결합 DNA의 두 가닥을 연결 가교 (ICLS)를 interstrand, 왼쪽 경우 복구되지 않은 세포 사망을 일으킬 수에 결합하는 것을 발견했다. 때문에 자신의 세포 독성 잠재력, 여러 ICL 유도 에이전트는 현재 병원에서 화학 요법 제로서 사용된다. ICL-형성 제는 특정 염기 서열 (예, &#39;- TA-3 5&#39;는 소 랄렌에 대한 선호 가교 사이트)에 대한 환경 설정을 표시하는 동안, 그들은 크게 무차별 방식으로 DNA 손상을 유도한다. 그러나, 공유 결합 서열 - 특이 적으로 DNA에 결합하는 삼중 - 형성 올리고 뉴클레오티드 (TFO)에 ICL 유도제를 연결함으로써방법은 타겟 DNA 손상이 달성 될 수있다. 여기서는 도구로 사용할 돌연변이 리포터 플라스미드의 부위 특이 ICL을 생성하는 공유 8 trimethylpsoralen (HMT) 랄렌 5 &#39;은 4&#39;- 히드 록시 메틸 4,5&#39;말단에 컨쥬 게이션 TFO를 사용 인간의 세포에서 HMGB1에 의해 복잡한 DNA 병변의 건축 변경, 처리 및 수리를 공부합니다. 우리는 실험 기술 리포터 플라스미드에 TFO 지시 ICLS을 준비하고, 염색질 면역 침전 분석법을 사용하여 휴대 맥락에서 TFO 지시 ICLS와 HMGB1의 연결을 심문에 대해 설명합니다. 또, HMGB1 의해 소라렌 가교 플라스미드 도입 superhelical 회전의 양을 측정함으로써 손상된 DNA의 특정 구조적 변형을 평가하기 위해 수퍼 코일 DNA의 분석을 설명한다. 이러한 기술은 TFO 지시 ICLS 또는 관심있는 세포주 다른 타겟 DNA 손상의 복구 처리에 관여하는 다른 단백질의 역할을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

TFO 지시 ICL의 형성은 인간 세포에서 ICL 처리에서의 구조적 단백질의 역할을 심문하는 데 사용되는 플라스미드 기반 분석을 위해 중요하다. 아가 로스 겔 전기 영동을 변성하면 TFO 지시 ICL 형성의 효율성을 결정하기위한 용이 한 방법이다. TFO 지시 ICLS 은닉 플라스미드는 비 - 가교 결합 된 제어 플라스미드 (도 1a, 레인 2)에 비교하여, 아가 로스 겔 매트릭스 <str...

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Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

tools-to-study-role-architectural-protein-hmgb1-processing-helix

Research

JoVE Journal

Genetics

8.2K 조회수.  The University of Texas at Austin. Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein. 

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Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

연구

유전학

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in atherogenesis progression, ischemia, and myocardial infarction. Here we present a methodology of patient genotyping to investigate the post-transcriptional role of the C924T polymorphism (rs4523) situated at the 3&#39; region of the TBXA2 receptor gene. This method relies on DNA extraction from whole blood, polymerase chain reaction (PCR) amplification of the TBXA2 gene portion containing the C924T mutation, and identification of wild type and/or mutant genotypes using a restriction digest analysis, specifically a restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel. In addition, the results were confirmed by sequencing the TBXA2R gene. This method features several potential advantages, such as high efficiency and the rapid identification of the C924T polymorphism by PCR and restriction enzyme analysis. This approach allows a predictive study for plaque formation and atherosclerosis progression by analyzing patient genotypes for the TBXA2R C924T polymorphism. Application of this method has the potential to identify subjects who are more susceptible to atherothrombotic processes, in particular subjects in a high-risk, aspirin-treated group.

In the present study, we describe a methodology to analyze the C924T genotype. The protocol consists of three phases: DNA extraction, amplification by polymerase chain reaction (PCR), and analysis of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel.

Thromboxane A2 수용 체 유전자의 C924T 다형성을 공부 하는 방법

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

비오틴 라벨을 사용하여 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 생체외 생화학 적 분석을 통해

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in regulating gene expression at the post-transcriptional level. Sequencing sRNA libraries by Next Generation Sequencing (NGS) methods has been widely employed to identify and analyze miRNA transcriptomes in the last decade, resulting in a rapid increase of miRNA discovery. However, two major challenges arise in plant miRNA annotation due to increasing depth of sequenced sRNA libraries as well as the size and complexity of plant genomes. First, many other types of sRNAs, in particular, short interfering RNAs (siRNAs) from sRNA libraries, are erroneously annotated as miRNAs by many computational tools. Second, it becomes an extremely time-consuming process for analyzing miRNA transcriptomes in plant species with large and complex genomes. To overcome these challenges, we recently upgraded miRDeep-P (a popular tool for miRNA transcriptome analyses) to miRDeep-P2 (miRDP2 for short) by employing a new filtering strategy, overhauling the scoring algorithm and incorporating newly updated plant miRNA annotation criteria. We tested miRDP2 against sequenced sRNA populations in five representative plants with increasing genomic complexity, including Arabidopsis, rice, tomato, maize and wheat. The results indicate that miRDP2 processed these tasks with very high efficiency. In addition, miRDP2 outperformed other prediction tools regarding sensitivity and accuracy. Taken together, our results demonstrate miRDP2 as a fast and accurate tool for analyzing plant miRNA transcriptomes, therefore a useful tool in helping the community better annotate miRNAs in plants.

A bioinformatics pipeline, namely miRDeep-P2 (miRDP2 for short), with updated plant miRNA criteria and an overhauled algorithm, could accurately and efficiently analyze microRNA transcriptomes in plants, especially for species with complex and large genomes.

식물의 MicroRNA 전사체를 정확하고 효율적으로 분석하는 생물정보학 파이프라인

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...