이 작품은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 캐나다의 [검색 부여 5026 오전]와 암 연구 학회 [오전에 21531]에서 과학자 장학금의 다음 세대에 의해 지원 되었다. 장-프랑수아 Lucier는 통계 분석에 피지 파이썬 스크립트 및 조언의 우수한 품질 관리를 제공 하는 감사 합니다. 우리는 경우 고정 솔루션 제조 법에 대 한 박사 스테파니 A. Yazinski 감사합니다. 우리는 레이저 전력 측정에 대 한 폴 뤼도 Karsenti를 감사합니다.

1입니다. 셀의 사전 민감성
<ol><li>마이크로-방사선 실험 전에 24 h 씨 1 x DMEM 포함 10% FBS 8 잘 문화에서 405 nm 레이저 빛와 우수한 이미징의 극대 투과율을 보장 하기 위해 170 µ m 두께 coverslip 모양의 유리/폴리머 바닥으로 슬라이드에 잘 당 40000 U2OS 셀 레이저 스캐닝과 더불어 confocal 현미경을 거꾸로. 8 잘 microslide를 사용 하는 경우 모든 후속 및 프로토콜의 세척 단계에 대 한 잘 당 미디어 솔루션의 500 µ L을 사용 합니다. 주: 그들의 평면 형태 때문 잘 준수, 그리고 큰 핵, U2OS 세포 촉진 단백질 모집 마이크로 반구 사이트에서의 검색 하지만 필요에 따라 다른 부착 셀 형식을 사용할 수 있습니다. 셀 이상적으로 이어야 한다 약 80%의 수를 늘리기 위해 마이크로 조사 시 confluency 반구 실험 당 세포. 매우 높은 합류 세포 주기9의 S와 G2 단계는 동종 재결합 등 특정 복구 경로 교란 할 수 있다 세포 주기 변경 될 수 있습니다.</li>
	<li>5% CO2, 37 ° C에서 하룻밤 셀을 품 어 그리고 다음 사전 (1.3 단계) 세포를 민감하게 BrdU 또는 (단계 1.4) BBET (Hoechst 33342). 참고: 라이브 모집 관심 (POI) 병 변 DNA 단백질의 관찰, transfect 또는 transduce 셀 시드 후 형광 단백질 및 POI 24 h 사이의 융합을 운반 하는 플라스 미드 DNA. 24 h 이후-transfection/변환, 사전 민감하게 하 고 마이크로 비추는 세포 DNA 손상 사이트에서 실시간으로 POI의 모집 모니터링.</li>
	<li>DSBs 박람회 405 nm 레이저에 의해 생성 된의 수를 증가, 마이크로 조사 이전 24 시간에 대 한 미디어 BrdU의 10 µ M을 추가 합니다. 마이크로-방사선, micropipette를 사용 하 여 앞서 405 nm 레이저 셀의 최대 노출을 보장 하기 위해 페 놀 레드 없이 매체와 두 번 셀 린스.</li>
	<li>또는, 37 ° c.에 셀 문화 인큐베이터에 적절 한 매체에서 10 µ g/mL에서 BBET와 15 분에 대 한 세포 치료 치료 후, 페 놀 레드 마이크로 조사 전에 없이 매체와 두 번 씻어.</li>
</ol>2입니다. 셀의 마이크로-방사선.
<ol><li>적합 한 레이저 스캔 하는 confocal 현미경을 선택 합니다. 참고: 여기에 제시 된 실험 50 mW 405 nm 레이저 라인 및 63 X 1.4 숫자 조리개 오일 목표 현미경 시스템에 수행 했다. DSBs 생성, 세포 했다 마이크로 반구 1 X 1024 x 1024 픽셀/필드 (0.21 µ m/63 X 배율에서 픽셀)에서 검색 줌 8 µs/픽셀에서 단방향 모드에. 레이저 파워 사용 되었고 25 %BBET 및 BrdU-사전-응 셀에 대 한 80% 각각. 사용자가 그들의 시스템을 구성할 수 있도록, 레이저 파워 후 목표 제시 시스템에는 제조업체의 지침에 따라 전원 측정기를 사용 하 여 측정 했다. 2.6에 해당 하는 측정 mW 및 7.0 mW에 BBET 및 BrdU-사전-응 세포, 각각.</li>
	<li>
현미경 및 환경 챔버를 켭니다.
	<ol>
<li>샘플 셀에 불필요 한 스트레스를 방지 하 고 실험에서 균질 DDR 활동 무대 인큐베이터에 배치 됩니다 전에 5% CO2 와 37 ° C에 챔버를 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
잘 분산된 셀과 필드를 선택 하 고, 초점을 조정 경우 프로토콜 후 이미지 수집을 촉진 하기 위하여 그들의 위치를 등록. 마이크로-방사선 조사 후 단백질 모집의 활동을 모니터링 하는 데 사전 손상 기준점 역할을 하는 하나 이상의 이미지를 취득 합니다. 참고: Gridded 문화 혈관 또한 이후 단계에서 세포 마이크로 반구의 현지화를 촉진 하기 위하여 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>IF BBET 표시 된 셀을 사용 하 여, 실험에 대 한 부당한 DNA 손상을 방지 하기 위해 셀을 시각화 하기에 충분 한 최저 레이저 전력에서 405 nm 레이저를 사용 하 여 셀에 초점을 조정 합니다.<ol>
<li>Widefield 형광 램프에서 방출 되는 자외선 조명된 사이트에서 DNA 손상 유도 합니다로 BBET 스테인드 세포에 초점을 조정 하려면 사용 하지 마십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>BrdU 표시 된 셀을 사용 하 여, nucleoli 같은 하위 핵 기능을 보면 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 또는 위상 대조 이미지를 사용 하 여 초점을 조정 합니다.</li>
		<li>붙일 표시 된 Poi를 표현 하는 세포를 사용 하 여 대표 형광 강도 초점 비행기를 선택 합니다. 참고: 강한 overexpression artifactual 지역화 될 수 있습니다 POI의 매우 상부를 표현 하는 셀을 피하십시오. 또한, 대 등 한 수준 (안정적인 클론의 선택이 좋습니다 POI 표현과 채용 수준에 있는 변이 최소화 하기 위해)에서 POI를 표현 하는 셀을 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광-복구를 사용 하 여 시스템의 photobleaching (FRAP) _module 후 마이크로 조사 단계에 대 한 현미경을 구성 합니다. 참고: 때 설정-최대 현미경 시스템 마이크로 방사선 실험은 고려해 야 할 가장 중요 한 매개 변수: 405 nm 레이저, 반복 (즉, 여러 번 레이저 같은 좌표 위에 갈 것 이다)의 출력 전력 픽셀/필드의 숫자 (63 X 확대 및 1 픽셀 1024 x 1024 해상도에서 = 0.21 µ m), 및 픽셀 당 유지 시간. 이러한 모든 요소의 셀 경험 있는 에너지의 양을 영향을 것입니다 하 고 따라서 양과 종류의 DNA 손상 생성된 ( 토론 추가 복용량 최적화 내용은 참조).</li>
	<li>현미경 시스템의 FRAP 모듈을 사용 하 여, 마이크로-비추는 셀. 참고: 대부분의 시스템에서 여러 개의 셀의 마이크로-방사선 수행할 수 있습니다 단일 필드에서 관광 명소 또는 라인/사각형 (일반적으로 1-2 µ m 폭). 붙일 표시 된 단백질의 라이브 이미징 수행할 때 손상 후 즉시, 시간을 마이크로 비추는 각 셀 DDR의 지연된 유도 될 수 있기 때문에 적은 수의 필드 셀에 마이크로 조사를 제한. 이 때 특히 중요 한 단백질 DNA 장애에 매우 빠르게 모집 모니터링.</li>
	<li>
마이크로-방사선 조사 후, 다시 넣어 다 잘 슬라이드 또는 접시 5% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 대 한 샘플을 처리 하기 전에 필요한 기간에 대 한 (부분 5) 라이브 영상과 즉시 진행 또는 (제 3).
	<ol>
<li>첫 번째 단계로 서, 몇 분 이내 및 IF 프로토콜에 대 한 몇 시간 후 조사까지 셀을 수정 합니다. POI, 따라 채용 활동은 달라질 수 있습니다. 일반적으로, DSBs와 SSBs chromatin 연합 되는 단백질 병 변의를 매우 빠르게 지역화 됩니다 하 고 때로는 5 분 이내 제거 된다. SsDNA에서 조립 하는 몇 가지 요인 절제 기계 종사 하고있다 일단 나중 시간 포인트에서 채용 될 고 시간 (참조 그림 1과 참조4) 거기 남아 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 라이브 이미징 붙일 표시 된 단백질의
<ol><li>시간 경과 영상 마이크로 반구 셀의 수행 합니다. 대 한 장애에 매우 신속 하 게 모집 하 고, 프레임 당 몇 초 이상적일 것입니다, 하지만 수집 손상 된 영역에 나중에 (예를 들어, 절제 요인), 지역화 단백질에 대 한 수 있습니다 단백질 고원 달성 될 때까지 모든 1-2 분을 수행. 참고: 가능한 만큼 많이 표백 방지 하 고 피해 사이트에 단백질 모집 채도 신호 부 량을 배제 것이 도달 하지 않는 있도록 이미지 수집을 위한 레이저 힘을 최소화 하 고 후속 분석 (데이터 분석을 참조 섹션 4)입니다. 선물된 시스템에는 영상 63 X와 함께 이루어졌다 / 1.4 오일 객관적인 8 µs/픽셀 유지 시간, 1024 x 1024 해상도, 줌, 배 1과 2의 평균. 참고 이러한 매개 변수는 다른 시스템 및 다른 실험에 대 한 최적화 되어야 할 수 있습니다.</li>
	<li>마이크로-비추는 셀 속도 론 측정까지 추가 필드에 15-30 셀에 대 한 얻을 수 있습니다. 채용 활동의 재현 성과 정확성을 보장 하기 위해 생물 복제에 적어도 3 번 실험을 반복 합니다. 참고:이 프로토콜 특정 confocal 시스템에 적응 하는 경우 유용할 수 있습니다 알려진된 붙일 표시 된 게놈 유지 보수 요인의 모집 활동을 모니터링 하 여 시작 (예, 53BP1-GFP, RPA32-GFP, 등). 라이브 영상 마이크로 방사선 조건 최적화를 사용 하 여 빠르게 여러 매개 변수를 테스트 하는 사용자 수 있게 됩니다.</li>
</ol>4. 모집 활동 분석
<ol><li>피지 이미지 분석 소프트웨어11에서10 의 Microirradiation 분석 플러그인 설치 합니다.</li>
	<li>
피지에서 얻은 이미지를 엽니다. Microirradiation 분석에 있는 풀 다운 플러그인 메뉴에서 "피해 분석기"를 선택 합니다. 각 마이크로 반구 셀에 관심 (ROI) (일반적으로 3 x 3 µ m), 그리고 아닌 방사선 및 방사능 ROIs의 배경 영역을 정의 하 라는 메시지를 따르십시오.
	<ol>
<li>에 잠재적인 편견을 최소화 하기 위해 같은 크기의 사용 ROIs 신호 강도 의미 한다. 획득된 한 이미지에 대 한 마이크로 반구 사이트에서 모집을 모니터링 하는 기준으로 사용 됩니다 적어도 하나의 사전 조사 프레임 포함.</li>
		<li>모든 투자 수익 데이터 전체 시간 경과 시리즈를 통해 수집 된, 일단 플러그인 txt (탭으로 분리) 파일 또는 csv (쉼표로 구분 된 파일)로 결과 포함 하 여 만든 파일을 저장 합니다. 이 파일의 각 시간 지점과 각 ROI (의미 강도, 강도 아닌 의미 반구, 배경과 의미 강도 반구)에 대 한 평균 강도 측정을 포함합니다. 참고: 플러그인 자동으로 배경 강도 뺍니다 (나b) 방사능된 ROIs의 강도에서 (나s)와 반구 비 ROIs (나n). 그것은 또한 photobleaching (Irradiated/비-반구)에 대 한 해결 하기 위해 두 값 (아래 수식 참조) 사이의 비율을 계산 합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57410/57410eq1v2.jpg"> 플러그인은 또한 처음 시간 포인트 (값을 1로 설정) 사이의 모든 정규화 계산 각 핵 (첫 번째 시간을 기준으로 비율)에 대 한 다른 시간 포인트 다. 플러그인 웹사이트10에 추가 정보를 찾을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
모든 마이크로 반구 셀 (이상 15-30)에 대 한 플러그인을 사용 하 여 분석을 수행 하 고 시간이 지남에 마이크로 조사 지역에서 평균 상대 농축 그래프. 각 데이터에 대 한 의미의 표준 오류 가리키고 그들 플롯을 계산 합니다.
	<ol>
<li>학생의 t를 수행 하 여 두 실험 조건 모집 활동 차이 확인-각 데이터 요소에 대 한 테스트.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 프로토콜
<ol><li>
만약 솔루션을 준비 합니다. 사전/사후 extraction 솔루션을 준비 (0.25%를 포함 하는 얼음 처럼 차가운 1 x PBS Triton X-100), 세척 솔루션 (1 x PBS 0.05%를 포함 하 트윈-20), 차단 솔루션 (1 x PBS 3 %BSA 0.05%를 포함 하 트윈-20), 고정 솔루션 (3% + 자당 2 %Paraformaldehyde PBS 1 x) 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에. 참고: 단일 8 잘 microslide, 사전/사후 extraction 솔루션, 세척 솔루션, 차단 솔루션의 10 mL 및 고정 솔루션의 5 mL 50 mL의 10 mL이 필요 합니다.<ol>
<li>고정 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>화학 후드 paraformaldehyde의 15 g와 30 µ L 1 L 삼각 플라스 크에 10 N NaOH의 이중 증 류 물 (ddH2O)의 400 mL를 혼합.</li>
			<li>완전히는 paraformaldehyde solubilize를 교 반 하면서 컨테이너와 자력 핫 플레이트에 65 ° C에서 열을 닫습니다.</li>
			<li>25 mL 피 펫을 사용 하 여, PBS, 저 어, 그리고 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 필터 X 10의 50 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>자당의 10 g를 추가 하 고 500ml ddH2수술 완료</li>
			<li>약 15 mL 원뿔 튜브; 솔루션 수 -20 ° C에서 사용까지 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 x PBS에 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:1,000의 1 mg/mL의 재고 솔루션을 diluting 하 여 솔루션 얼룩 핵을 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>micropipette를 사용 하 여 신중 하 게 다 잘 현미경 슬라이드 또는 격판덮개의 우물에서 미디어를 제거 하 고 즉시 기다리지 않고 두 번 솔루션을 변경 하 여 경우 세척 솔루션의 500 µ L로 씻어. 참고: 여기에 제공 된 IF 데이터 세척 되었고 모든 솔루션의 500 µ L에서 incubated 8 잘 현미경 슬라이드에서 성장 하는 세포를 사용 하 여 얻은 했다. 볼륨은 경험에 의해 사용 되는 세포 문화 컨테이너에 따라 조정 되어야 한다. 또한, 세포 유리/폴리머 바닥에서 쉽게 분리할 수로 주의 경우 프로토콜을 수행 합니다. 모든 솔루션 변경 micropipette를 사용 하 여 셀 손실 최소화.</li>
	<li>사전/사후 extraction 솔루션 및 소용돌이 부드럽게 손으로 15-30 s 사전 추출 하는 경우에 얼음의 500 µ L로 5 분 가장 세포질 단백질 nucleoplasmic를 제거 하 고 chromatin에서 신호를 극대화에 대 한 얼음에 품 어 / DNA 관련 요인입니다.</li>
	<li>만약 세척 솔루션의 500 µ L로 두 번 세척.</li>
	<li>만약 고정 솔루션의 500 µ L에 실 온에서 15 분 동안 품 어. 또는, 미리 만든된 paraformaldehyde 솔루션 (3-4%)를 사용 하 여 고정 단계에 대 한.</li>
	<li>만약 세척 솔루션의 500 µ L로 두 번 세척.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 경우 사전/사후 extraction 솔루션의 500 µ L에 5 분 동안 얼음에 incubate 고 permeabilization 단계를 수행 하기 위해 손으로 부드럽게 슬라이드를 소용돌이.</li>
	<li>만약 세척 솔루션의 500 µ L로 두 번 세척.</li>
	<li>만약 차단 솔루션의 500 µ L 실내 온도에 적어도 30 분을 품 어.</li>
	<li>micropipette를 사용 하 여 차단 솔루션을 제거 하 고 솔루션을 차단에 희석 250 µ L 기본 항으로 4 ° C에서 습도 챔버에 밤새 품 어. 참고: 그것은 공동 지역화의 잠재적인 부작용을 방지 하려면 순차적으로 1 차 항 체를 가진 외피를 수행 하는 것이 좋습니다. 일단 적절 한 컨트롤 수행 되었습니다, 그리고 프로세스 속도를 위해 1 차 항 체를 동시에 품 어.</li>
	<li>4 번 경우 세척 솔루션 부드러운 동요 (60 rpm는 회전자에)의 500 µ L에 5 분 동안 세척.</li>
	<li>이차 항 체 희석 습도 챔버에 차단 솔루션에서의 250 µ L 37 ° C에서 1 시간에 품 어. 참고: 붙일 표시 된 이차 항 체의 추가 따라 빛에서 샘플을 보호 합니다.</li>
	<li>워시 4 회 각각 5 분 동안 500 µ L의 경우 부드러운 동요와 함께 세탁 솔루션에.</li>
	<li>1 µ g/mL DAPI 핵 얼룩을 포함 하는 1 x PBS의 500 µ L에 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>1 x PBS의 500 µ L로 두 번 세척 하 고 셀 이미징에 대 한 PBS 솔루션 x 1의 500 µ L에 두고.</li>
	<li>잘 특징이 DNA 손상 마커를 사용 하 여 마이크로 반구 셀을 찾을 gridded 슬라이드 또는 등록된 단계 위치를 사용 하 여 (예를 들어, γ-H2A.X, RPA32, 등).</li>
	<li>다 잘 문화 슬라이드 또는 레이저 스캔 confocal 현미경에 적절 한 설정을 사용 하 여 모든 관련 채널에 접시 이미지. 참고: 제시 시스템에는 영상으로 이루어졌다 63 X / 1.4 오일 객관적인 8 µs/픽셀 유지 시간, 1024 x 1024 해상도, 줌, 배 1과 2의 평균. 참고 이러한 매개 변수는 다른 시스템 및 다른 실험에 대 한 최적화 되어야 할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+resection+at+DNA+double-strand+breaks+leads+to+de+novo+telomere+formation+and+enhances+gene+targeting.">Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting.</a> PLoS Genetics. 6 (5), (2010).</li><li>Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+double-strand+DNA+break+repair+by+homologous+recombination.">Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).</li><li>Lackner, D. 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W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+endogenous+protein+tagging+for+RESOLFT+super-resolution+microscopy+of+living+human+cells.">CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells.</a> Scientific Reports. 5 (9592), (2015).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+Access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: Access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Dinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+multiple+DNA+repair+pathways+by+sub-nuclear+damage+induction+methods.">Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods.</a> Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).</li><li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells.">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).</li><li>Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Laser+Micro-irradiation+for+Examination+of+Single+and+Double+Strand+Break+Repair+in+Mammalian+Cells.">Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li><li>Mortusewicz, O., Am&#233;, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-regulated+poly(ADP-ribosyl)ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells.">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li><li>Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+a+&#947;H2AX-53BP1+interaction+in+the+DNA+damage+response.">Chemical proteomics reveals a &#947;H2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).</li><li>Soultanakis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+detection+of+8-oxoguanine+in+nuclear+and+mitochondrial+DNA+of+cultured+cells+using+a+recombinant+Fab+and+confocal+scanning+laser+microscopy.">Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).</li></ol>

저자는 공개 없다.

위에서 설명한 방법을 사용 하 여, 405 nm 레이저 마이크로-방사선 사전 BBET 또는 BrdU 응 셀의는 DSBs를 포함 하 여 부착 인간 세포의 핵 내 DNA 변의 지역화 된 세대 수 있습니다. 이러한 DSBs에서 DDR의 활동은 진 핵 세포9,,1819에 다른 방법으로 생성 된 비슷합니다. 마이크로 반구 사이트에서 DSB 절제 리드 ssDNA 세대 RPA32를 대상으로 항...

세포는 DNA 손상의 그들의 게놈 무결성을 위협 하는 내 인 성 및 외 인 소스에 지속적으로 노출 됩니다. DDR 신호 경로 검색 하 고, 신호, DNA 게놈 안정성을 유지 하기 위해 장애 복구의 앙상블입니다. DNA 이중 가닥 틈 (DSBs), DDR 2 무료 플랫폼에서 주로 발생: γ-H2A.X 라는 chromatin와 일반적으로 ssDNA 묶는 복잡 한 RPA1,2코팅 절제 단일 가닥 DNA (ssDNA) 지역.
UV 레이저 마이크로-방사선 사전 티 미 딘 아날로그 5-브로 모-2' deoxyuridine (BrdU) 또는 bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA 염료 감 응 전지의 단일 가닥 나누기 (를 포함 하 여 DNA 변의 혼합물을 만듭니다. SSBs) 및 DSBs chromatin와 ssDNA 플랫폼3,4에 지역화 된 DDR 유도 하. 이전 작품 모집 게놈 DSB에서 이러한 두 가지 플랫폼을 유지 보수 요인의 고 에너지 자외선 레이저 (335-365 nm) 경우2,5와 결합을 사용 하 여 차별 수 있습니다 보여주었다. 높은 에너지 레이저와 전용된 UV-A 전송 목적 405 nm 레이저 confocal 현미경 레이저 스캔 보다 훨씬 덜 학문과 제약 설정에 널리 그들을 만드는 필요한 현미경 같은 레이저 장비는 비용이 많이 드는 라인입니다. 단백질 모집 및 마이크로 반구 사이트에서 exchange의 연구는 또한 게놈 유지 보수 요인의 동적 동작을 설명 하는 데 필요한 힘 드는 수동 이미지 분석에 의해 배제 됩니다.
여기, 우리가 BrdU 또는 BBET 핵 산 얼룩과 셀의 사전 sensitization 마이크로 방사선 일반적인 confocal 현미경에 405 nm 레이저 수 게놈 DNA 병 변에서 유지 보수 요소 역학의 모니터링을 사용 하 여 다음을 보여줍니다. 향상 된 해상도 대 한 필드와 deconvolution의 큰 깊이 z 스태킹 함께 플랫폼 마커로 γ-H2A.X 또는 RPA 복잡 한 소 단위를 사용 하면 차별 요소는 로컬로 채용 DSBs 그 확산 실험 초기 병 변 주변 대형 chromatin 도메인입니다. 명료한 내 핵 구획에 따라 하위이 분류 마이크로 반구 사이트에 보충 하는 새롭거나 단백질의 잠재적인 역할을 수정 하는 데 도움이 됩니다. 또한, 편리한 프로토콜을 제공 하며 빠르게 오픈-소스 소프트웨어 피지 (ImageJ 배포)6,,78을 사용 하 여 게놈 유지 보수 요인의 역학을 분석 하는 파이프라인 최적화. 현재 마이크로 조사 방법에이 수정이 가능한 거의 모든 실험실 설정에서 DDR의 연구를 렌더링합니다.

<table><tbody><tr><td>Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV3000 software (version 2.1)</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>405 nm laser</td><td>Coherent</td><td></td><td>Radiation source</td></tr><tr><td>Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1</td><td>Okolab</td><td>OKO-UNO-1</td><td></td></tr><tr><td>60X /1.4 Objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>Oil immersion objective</td></tr><tr><td>8-well culture slides on coverglass (X-well)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6190.802</td><td></td></tr><tr><td>U2OS osteosarcoma human cell line</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Stable cell lines&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Caution toxic</td></tr><tr><td>5-bromo-2&amp;prime;-deoxyuridine&amp;nbsp;(BrdU)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59-14-3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Caution toxic</td></tr><tr><td>Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.1%&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>TRX777.100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME transfection reagent&amp;nbsp;</td><td>Polyplus</td><td>114-07</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X, + phenol red</td><td>Wisent&amp;nbsp;</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X, - phenol red</td><td>Wisent</td><td>319-051-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Wisent&amp;nbsp;</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-RPA32 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab2175</td><td>1:500 for IF</td></tr><tr><td>Rabbit anti-&amp;gamma;-H2A.X antibody</td><td>Cell Signaling&amp;nbsp;</td><td>9718S</td><td>1:500 for IF</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-53BP1 antibody</td><td>Cell Signaling&amp;nbsp;</td><td>4937S</td><td>1:500 for IF</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-PRP19 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab27692</td><td>1:500 for IF</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647</td><td>Cell Signaling&amp;nbsp;</td><td>4414S</td><td>1:250 for IF</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse&amp;nbsp; IgG Alexa Fluor 488&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling&amp;nbsp;</td><td>4408S</td><td>1:250 for IF</td></tr><tr><td>Fiji image analysis open-source software&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc</td></tr><tr><td>1918-K Power meter&amp;nbsp; with a 918D-SL-0D3 sensor</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigation of protein recruitment to dna lesions using 405 nm laser micro-irradiation

DNA 손상 응답 (DDR) 사용 하 여 단백질의 과다 검출, 신호, 및 DNA 장애 복구. 이 응답을 묘사 하는 것이 게놈 유지 관리 메커니즘을 이해 중요 합니다. 모집 및 병 변에서 단백질의 교류는 매우 동적, 이후 자신의 연구 신속 하 고 공간 구분 방식으로 DNA 손상을 생성 하는 기능을 필요 합니다. 여기, 우리는 로컬로 사용 하 여 일반적으로 사용 가능한 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 라인을 갖춘 인간 세포에 DNA 손상을 유도 하는 절차를 설명 합니다. 레이저 줄무늬에서 면역 형광 검사 (IF) 또는 실시간으로 평가 될 수 있다 게놈 정비의 축적 단백질 형광 기자와 태그를 사용 합니다. Phosphorylated 히스톤 H2A를 사용 하 여. (Γ-H2A.X) X 복제 단백질 A (RPA) 표식, 메서드를 인접 chromatin에서 확산에서 로컬로 보충 요인 차별을 충분 한 해상도 제공 합니다. 우리는 더 효율적으로 DNA에서 단백질 relocalization의 활동을 모니터링에 ImageJ 기반 스크립트 손상 사이트 제공 합니다. 이러한 상세는 크게 DDR 역학의 연구를 단순화합니다.

마이크로-방사선, 다음 세포 게놈 정비 단백질1,12의 특성에 따라 특정 기간 동안 복구할 수 있습니다. DSBs는 RPA 및 다른 게놈 유지 보수 요인9급속 하 게 코팅 되어 있는 ssDNA의 제한 된 영역을 만드는 세포 주기의 S와 G2 단계 nucleases에 의해 가장 광대 하 게 처리 됩니다. SsDNA 지역이 광범위 하 게 모집 및 다른 DDR ...

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Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

investigation-protein-recruitment-to-dna-lesions-using-405-nm-laser

Research

JoVE Journal

Genetics

9.4K 조회수.  Université de Sherbrooke. DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.

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RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

각막 상피 ​​창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

연구

유전학

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, such as transcription, DNA replication, and DNA repair. HMGB1 binds to structurally distorted DNA with higher affinity than to canonical B-DNA. For example, we found that HMGB1 binds to DNA interstrand crosslinks (ICLs), which covalently link the two strands of the DNA, cause distortion of the helix, and if left unrepaired can cause cell death. Due to their cytotoxic potential, several ICL-inducing agents are currently used as chemotherapeutic agents in the clinic. While ICL-forming agents show preferences for certain base sequences (e.g., 5&#39;-TA-3&#39; is the preferred crosslinking site for psoralen), they largely induce DNA damage in an indiscriminate fashion. However, by covalently coupling the ICL-inducing agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO), which binds to DNA in a sequence-specific manner, targeted DNA damage can be achieved. Here, we use a TFO covalently conjugated on the 5&#39; end to a 4&#39;-hydroxymethyl-4,5&#39;,8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen to generate a site-specific ICL on a mutation-reporter plasmid to use as a tool to study the architectural modification, processing, and repair of complex DNA lesions by HMGB1 in human cells. We describe experimental techniques to prepare TFO-directed ICLs on reporter plasmids, and to interrogate the association of HMGB1 with the TFO-directed ICLs in a cellular context using chromatin immunoprecipitation assays. In addition, we describe DNA supercoiling assays to assess specific architectural modification of the damaged DNA by measuring the amount of superhelical turns introduced on the psoralen-crosslinked plasmid by HMGB1. These techniques can be used to study the roles of other proteins involved in the processing and repair of TFO-directed ICLs or other targeted DNA damage in any cell line of interest.

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

암 연구학

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this characteristic, Cpf1 has been used for the establishment of a DNA assembly standard called C-Brick, which has the advantage of long recognition sites and short scars. On a standard C-Brick vector, there are four Cpf1 recognition sites &#8211; the prefix (T1 and T2 sites) and the suffix (T3 and T4 sites) &#8211; flanking biological DNA parts. The cleavage of T2 and T3 sites produces complementary sticky ends, which allow for the assembly of DNA parts with T2 and T3 sites. Meanwhile, a short &#34;GGATCC&#34; scar is generated between parts after assembly. As the newly formed plasmid once again contains the four Cpf1 cleavage sites, the method allows for the iterative assembly of DNA parts, which is similar to those of BioBrick and BglBrick standards. A procedure outlining the use of the C-Brick standard to assemble DNA parts is described here. The C-Brick standard can be widely used by scientists, graduate and undergraduate students, and even amateurs.

CRISPR-associated protein Cpf1 can be guided by a specially designed CRISPR RNA (crRNA) to cleave double-stranded DNA at desired sites, generating sticky ends. Based on this characteristic, a DNA assembly standard (C-Brick) was established, and a protocol detailing its use is described here.

Cpf1을 이용한 C-Brick DNA 표준 어셈블리 프로토콜

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

생화학

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

생물학

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both endogenous and exogenous sources such as metabolic activities or UV radiation. Without DNA repair, the cell's genetic code becomes compromised, undermining the structures and functions of proteins and potentially causing disease. 
Understanding the spatiotemporal dynamics of the different DNA repair pathways in various cell cycle phases is crucial in the field of DNA damage repair. Current fluorescent microscopy techniques provide great tools to measure the recruitment kinetics of different repair proteins after DNA damage induction. DNA synthesis during the S phase of the cell cycle is a peculiar point in cell fate regarding DNA repair. It provides a unique window to screen the entire genome for mistakes. At the same time, DNA synthesis errors also pose a threat to DNA integrity that is not encountered in non-dividing cells. Therefore, DNA repair processes differ significantly in S phase as compared to other phases of the cell cycle, and those differences are poorly understood. 
The following protocol describes the preparation of cell lines and the measurement of dynamics of DNA repair proteins in S phase at locally induced DNA damage sites, using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Tagged PCNA (with mPlum) is used as a cell cycle marker combined with an AcGFP-labeled repair protein of interest (i.e., EXO1b) to measure the DNA damage recruitment in S phase.

This protocol describes a non-invasive method to efficiently identify S-phase cells for downstream microscopy studies, such as measuring DNA repair protein recruitment by laser micro-irradiation.

S 단계 동안 DNA 모집을 연구하는 레이저 미세 조사

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

각막 상피 창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

Cpf1을 이용한 C-Brick DNA 표준 어셈블리 프로토콜

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

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