We are grateful to Drs. Mike S. Brown and Joseph L. Goldstein for their agreement to publish this method according to the methods described in their publications. We appreciate Dr. Peter Espenshade for sharing the GFP-SCAP plasmid. This work was supported by NIH grants NS072838 and NS079701 to D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM to D.G., and OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship to C.C. We also appreciate the support from the Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) and OSUCCC Translational Therapeutic Program seed grant and start-up funds to D.G.

인간의 세포 1. 검색 내생의 SCAP 단백질 <ol><li> 세포 배양 및 치료 <ol><li> 시드 ~ 1 × 106 U87의 5 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)와 10cm 접시에 세포는 처리 전 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)로 한번 세포를 세척 한 다음 12 시간 동안 (5 mM)을하거나하지 않고 새로운 글루코스 DMEM 배지에 세포를 전환. </li></ol></li><li> 세포 막 분수 및 핵 추출물의 제조 <ol><li> 세척 세포는 한 번 PBS로 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에 1 ml의 PBS로 긁어, 원심 분리기. </li><li> 된 10 mM HEPES-KOH (PH 7.6), 10 mM의 KCl을 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나트륨 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1 mM의 나트륨 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산 (EGTA), 250 mM의 함유 빙냉 완충액에서 재현 탁 셀 수 크로스, 및 프로테아제 억제제의 혼합물 (5 μg / ㎖ 펩 스타틴 A, 10 μg의 / ㎖ 류 펩틴, 0.5 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 및 25 μg의 / ㎖ N 아세틸 레우-의 Leu-Norleu-AL 30 분 (ALLN)) 얼음 에다가요. </li><li> 핵을 분리하는 5 분 동안 4 ° C에서 890 XG에 22 G의 X를 통해 1 1/2 바늘 30 회 원심 분리기를 세포 추출물을 전달합니다. </li><li> 막 분획 (단계 1.2.7)의 분리 상층 액을 사용합니다. 버퍼 C (20 mM의 HEPES / KOH pH를 7.6, 0.42 M의 NaCl, 2.5 % (v / v) 글리세롤, 0.1 ml의 핵 펠렛을 재현 탁 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나트륨 EDTA, 1 mM의 나트륨 EGTA 및 혼합물 단백질 분해 효소 억제제 (5 μg의 / ㎖ 펩 스타틴 A, 10 μg의 / ㎖ 류 펩틴, 0.5 mM의 PMSF, 1 mM의 DTT, 25 μg의 / ㎖ ALLN)). </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안의 microcentrifuge에 20,000 XG에서 60 분 원심 분리기 4 ° C에서 정지를 돌립니다. 상청액 &quot;핵 추출물&quot;로 지정된다. </li><li> (5 배 로딩 버퍼 10 분 (31)를 100 ° C에서 핵 추출물을 가열SDS-PAGE를 실시하기 전에 2.5 mM 트리스 - 염산의 pH 6.8, 10 % SDS, 50 % 글리세롤, 12.5 %의 β-머 캅토 에탄올, 청색 0.05 % 브로 모 페놀). </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 20,000 XG에서 원래 890 XG에 스핀에서 뜨는을 원심 분리기. 후속 웨스턴 블롯 분석을 위해, 0.1 SDS 용해 완충액 (10 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 100 mM의 염화나트륨, 1 % (v / v)의 소듐 도데 실 설페이트 (SDS), 1 mM 나트륨 EDTA ml의 1의 펠릿을 용해 mM의 나트륨 EGTA). 이것은 &quot;막 분수&quot;지정됩니다. 참고 : 우리는 막 펠렛 20,000 XG에 20 분을 사용합니다. 10 10 XG - 20 분은 브라운과 골드 스타 인 연구소 (15)로부터 논문에 사용되어왔다. </li><li> 30 분 동안 37 ° C의 막 분획을 부화 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석에 의해 단백질 농도를 결정한다. SDS-PAGE에 샘플을 실시하기 전에 1 ㎕의 100 배 브로 모 페놀 블루 솔루션을 추가합니다. </li><li> 10 % SDS-PAGE 겔 (39)의 전체 막 단백질 50 μg의 -로드 (25). 젤을 실행80 V에서 15 분 동안, 다음 130 V로 변경하고 다른 115 분 동안 실행합니다. 130 분 39 140mA에서 전송합니다. <ol><li> 웨스턴 블롯 분석을 위해, 전체 SCAP 단백질을 검출하기 위해 항 SCAP 항체를 사용한다. 내부 통제로, 단백질 이황화 이성화 효소 (PDI), 응급실 상주 단백질 (40)를 사용합니다. SREBP-1의 N 말단 대역을 검출하도록 안티 SREBP-1 항체를 사용한다. 핵 추출물 (31)에 대한 내부 통제로 라민를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 인간의 세포 2. 분석 SCAP의 N의 -glycosylation <ol><li> 세포 배양, 형질 및 치료 <ol><li> 멤브레인 분석을 위해, DMEM와 10cm 접시 시드 ~ 1 × 106 HEK293T 세포는 5 % FBS로 보충하고 형질 감염 전 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %. </li><li> 혈청 배지를 감소 1 ml의 8 μg의 GFP-SCAP 플라스미드 (박사 피터 Espenshade의 선물) (22) 부드럽게 혼합 - 4 희석. </li><li> 플라스미드를 포함하는 혈청 배지를 감소 1ml를 직접 피펫 팅하여 16 μl의 DNA 형질 전환 시약 부드럽게 혼합 - 8을 추가합니다. </li><li> 실온에서 25 분 동안 형질 감염 시약 / 플라스미드 복합체 인큐베이션. </li><li> 신선한 매체와 세포에 형질 단지를 추가하고 5 % CO 2, 37 ℃에서 24 시간 동안 문화를 계속합니다. </li><li> PBS로 한번 세척하고 또는 tunicamycin (1 μg의 / ㎖)는 N -glycosylation 억제제의 존재 또는 부재하에 글루코스 (5 mM)을하지 않고 12 시간 동안 세포를 처리한다. </li></ol></li><li> 단계 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3 및 1.2.7에 설명 된대로 세포막 알약을 준비합니다. </li><li> SCAP의 N의 -glycosylation의 검출 <ol><li> 트립신 단백질 분해 <ol><li> 10 mM의 HEPES · KOH (PH 7.4), 10 mM의 KCl을 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나트륨 EDTA, 100 mM의 NaCl을 함유하는 완충액 114 μL에 GFP-SCAP 과발현 세포 막 펠렛을 재현 탁. </li><li> 57 품어81에서 30 ° C에서 30 분 동안 58 μl의 총 부피의 부재 또는 트립신 1 μL (1 μg의 / μL)의 존재 하에서 막 단백질의 리터 씩. </li><li> 대두 트립신 억제제 2 μL (400 부)을 첨가하여 반응을 중지. </li></ol></li><li> 펩티드 - N- 글리코시다 제 F에 의한 탈 글리코 실화 (MALDI 스펙트럼은 PNGase F) <ol><li> MALDI 스펙트럼은 PNGase F 후속 처리에 대해서는 3.5 % (중량 / 부피) SDS 7 % (부피 / 부피)를 포함하는 용액 10 ㎕를 각 샘플에 2- 머 캅토 에탄올을 추가합니다. </li><li> 10 분 동안 100 ℃에서 가열 한 후, 연속적으로 0.5 M 인산 나트륨 (PH 7.5), 10 % (v / v)의 Nonidet 12 × 프로테아제 억제제와 P-40, 2 μL 7 μL 7 μL (0.5 U 추가 MALDI 스펙트럼은 PNGase F.의 / μL) </li><li> 3 시간 동안 37 ° C에서 배양 한 후, 5 배 로딩 완충액 (312.5 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 10 % SDS, 50 % 글리세롤, 12.5 %의 β 머 캅토 에탄올, 0.05 % 브로 모 페놀 블루)를 첨가하여 반응을 중지. 10m 100 ° C의 혼합물을 가열및 SDS-PAGE에 따라. 10 % SDS-PAGE 겔 (39)의 총 멤브레인 단백질의 25-50 μg의로드. 다음 다른 115 분 동안 130 V로 변경, 15 분 동안 80 V에서 젤을 실행합니다. 130 분 동안 140mA에서 전송합니다. </li><li> 웨스턴 블롯를 들어, N의 -glycosylation 총 SCAP 단백질을 검출하기 위해 10 μg의 / ㎖ 방지 SCAP (9D5) 항체를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 인간의 세포에서 GFP-SCAP를 사용하여 검출 골지에 ER에서 SCAP 인신 매매의 (3) <ol><li> DMEM와 60mm 접시 시드 2.5 × 105 U87 세포는 5 % FBS로 보충하고 형질 감염 전 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %. </li><li> 0.5 ml의 4 μg의 GFP-SCAP 플라스미드 감소 혈청 배지를 희석 혼합한다. </li><li> 직접으로 0.5 ml의에게 플라스미드를 포함하는 감소 된 혈청 배지를 피펫 팅에 의해 8 μl의 DNA 형질 전환 시약을 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 방에서 25 분 동안 형질 전환 시약 / 플라스미드 복합체를 품다온도. </li><li> 신선한 매체와 세포에 형질 단지를 추가하고 5 % CO 2, 37 ℃에서 24 시간 동안 문화를 계속합니다. </li><li> 유리 커버 슬립 (22mm × 22mm)를 포함하는 6 웰 플레이트에 10 × 10 4 세포와 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 문화를 계속 - 5 시드. </li><li> PBS로 한번 세척하고 또는 tunicamycin (1 μg의 / ㎖)의 존재 또는 부재하에 글루코스 (5 mM)을하지 않고 12 시간 동안 세포를 처리한다. </li><li> PBS로 한 번 세포를 씻으 10 분 동안 4 % 포름 알데히드에 고정합니다. </li><li> 의 커버 슬립을 반전, PBS로 세포를 세 번 씻으 antifade 시약과 함께 슬라이드에 장착하고, 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 밀봉. </li><li> 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (41)의 63X 기름 침지 목표를 사용하여 GFP-SCAP 거래를 확인합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metabolism+of+malignant+gliomas.">Tumor metabolism of malignant gliomas.</a> Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).</li><li>Moon, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Scap/SREBP+pathway+is+essential+for+developing+diabetic+fatty+liver+and+carbohydrate-induced+hypertriglyceridemia+in+animals.">The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals.</a> Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).</li><li>Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+emerges+as+a+promising+target+for+malignant+glioma+therapy.">Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy.</a> CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).</li><li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPK+agonist+AICAR+inhibits+the+growth+of+EGFRvIII-expressing+glioblastomas+by+inhibiting+lipogenesis.">The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).</li><li>Menendez, J. A., Lupu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+synthase+and+the+lipogenic+phenotype+in+cancer+pathogenesis.">Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis.</a> Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).</li><li>Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK:+A+metabolic+checkpoint+that+regulates+the+growth+of+EGFR+activated+glioblastomas.">AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas.</a> Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).</li><li>Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+sensors+for+membrane+sterols.">Protein sensors for membrane sterols.</a> Cell. 124, 35-46 (2006).</li><li>Shao, W., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+Roles+for+SREBP+in+Metabolism.">Expanding Roles for SREBP in Metabolism.</a> Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).</li><li>Nohturfft, A., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+lipid+metabolism+in+membrane+biogenesis.">Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).</li><li>Jeon, T. I., Osborne, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SREBPs:+metabolic+integrators+in+physiology+and+metabolism.">SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).</li><li>Sato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+the+membrane+attachment,+DNA+binding,+and+transcriptional+activation+domains+of+sterol+regulatory+element-binding+protein-1+(SREBP-1).">Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1).</a> The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).</li><li>Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins+(SREBPs)+at+site-1+requires+interaction+with+SREBP+cleavage-activating+protein.+Evidence+from+in+vivo+competition+studies.">Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies.</a> The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).</li><li>Sakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+complexes+between+the+COOH-terminal+domains+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins+(SREBPs)+and+SREBP+cleavage-activating+protein.">Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).</li><li>Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol+resistance+in+CHO+cells+traced+to+point+mutation+in+SREBP+cleavage-activating+protein.">Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein.</a> Cell. 87, 415-426 (1996).</li><li>Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+SREBP+cleavage-activating+protein,+a+polytopic+membrane+protein+with+a+sterol-sensing+domain.">Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain.</a> The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).</li><li>Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+G-to-A+substitution+in+a+single+codon+of+SREBP+cleavage-activating+protein+causes+sterol+resistance+in+three+mutant+Chinese+hamster+ovary+cell+lines.">Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).</li><li>Espenshade, P. J., Hughes, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+sterol+synthesis+in+eukaryotes.">Regulation of sterol synthesis in eukaryotes.</a> Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+step+in+cholesterol+homeostasis:+sterols+promote+binding+of+SCAP+to+INSIG-1,+a+membrane+protein+that+facilitates+retention+of+SREBPs+in+ER.">Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER.</a> Cell. 110, 489-500 (2002).</li><li>Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insig-2,+a+second+endoplasmic+reticulum+protein+that+binds+SCAP+and+blocks+export+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins.">Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).</li><li>Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+mutations+in+sterol-sensing+domain+of+SCAP+block+interaction+with+insig+and+render+SREBP+cleavage+insensitive+to+sterols.">Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).</li><li>Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterols+block+binding+of+COPII+proteins+to+SCAP,+thereby+controlling+SCAP+sorting+in+ER.">Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).</li><li>Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+step+in+cholesterol+feedback+localized+to+budding+of+SCAP+from+ER+membranes.">Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes.</a> Cell. 102, 315-323 (2000).</li><li>Sakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterol-regulated+release+of+SREBP-2+from+cell+membranes+requires+two+sequential+cleavages,+one+within+a+transmembrane+segment.">Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment.</a> Cell. 85, 1037-1046 (1996).</li><li>Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SREBP-1,+a+membrane-bound+transcription+factor+released+by+sterol-regulated+proteolysis.">SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis.</a> Cell. 77, 53-62 (1994).</li><li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteolytic+pathway+that+controls+the+cholesterol+content+of+membranes,+cells,+and+blood.">A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).</li><li>Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+to+cleave+sterol+regulatory+element-binding+proteins+(SREBPs)+causes+cholesterol+auxotrophy+in+Chinese+hamster+ovary+cells+with+genetic+absence+of+SREBP+cleavage-activating+protein.">Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein.</a> J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).</li><li>Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+topology+of+S2P,+a+protein+required+for+intramembranous+cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins.">Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins.</a> J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).</li><li>Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Century+of+Cholesterol+and+Coronaries:+From+Plaques+to+Genes+to+Statins.">A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins.</a> Cell. 161, 161-172 (2015).</li><li>Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocatalytic+processing+of+site-1+protease+removes+propeptide+and+permits+cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins.">Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).</li><li>Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCAP+links+glucose+to+lipid+metabolism+in+cancer+cells.">SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells.</a> Mol Cell Oncol. 3, (2016).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-Mediated+N-glycosylation+of+SCAP+Is+Essential+for+SREBP-1+Activation+and+Tumor+Growth.">Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth.</a> Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).</li><li>Shao, W., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+Makes+Fat+by+Talking+to+SCAP.">Sugar Makes Fat by Talking to SCAP.</a> Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).</li><li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+signaling+through+an+Akt-SREBP-1-dependent,+rapamycin-resistant+pathway+sensitizes+glioblastomas+to+antilipogenic+therapy.">EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy.</a> Sci Signal. 2, 82 (2009).</li><li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+LXR+agonist+promotes+GBM+cell+death+through+inhibition+of+an+EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent+pathway.">An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway.</a> Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).</li><li>Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+SREBP-1-driven+lipid+metabolism+to+treat+cancer.">Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer.</a> Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).</li><li>Bell, E. H., Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+for+malignant+gliomas.">Biomarkers for malignant gliomas.</a> Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).</li><li>Geng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SOAT1+suppresses+glioblastoma+growth+via+blocking+SREBP-1-mediated+lipogenesis.">Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis.</a> Clin Cancer Res. , (2016).</li><li>Ru, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+Loop+Regulation+of+SCAP/SREBP-1+by+miR-29+Modulates+EGFR+Signaling-Driven+Glioblastoma+Growth.">Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth.</a> Cell Rep. , (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Uehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-nitrosylated+protein-disulphide+isomerase+links+protein+misfolding+to+neurodegeneration.">S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration.</a> Nature. 441, 513-517 (2006).</li><li>Miyashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+for+intracellular+co-localization+of+proteins.">Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins.</a> Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).</li><li>Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+extracellular+signaling+utilizing+a+glycoproteomic+approach:+lectin+blot+surveys,+a+first+and+important+step.">Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step.</a> Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

본 연구는 인간 세포의 막 분획을 분리과 웨스턴 블롯을 이용하여 SCAP의 N의 -glycosylation 총 단백질의 검출을위한 시료의 준비를위한 프로토콜을 설명한다. 우리는 더 GFP - 라벨 및 공 초점 현미경을 사용하여 SCAP 거래를 모니터링하는 방법을 제공한다. 이 방법은 구체적으로는, 막 단백질을 분석하는데 사용 된 N SCAP -glycosylation 및 피킹을 조사하기위한 중요한 도구이다. 다른 N -glycan 사슬을 인식하고 N을 -glycosylated 단백질 (42)을 식별하기 위해 각종 렉틴을 사용하는 방법과 비교하여, 여기에 설명 된 우리의 방법은 SCAP 단백질 단편의 당화를 식별 이주 시프트 단백질 - 결합 N은 -glycan 제거 MALDI 스펙트럼은 PNGase F를 사용하고, 검출 AA 540-707. 렉틴 방법의 한계는 특정 인식하는 렉틴의 적절한 유형의 식별에 의존 <em&gt; N은 -glycan. 우리의 MALDI 스펙트럼은 PNGase F 절단 방법은 SCAP N의 -glycosylation를 분석하는 간단한 절차를 제공합니다. 또한,이 방법은 또한 2 균질화 후에 인간 환자 또는 동물의 조직에 SCAP의 -glycosylation N 단백질의 수준을 분석하기 위해 적용될 수있다. 우리의 연구는 암과 대사성 질환에서 지질 대사의 서명을 분석 할 수있는 새로운 도구를 제공합니다. 본 연구에서는 인간의 세포에서 N의 -glycosylation 및 인신 매매의 분석에 사용 GFP 표지 SCAP의 플라스미드는 햄스터 기원합니다. SCAP 단백질 540-707 단편 만 단백질 및 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (15)에서와 같이 햄스터 SCAP의 N의 -glycosylation를 검출 할 수있는 아미노산에 대해 발생되는 SCAP 항체 (IgG의-9D5). 아미노산에 대한 항체는 450 -도 1에 나타낸 바와 같이 인간 SCAP (500)의 인간 세포에서 내인성 SCAP 단백질을 검출 할 수있다 SCAP N의 -glyco를 검출.인간 SCAP (707)의 단편 - 인간 세포 또는 조직에 sylation, 우리는 아미노산에 대해 (540), 특정 항체를 개발할 필요가있다. 또한, 특정 렉틴의 확인은 결합 된 N SCAP는 SCAP -glycan 인간 N -glycosylation (42)을 분석하는 다른 방법을 인식한다. 또한, SCAP 바인딩 각 N -glycan 체인의 구성과 구조를 정의 (N263, N590과 N641)은 골지체로 ER에서 SCAP 인신 매매의 기본 메커니즘에 대한 우리의 이해를 촉진 할 것이다. 또한, N의 SCAP -glycosylation의 검출을위한 최적의 결과를 얻기 위해, 우리는 브라운 및 골드 스타 인 연구소 (15)로부터 공보에 기재된 방법에서 변형 된 우리의 실험 조건에 따라 약간의 반응 매개 변수를 조절. 성공적 SCAP 단백질과 N의 -glycosylation를 검출하기 위해, 막 분획과 핵 추출물의 품질이 매우 중요. 우리는 직접 얼음 위로 시료를 넣어 회피 37 ° C에서 배양 막 분획 후, 단백질 농도를 결정 하였다. 여기에 기재된 방법은 널리 암, 심혈관 질환, 당뇨병, 비만 연구를 포함한 다양한 분야에 적용될 수있다.

지질 대사의 규제 완화는 암과 대사성 질환 1-6의 일반적인 특성이다. 이러한 프로세스에서, 스테롤 조절 요소 결합 단백질 (SREBPs) 전사 인자의 계열은 흡수 및 콜레스테롤, 지방산의 합성 및 인지질 7-10에 중요한 유전자의 발현을 조절하는 중요한 역할을한다. SREBP-1a에서, SREBP-1C 및 SREBP-2를 포함 SREBPs는 두 개의 횡단 도메인 (7)의 미덕에 의해 소포체 (ER) 막에 결합 비활성 전구체로 합성된다. SREBPs의 N 말단이 표적 유전자 (11)의 전이 활성화를위한 DNA 결합 도메인이 포함되어 있습니다. SREBP 전구체의 C- 말단 절단 SREBP-활성화 단백질 (SCAP) (12, 13), SREBP 안정성 14-16 활성의 조절에 중추적 인 역할을하는 polytopic 막 단백질에 결합한다. implemen전사 기능 테이션은 두 단백질 분해 효소가 순차적으로 SREBP을 절단하고 지방을 생성하는 유전자 (7)의 전이 활성화의 핵으로 들어간다는 N- 말단 단편을 해제 골지에 응급실에서 SCAP / SREBP 복합체의 전위가 필요합니다. 이 과정에서, ER 막에 스테롤의 수준은 ER 7,17에서 SCAP / SREBP 복합체의 종료를 제어 할 수 있습니다. 높은 스테롤 조건 스테롤은 SCAP 또는 ER 상주 결합 인슐린 - 유도 유전자 단백질 -1 (Insig-1) 또는 -2 (Insig-2)에서 SCAP / SREBP 착체를 보유 Insigs으로 SCAP의 연결을 강화 ER 18 ~ 20. 스테롤 수치가 감소하면, SCAP는 Insigs로 해리. 이것은 일반적인 코트 단백질 (COP) II 단지와 SCAP 상호 작용을 할 수있는 SCAP 구조적 변화로 이어집니다. 복잡한 신진 소포로 SCAP / SREBP 복합체의 결합을 매개하고 골지 (21, 22)에 ER에서의 전송을 지시합니다. transloc시골지에 ATION, SREBPs 순차적으로 N 말단 7,23-29의 출시로 이어지는 사이트 1 및 사이트-2 단백질 분해 효소에 의해 분해된다. SCAP 단백질 N은 아스파라긴에 올리고당을 -linked 세 운반 (N)는 N263, N590과 N641 (15)를 배치합니다. 우리는 최근이 사이트에서 SCAP의 포도당 매개 N의 -glycosylation 낮은 스테롤 조건 30-32에서 골지체로 ER에서 SCAP / SREBP 거래를위한 필수 조건입니다 것으로 나타났습니다. (NNN은 QQQ하는) 글루타민에 세 아스파라긴의 돌연변이를 통해 SCAP의 글리코 실화의 손실 SCAP의 단백질과 SREBP 활성화 (31)의 감소의 불안정성에 SCAP / SREBP의 복잡하고 결과의 인신 매매를 사용하지 않습니다. 우리의 최근의 데이터는 또한 SREBP-1의 높은 아교 모세포종에서 활성화 및 SCAP의 N -glycosylation 4,31,33,34에 의해 규제됩니다 보여줍니다. 타겟팅 SCAP / SREBP-1 신호는 악성 종양과 신진 대사의 치료에 새로운 전략으로 부상1,3,35-38 yndromes. 따라서, SCAP 및 N 단백질의 수준을 분석 -glycosylation 인간 세포 및 환자 조직에서의 피킹을 모니터링하기위한 효과적인 방법을 개발하는 것이 중요하다. 응급실에서 SCAP 단백질 (아미노산 540-707)의 내강 영역은 그대로 막은 트립신 (15)으로 처리 할 때 단백질 분해로부터 보호되는 두 개의 N의 -glycosylation 사이트 (N590과 N641)가 포함되어 있습니다. 이 내강 단편 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 15,31 SCAP 개별 당화 변형의 해상도를 허용하도록 충분히 작은 ~ 30 kDa의 분자량을 갖는다. 여기서는 N의 SCAP의 -glycosylation 인간 세포에서 전체 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 브라운 및 골드 스타 인 연구소 15하고 최근 출판 (31)로부터의 공보에 기재된 방법으로부터 유도된다. 프로토콜은 t에서 사용될 수있다그는 포유 동물 세포에서 SCAP 단백질의 연구.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">6366236001</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEMI medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trypsin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNGase F&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-SCAP (9D5) antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-13553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP antibody&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SREBP-1 antibody (IgG-2A4)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDI Antibody (H-17)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td style="width:123px;">sc-30932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lamin A Antibody (H-102)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td style="width:123px;">sc-20680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCAP antibody (a.a 450-500)</td>
			<td>Bethyl Laboratories, Inc.</td>
			<td>A303-554A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine&#160;&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>17-207-CV</td>
			<td>Add 1 Mm Pyravate and 4 mM Glutamine before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">22G x 1 1/2 needle&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pepstatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALLN</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN3032D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA Solution 0.5 M PH8.5 100 ml&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82023-102&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA 0.5 M sterile (PH 8.0) 50 ml</td>
			<td>Fisher Scentific</td>
			<td>50255956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HyClone FBS</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">prolong gold antifade reagent with dapi</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium pyruvate</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of scap n-glycosylation and trafficking in human cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

도 1은 웨스턴 블롯을 사용하여 자극 포도당 응답 인간 아교 모세포종 U87 세포에서 내인성 단백질 및 SCAP SREBP-1 핵 형태의 검출을 나타낸다. 막 단백질 SCAP는 &quot;막 분획&quot;에서 검출된다. SREBP-1의 핵 형태 (N 말단)이 &quot;핵 추출물&quot;에 검출된다. SCAP 단백질의 수준은 현저하게 포도당의 자극에 의해 강화되고, SREBP-1 핵 형태 (PDI는 ER 막 단백질의 내부 대조군으로서 작용). 이러한 결과는 프로토콜 인간 세포에서 내인성 SCAP 단백질을 검출 할 수 있음을 보여준다. 도 2는 GFP 표지 햄스터 SCAP 발현 HEK293T 세포 자극 tunicamycin 처리 글루코스에 반응하여 SCAP의 N의 총 -glycosylation GFP-SCAP 단백질 수준의 분석을 나타낸다.도 <str옹&gt; 2a는 세 N의 -glycosylation 사이트를 운반하는 ER 막에 걸쳐 SCAP 단백질의 주제 구조를 보여줍니다. AA에게 540 포함 SCAP의 조각 - 응급실에서 6 일 내강 루프에있는 707, 트립신 내성 15 및 사이트 N590과 N641에 N의 -glycosylation의 분석에 사용됩니다. 처리 (AA 540 함유 - 707)보다 높은 중량 밴드 트립신 후도 2b (상부 패널)에 나타낸 바와 같이 하나 또는 두 개의 N은 MALDI 스펙트럼은 PNGase의 글루코스 부재의 존재 하에서 당사슬 (N590 및 N641)를 -linked 함유 SCAP 단백질을 나타낸다 (IgG를-9D5 항체 검출) 또는 tunicamycin. 빠른 SDS-PAGE에서 이동 - MALDI 스펙트럼은 PNGase F의 존재, N 결합 된 올리고당은 단편 (707 AA 540)를 일으키는 원인이되는 SCAP 단백질에서 제거되었습니다. 일관 완전 tunicamycin하여 N의 -glycosylation 개시 프로세스를 차단 하부의 모양으로 표시된 N SCAP의 -glycosylation를 폐지SCAP 조각 (그림 2B, 상단 패널)의 밴드. 또한, (GFP에 대한 항체에 의해 검출 된) 총 GFP-SCAP 단백질 글루코스의 부재 또는 tunicamycin 처리 (도 2b에 도시 된 바와 같이, 하부 패널)로 감소 하였다. 이러한 결과는 프로토콜 SCAP N -glycosylation의 분석에 적합 함을 입증한다. 그림 3은 자극을 포도당에 대한 응답에서 골지체로 ER에서 GFP-SCAP의 인신 매매는 U87 세포에서 tunicamycin 처리에 의해 억제 된 것을 알 수있다. 도 3a에 도시 된 바와 같이, 공 초점 현미경 사진 PDI, 응급실 상주 단백질 (적색)과의 공동 지역화 같이 GFP-SCAP 단백질, 글루코스 부재에서 ER에 존재하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 글루코오스의 존재하에 GFP-SCAP은 골지 마커 단백질 Giantin (적색) (도 3b)와 공동으로 현지화 도시 골지로 이동한다. 또한, tunicamycin치료는 골지체 (도 3A와 B)의 ER에서 GFP-SCAP의 포도당 - 유도 피킹을 억제 하였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54709/54709fig1.jpg" /> 그림 1. 감지 내생 SCAP 단백질과 SREBP-1 U87 세포에서 핵 양식. 막과 12 시간 (5 밀리미터) 또는 포도당없이 무 혈청 배지에서 배양 된 인간의 기본 아교 모세포종 U87 세포에서 핵 추출물의 웨스턴 블롯 분석. 인간 SCAP 단 (450)에 대해 안티 SCAP 항체 - 인간 500 세포에서 내인성 SCAP를 검출하는데 사용되었다. 인간 SREBP-1 407 단편 - SREBP-1의 활성 형 (N 말단)은 단 (301)에 대해 항체를 이용하여 &quot;핵 추출물&quot;에 검출된다. 이 수치는 31의 허가를 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54709/54709fig1large.jpg" target="_blank">더 큰 versi을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의에. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54709/54709fig2.jpg" /> 그림 2. SCAP N의 -glycosylation 및 GFP-SCAP 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석.가) SCAP 구조 스패닝은 ER 멤브레인을 통과 보여주는 개략도. 소포체 내강에 상주하며 N- 결합 올리고당에 의해 수정 모두 SCAP 세 아스파라긴 (N) 잔기가 존재한다. SCAP 함유 아미노산 540-707의 단편 트립신 분해에 내성이다. . 그것은 금주 모임 (540)에 대한 IgG의-9D5 항체를 검출 할 수있는 두 개의 N- 연결된 올리고당 수정 다래끼, N590과 N641 포함 - 서양 얼룩 B에 의해 햄스터 SCAP) 상부 SCAP N의 -glycosylation (의 웨스턴 블롯 분석 707 :와 함께 트립신 처리) 또는 GFP-SCAP의 단백질 수준 (낮은 : HEK293T 세포 트랜스에게 가입일 트립신 처리)iently 24 시간 동안 GFP-SCAP로 형질 감염하고 12 시간 동안, 또는 tunicamycin (1 μg의 / ㎖)와, N의 -glycosylation 억제제의 존재 또는 부재하에 글루코스 (5 mM)을가없는 무 혈청 배지에서 배양 하였다. 블롯의 좌측의 숫자는 (IgG의-9D5 항체에 의해 검출 어퍼) SCAP 단백질 (N590 및 N641 사이트)에 대한 N의 -glycosylation 사이트의 수를 나타낸다. GFP-SCAP에 대한 낮은 패널이 GFP 단백질에 대한 항체가 검출되었다. 이 그림은 (31)로부터 허가를 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54709/54709fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54709/54709fig3.jpg" /> 골지. (A)에 응급실에서 SCAP 인신 매매의 그림 3. 감지, B) 공 초점 현미경 이미지는 GFP-SCAP는 ER에있는 또는 T로 이동하는 것을 보여그는 12 시간 동안 U87 세포에서 tunicamycin (1 μg의 / ㎖) 처리없이와 / 부재 또는 포도당 (5 밀리미터)의 존재 골지. PDI는 ER 염색 (적색) (A)를 보여줍니다. Giantin, 골지 마커 (적색) (B). DAPI (청색) 세포핵 얼룩. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. 도 3a는 새로운 데이터이고, 이전에 게시되지 않았습니다.도 3b는 (31)의 허가를 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54709/54709fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells at JoVE.com

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

우리는 웨스턴 블롯을 사용하여 SCAP의 N의 -glycosylation 총 단백질의 검출을위한 인간 세포로부터 세포막 분획의 분리 및 샘플 제조 수정 방법을 설명한다. 우리는 더 공 초점 현미경을 사용하여 SCAP 거래를 모니터링하는 GFP-표시 방법을 소개합니다. 이 프로토콜은 일반 생물학 실험실에서 사용될 수있다.

SCAP의 분석<em&gt; N</em&gt; 인간 세포의 -glycosylation 및 매매

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

analysis-of-scap-n-glycosylation-and-trafficking-in-human-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

8.6K 조회수.  The Ohio State University Comprehensive Cancer Center and College of Medicine.  우리는 웨스턴 블롯을 사용하여 SCAP의 N의 -glycosylation 총 단백질의 검출을위한 인간 세포로부터 세포막 분획의 분리 및 샘플 제조 수정 방법을 설명한다. 우리는 더 공 초점 현미경을 사용하여 SCAP 거래를 모니터링하는 GFP-표시 방법을 소개합니다. 이 프로토콜은 일반 생물학 실험실에서 사용될 수있다. 

비디오: Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

연구

생물학

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, small ubiquitin-related modifier (SUMO) is a ubiquitin-like protein that is covalently attached to the lysine residues of a variety of target proteins to regulate cellular processes, such as gene transcription, DNA repair, protein interaction and degradation, subcellular transport, and signal transduction. The most common approach to detecting protein SUMOylation is based on the expression and purification of recombinant tagged proteins in bacteria, allowing for an in vitro biochemical reaction which is simple and suitable for addressing mechanistic questions. However, due to the complexity of the process of SUMOylation in vivo, it is more challenging to detect and analyze protein SUMOylation in cells, especially when under endogenous conditions. A recent study by the authors of this paper revealed that endogenous retinoblastoma (Rb) protein, a tumor suppressor that is vital to the negative regulation of the cell cycle progression, is specifically SUMOylated at the early G1 phase. This paper describes a protocol for the detection and analysis of Rb SUMOylation under both endogenous and exogenous conditions in human cells. This protocol is appropriate for the phenotypical and functional investigation of the SUMO-modification of Rb, as well as many other SUMO-targeted proteins, in human cells.

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Small ubiquitin-related modifier (SUMO) family proteins are conjugated to the lysine residues of target proteins to regulate various cellular processes. This paper describes a protocol for the detection of retinoblastoma (Rb) protein SUMOylation under endogenous and exogenous conditions in human cells.

Vivo에서 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

SCAP의 분석

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터