그래서 우리는 선천성 면역 체계와 면역 관련 질환의 복합 탄수화물 또는 글리칸을 연구하며, 현재 패혈증과 암에 초점을 맞추고 있습니다. 우리의 연구는 인간 당단백질의 상세한 특성화를 위해 당체학 및 당단백질체학(glycoproteomics methods)을 포함한 분석 방법 및 시스템 당생물학(glycobiology)을 포함합니다. 당단백질체학은 지난 수십 년 동안 엄청난 발전을 경험했으며, 사용 가능한 고품질 질량 분석 데이터의 부족으로 인해 더 이상 발전이 제한되지 않습니다.
오히려 문제는 스펙트럼 데이터에서 생물학적 지식을 해석하고 생성하는 것입니다. 글리코믹스 유도 글리코프로테오믹스 방법을 통해 글리코 과학자들은 인체 건강 지수를 통해 글리코프로테옴 및 하드 장벽에 대한 깊고 정확한 통찰력을 얻을 수 있으며, 글리코프로테오믹스는 글리코프로테ome에 대한 부위별 통찰력을 생성할 수 있는 고유한 능력을 가지고 있습니다. 그러나 글리코펩타이드 비율은 여전히 높습니다.
이러한 재현성 문제를 해결하기 위해 당사의 glycomics glycoproteomics 방법은 동일한 샘플의 glycomics 조사를 통해 글라이칸 검색 공간의 제약 조건을 정의하여 정밀한 glycoproteome 프로파일링을 가능하게 합니다. 궁극적으로 더 빠르고 정확한 글리코펩타이드 검색을 가능하게 합니다. 당사의 글리코믹스 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics) 방법을 사용하면 다양한 인간 표본에서 글리코프로테옴 지수의 이질성과 역학을 포괄적으로 매핑할 수 있습니다.
따라서 이 방법은 질병 진행을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있으며 다양한 인간 질병에 대한 치료 표적에 대한 새로운 진단 바이오마커를 찾는 데도 도움이 될 수 있습니다. 글리코믹스 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics) 방법을 통해 인간 당단백질체의 복잡성을 해독할 수 있으며, 이를 통해 글리칸 구조가 단백질 기능, 세포 통신 또는 면역 반응에 어떤 영향을 미치는지와 같은 새로운 생물학적 질문이 제기됩니다. 또한 특정 질병에서 당화 패턴이 어떻게 그리고 왜 변했는지에 대한 질문을 제기합니다.
그리고 이러한 통찰력은 복잡한 질병에 대한 발견과 새로운 진단 마커 및 맞춤형 치료법으로 이어질 수 있습니다. PVDF 멤브레인에서 관심 단백질을 고정시키려면 단일 구멍 구멍을 사용하여 발견할 샘플 수에 따라 멤브레인을 절단합니다. 절제된 멤브레인을 메탄올로 적신 다음 바닥이 평평한 96웰 플레이트로 옮깁니다.
멤브레인이 거의 건조되면 반점당 2.5마이크로리터의 단백질 샘플을 적용합니다. 섭씨 20도에서 25도의 온도에서 멤브레인을 최소 3시간 동안 또는 가급적이면 하룻밤 동안 자연 건조하고 오염을 방지하기 위해 주의하십시오. 메탄올에 1%PDP-40 100마이크로리터를 더럽혀진 멤브레인을 포함하는 각 웰에 추가합니다.
PDP-40 용액의 플레이트를 섭씨 20-25도에서 흔듭니다. 5분 후에 PDP-40 용액을 폐기합니다. 다음으로, 막힌 단백질 반점이 포함된 각 웰을 초순수 100마이크로리터로 세척하고 플레이트를 5분 동안 흔듭니다.
각 웰에 15마이크로리터의 PNGase F 용액을 추가합니다. 탈수를 방지하려면 주변의 빈 우물에 물을 추가하십시오. 투명 필름으로 플레이트를 조심스럽게 밀봉하고 섭씨 37도에서 최소 8시간 동안 배양합니다.
배양 후 플레이트를 5분 동안 초음파 처리하여 웰 측면의 증발된 물방울이 바닥에 모일 수 있도록 합니다. 방출된 N-글라이칸 샘플을 개별 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 각 샘플을 20마이크로리터의 초순수로 두 번 잘 세척하고 흡입하여 나머지 모든 샘플을 새 튜브에 결합합니다.
다음으로, pH 5 100 밀리몰 암모늄 아세테이트 10 마이크로 리터를 추가하고 섭씨 20-25도에서 1 시간 동안 샘플을 배양합니다. 진공 농축기 시스템에서 N-글라이칸 샘플을 건조시킵니다. 수제 다공성 흑연 탄소 또는 PGC-C18 고체상 추출 또는 SPE 마이크로 컬럼을 준비하려면 주사기를 사용하여 C18 디스크를 10마이크로리터 피펫 팁에 꽂아 옮깁니다.
10마이크로리터의 PGC 수지 슬러리를 50% 메탄올에 현탁시켜 C18 SPE 마이크로 컬럼에 피펫팅합니다. 마이크로 원심분리기 어댑터를 사용하여 마이크로 컬럼을 2ml 튜브에 넣습니다. 튜브를 돌려 대략 컬럼 높이가 0.5cm인 PGC-C18 SPE 마이크로 컬럼을 만듭니다.
다음으로, 아세토니트릴에 함유된 0.1%트리플루오로아세트산(TFA) 50마이크로리터를 마이크로 컬럼에 추가하고 2000G에서 60초 동안 원심분리하여 이동상이 마이크로 컬럼을 쉽게 통과할 수 있도록 합니다. 마찬가지로, 0.1% 수성 TFA를 사용하여 마이크로 컬럼을 세 번 세척하고 컨디셔닝합니다. N-글라이칸 샘플을 최대 40마이크로리터의 로딩 부피로 각 마이크로 컬럼에 적용합니다.
각 에디션 후에 마이크로 컬럼을 회전시키고 전체 샘플이 로드될 때까지 반복합니다. 각 마이크로 컬럼을 20마이크로리터의 초순수로 세척합니다. 마이크로 컬럼을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
N-글라이칸을 용리하려면 각 마이크로 컬럼에 50%아세토니트릴에 40마이크로리터의 0.1%TFA를 첨가합니다. 튜브를 돌리고 각 스핀의 용리액을 결합합니다. 탈염된 N-글라이칸을 진공 농축기 시스템에서 건조시킵니다.
적절한 소프트웨어를 사용하여 생성된 LC-MS/MS 원시 데이터를 찾아봅니다. 좁은 LC 피크 폭, N-글라이칸 이성질체의 효과적인 분리, 높은 MS 정확도, 분해능 및 신호 대 잡음비, 높은 CID MS/MS 단편화 효율을 평가하여 높은 데이터 품질을 확인할 수 있습니다. 단일 동위원소 전구체 질량, CID MS/MS 단편화 패턴, 상대 및 절대 PGC-LC 머무름 시간을 기반으로 샘플에서 N-글라이칸을 수동으로 식별합니다.
상대적 N-글라이칸 정량을 위해 식별된 모든 N-글라이칸 이성질체에 대한 단일 동위원소 전구체 질량 대 전하 비율을 포함하는 전이 목록을 생성합니다. 모든 N-글라이칸 전구체 이온의 추출된 이온 크로마토그램에서 곡선 아래 면적 값을 측정합니다. ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼을 준비하려면 주사기를 사용하여 C8 디스크를 10마이크로리터 피펫 팁에 꽂아 옮깁니다.
메탄올에 현탁된 ZIC-HILIC 수지 슬러리를 C8-SPE 마이크로 컬럼에 증착합니다. 마이크로 원심분리기 어댑터가 있는 2ml 튜브에 마이크로 컬럼을 넣고 컬럼이 중앙에 매달려 있는지 확인합니다. 스핀하여 대략 1cm 높이의 C8-SPE HPLC 마이크로 컬럼을 생성합니다.
마이크로 컬럼에 50마이크로리터의 메탄올을 추가하고 2000G에서 60초 동안 원심분리하여 이동상이 컬럼을 통과할 수 있도록 합니다. 마찬가지로, 마이크로 컬럼을 각각 50마이크로리터의 초순수로 세 번 세척한 다음 80%아세토니트릴에 50마이크로리터의 1%TFA를 세척합니다. N-글리코펩타이드 농축을 위해 지정된 건조된 펩타이드 혼합물을 80%아세토니트릴에 1%TFA 50마이크로리터에 재현탁시키고 철저히 혼합합니다.
마이크로 원심분리기 어댑터를 사용하여 ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼 조건을 새 1.5ml 튜브에 넣습니다. 재현탁된 펩타이드 혼합물을 각 마이크로 컬럼에 적용하고 2000G에서 60초 동안 회전합니다. 플로우 스루 분획을 수집하고 각 분획을 동일한 ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼에 다시 적용합니다.
그런 다음 50마이크로리터의 25밀리몰 중탄산암모늄과 50마이크로리터의 50%아세토니트릴을 순차적으로 첨가하여 N-글리코펩타이드를 용리시킵니다. 마이크로 컬럼을 새로운 1.5ml 저결합 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 잔류 N-글리코펩타이드를 순차적으로 용리하려면 0.1% 수성 TFA 50마이크로리터를 마이크로 컬럼에 추가하고 2000G에서 60초 동안 원심분리합니다.
그런 다음 50마이크로리터의 0.1% 수성 TFA를 순차적으로 첨가한 다음 50마이크로리터의 25밀리몰 중탄산암모늄과 50마이크로리터의 50%아세토니트릴을 순차적으로 첨가하여 N-글리코펩타이드를 용리합니다. 진공 농축기 시스템에서 농축된 N-글리코펩타이드와 비변형 펩타이드가 분획을 통해 흐르도록 수집, 결합 및 건조합니다. N-글리코믹스 데이터 분석을 통해 결장직장암 조직에서 70%의 복합/하이브리드 글라이칸, 20%의 올리고마노스 및 10%의 파우시마노스를 가진 76개의 N-글리칸 이성질체가 확인되었습니다.
모든 N-글라이칸 구조는 추출된 이온 크로마토그램의 곡선 아래 면적 값을 사용하여 정량화된 스펙트럼 증거로 확인되었습니다.
