Name: zika virus infectious cell culture system and the in vitro prophylactic effect of interferons
Uploaded: 2016-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
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We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.

주 : 작업 흐름의 개략적 개요는도 1에 제시된다. 1. 세포 <ol><li> Zika 바이러스 생산 및 바이러스 성 복제주기의 분석을위한 베로 세포를 사용합니다. </li><li> 전체 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 L- 글루타민, 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신을 함유하는 성장 배지 (100 단위 / ml), 및 10 mM의 HEPES를 준비한다. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 특정 완료 성장 배지 베로 세포 배양. </li></ol> 2. Zika 바이러스 생산 <ol><li> T-75 플라스크에 0.25 % 트립신을 사용하여 80 %의 세포 밀도의 베로 세포를 수확하고, 세포 수를 계산. <ol><li> T-75 배양 플라스크에서 미디어를 대기음 2 ml의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 세포를 씻어. </li><li> 0.25 % 트립신 2 ML을 추가하고 5 분 동안 37 ° C에서 플라스크를 품어. </li><li> 트립신을 불 활성화하는 성장 매체를 포함하는 혈청의 8 ML을 추가합니다. 피펫 위 SUS 아래로PEND 세포를 15 ㎖의 튜브에 세포를 전송하고. </li><li> 세포의 10 μl를 제거하고 0.4 % 트리 판 블루의 동일한 양으로 혼합한다. 셀 카운팅 챔버 슬라이드에 준비된 믹스를 넣고 자동 세포 계수기를 사용하여 카운트하여 생존 세포를 얻을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 은 T-160 플라스크에 30 mL의 부피로 세포 7,000,000 개의 종자. </li><li> 다음 날, 플라스크 당 10 ml의 무 혈청 배지에서 Zika 바이러스 접종의 (0.1 MOI 0.01) 감염의 적절한 다수를 준비합니다. </li><li> T-160 플라스크에서 소비 된 용지를 제거하고 새로 제조 된 바이러스 접종 물 (10 ㎖)를 추가합니다. </li><li> 4 ~ 6 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 접종 플라스크를 품어. 부드럽게 모든 시간에 옆으로 플라스크를 기울여 접종을 확산. </li><li> 배양 완료시, 각 플라스크 따뜻한 혈청 보충 성장 미디어 (30 ㎖)으로 접종을 교체합니다. 그런 다음 96 시간 동안 바이러스 문화를 계속합니다. </li><li> 에서의 진행을 확인위상차 현미경을 이용하여 40 배 및 200 배 배율 필요한 이미지 (도 2)를 가지고 세포 단층에 바이러스 플라크의 외관을 관찰하여 fection. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" /> 그림 2 :. 다양한 배율의 베로 세포의 단층에 Zika 바이러스에 의해 형성된 플라크 밝은 필드 이미지는 48 HPI에서 Zika 바이러스 플라크를 보여줍니다. 단일 층에 둥근 세포 병소의 존재를합니다. (스케일 바 = 50 μm의)는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="8"><li> 96 시간 시점에서 원심 분리 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG의 상등액에서 수확 세포 배양 상청 균체 잔사를 제거했다. </li><li> 조심스럽게 방해 펠렛 파편과 전송 t없이 뜨는을 제거15 ml의 튜브 오. 24,000 XG에 초 원심 분리 (옵션) 바이러스 입자를 집중 수행 할 수 있습니다. </li><li> -80 ° C에서 여러 분취에서 바이러스 배양 상층 액을 저장합니다. </li></ol> 플라크 분석 3. 측정 Zika 바이러스 역가 <ol><li> 12 웰 플레이트를 사용하여 2 ml의 볼륨에 웰 당 1 × 10 5 세포에서 종자 순진 베로 세포. </li><li> 다음날, 혈청이없는 배지를 사용하여 T-160 플라스크에서 수집 바이러스 배양 상청액의 연속 희석 1/10 제조. 각에서 소비 된 미디어를 잘 제거하고 중으로 베로 세포에 준비 접종의 400 μl를 추가합니다. </li><li> (37)에 접종 플라스크를 품어 4 ~ 6 시간 동안 5 % CO 2와 C를 °. 조심스럽게 하나 하나 시간에 옆으로 판을 기울여 접종을 확산. </li><li> 인큐베이션의 끝에, 세럼이 보충 미디어 접종 (웰 당 2 ml)로 교체한다. </li><li> 48 시간 포스트 접종에서, 위상 제어 방식을 사용하여 바이러스 초점을 계산AST 현미경. ml의 당 플라크 형성 단위 (PFU)와 같은 바이러스 역가를 계산합니다. 플라크 분석 그림 3을 참조하십시오. </li><li> 수정하고 플라크 명확한 시각화 20 % 에탄올 중에서 제조 된 4 % 포름 알데히드 셀 0.1 % 크리스탈 바이올렛 용액을 착색. </li></ol> 4. Zika 바이러스 성 게놈 복제 분석 <ol><li> 12 웰 플레이트를 사용하여 2 ml의 볼륨에 웰 당 1 × 10 5 세포에서 종자 순진 베로 세포. 세중에서 혈청 무료 매체를 사용하여 낮은 및 높은 역가의, 그 다음날은 바이러스 접종 (400 μL / 웰 0.01 및 0.1의 MOI)를 준비합니다. 모의 감염, 혈청이없는 배지 (400 μL / 웰) 만 사용합니다. </li><li> 3.4 단계 3.2를 반복합니다. </li><li> 48 및 96 시간 시점에서, RNA 및 면역 세포 화학 (ICC)에 샘플을 수집한다. <ol><li> 수확 RNA 샘플의 경우, 미디어를 제거한 다음 해물을 잘 직접 각 용해 액 400 μl를 추가하고 수집합니다. </li><li> ICC를 들어, 미디어 및 t 제거암탉 각 웰에 1 ml의 메탄올을 첨가하여 세포를 고정시키고, 30 분 동안 4 ℃에서 플레이트 배양한다. </li><li> 세포 파쇄물, 제조자의 지시 당 RNA 분리 키트를 이용하여 총 RNA를 분리. 분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량화. </li></ol></li><li> 수확 된 RNA로부터 ZIKV 게놈 콘텐츠를 결정하기 위해 두 단계의 정량적 역전사 PCR (RT-qPCR에)을 수행한다. <ol><li> RNA의를 전사 바꾸려면, 먼저 0.2 ML 튜브에서 격리 RNA의 5 μg의,의 dNTPs (10 mM)을 1 μL, 1 μL 무작위 헥사 (250 NG)로 구성된 13 μL 반응 믹스를 설정합니다. 5 분 동안 65 ° C에서 튜브를 품어 다음 일분 얼음에 놓습니다. 그 후, 역전사 효소 1 ㎕를, 5 배 가닥 합성 완충액 4 ㎕를 0.1 M 디티 오 트레이 톨 1 μL, 반응 혼합물에의 RNase 억제제 1 μL를 추가한다. 50 ° C 및 inactiv 60 분이어서 25 ℃에서 추가로 5 분 동안 튜브를 부화15 분 동안 70 ° C로 가열하여 반응을 먹었다. </li><li> qPCR에가 2 배 녹색 염료 슈퍼 믹스의 12.5 μl를 포함하는 DNA 중합 효소와 Zika 바이러스 [용 Zika 바이러스 범 유전자형 프라이머 (특정 10 mM의 각각의 프라이머 1 μL와 결과의 cDNA 1 μl를 사용하여 수행 : 5&#39;-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 &#39; ; 반전 : 5&#39;-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 &#39;), Zika 바이러스 아시아 유전자형 PRVABC59 균주 프라이머 (5&#39;-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3&#39;; 반전 : 5&#39;-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 &#39;)], 또는 C 형 간염 바이러스 (JFH RTQ F : 5 &#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3, JFH RTQ R : 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3&#39;), 또는를 들어 휴대 하우스 키핑 유전자 GAPDH (: 5&#39;-CCACCTTTGACGCTGGG-3 &#39;; 계 : 5&#39;-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3&#39;) 25 μL 반응 볼륨입니다. </li><li> 실행 조건 15 초 동안 95 ° C 및 실시간 PCR 시스템에서 30 초 (40 회) 60 ° C를 사용하여 PCR을 수행합니다. </li><li> 는 Z 정상화 사이클 임계 값에 기초하여 (CT)의 값을 GAPDH의 발현 수준을 사용IKA 바이러스 게놈 측정. GAPDH에 비해 Zika 게놈 델타 코네티컷 (ΔCT) 값을 계산하고이 값을 ΔCT 얻었다. 그리고, 표시된 시점에서 감염과 감염되지 않은 세포 사이의 정규화 Zika 게놈 내용물의 비율을 고려하여 스크롤 변화를 계산한다. ZIKV 게놈 복제 결과를 그림 4를 참조하십시오. </li></ol></li><li> 메탄올 고정 된 세포를 사용하여 ICC를 수행합니다. <ol><li> (PBS에서 0.1 % 트리톤-× 100, 3 % 염소 혈청, 3 % BSA) 1X PBS로 고정 셀을 세 번 씻고 ICC 차단 버퍼 차단합니다. </li><li> 버퍼를 차단 100 4 ℃에서 밤새 품어 : 1의 희석에 마우스 단일 클론 항 dsRNA를 항체 J2 (1 μg의 / ㎖)를 사용합니다. </li><li> 1X PBS로 세포를 세척하고, 1 차 항체를 염소 항 - 마우스 IgG-594 (1 μg의 / ㎖)을 추가 블로킹 완충액 1000 희석하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 훽스트 (Hoechst) 염료를 사용하여 핵에 대한 1X PBS와 얼룩 세포를 씻고100X 배율 형광 현미경 (도 4)를 사용하여 세포를 관찰한다. </li></ol></li></ol> Zika 바이러스 감염에 대해 사이토 카인 라이브러리를 스크리닝 (5) <ol><li> 웰 12 웰 플레이트를 사용하는 당 1 × 105 세포에서 순 베로 세포 종자. 세포가 (6 시간 후 - 시드)에 부착되면, 생물 중복에 표시된 농도 (2 ml의 볼륨 / 웰)에서 각각의 사이토 카인을 추가합니다. 차량 (PBS) 혼자 컨트롤을 포함합니다. </li><li> 12 시간 후 처리에서, Zika 바이러스 감염 (물론 당 0.1 400 μL의 MOI)를 수행합니다. 감염 (모의)없이 부정적인 제어 우물을 포함합니다. </li><li> 4 시간 게시물 감염에서, 사이토 카인 처리 된 미디어 (2 ㎖)와 함께 바이러스 접종을 교체합니다. 추가로 44 시간 동안 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 48 시간 게시물 감염에서, 위상차 현미경을 사용하여 바이러스 성 플라크를 계산하고 40X 배율 (그림 5)에 감염된 세포의 대표 이미지를 수집. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기에, 시험 관내에서 Zika 바이러스를 배양하기위한 간소화 된 프로토콜이 제공됩니다. 바이러스 배양을 확장 역가를 측정하고, 제공 한 게놈 복제를 정량화하기위한 최적의 엔드 포인트를 식별하는 단계를 포함하여 긴급. Zika 바이러스 감염 인자를 처리하는 동안, 바이오 안전성 절차를 엄격하게 따라야한다, 인간 병원체이기 때문에. 원숭이 신장 세포주 베로은 다양한 바이러스 학적 분...

Zika 바이러스 (ZIKV)는 소두증와 가난한 임신 1,4를 성과와 관련된 중요한 인간 병원체이다. ZIKV는 같은 뎅기열, 웨스트 나일, 세인트 루이스 뇌염 바이러스와 같은 신경 학적 결함을 일으킬 수 의학적으로 관련 플라 비 바이러스의 집합에 속한다. 바이러스 전송의 주요 모드뿐만 아니라, 성적 전송은 5,6를보고되었습니다, 모기 벡터 Aedes aegypti에 의해, 그리고. ZIKV 인해 모기 벡터의 확대 지리적 분포 및 출생 결함과의 강한 상관 관계에 주요 글로벌 건강 문제가되고있다. ZIKV 먼저 Zika 숲에서 감시 붉은 털 원숭이에서 1947 년 고립 된, 우간다 및 제 인간의 경우는 1952 7,8보고되었다. 발열, 발진, 두통, 결막염, 근육 / 관절 통증 등의 가벼운 증상에 존재 ZIKV에 감염 될 개인. 감염된 임산부는 태아 1 ZIKV를 전송할 수 있습니다. 지IKV 감염은 길랑 바레 증후군, 말초 신경의자가 면역 탈수 초 질환 (9)에 연결되어있다. Zika 바이러스 게놈의 길이는 약 10.8 킬로베이스이고 긍정적 인 의미, 단일 가닥 RNA 분자로 구성되어 있습니다. 게놈의 구조는 단백질 코딩 영역을 측면 비 코딩 영역 (NCR)와, 5&#39;NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A - NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3&#39;NCR로 구성되어 있습니다 6. 하나의 폴리 프로테인 (3419 AA)는 그 공동 및 사후 병진 (10) 작은 펩타이드로 분해입니다 번역됩니다. 5&#39;NCR 및 3&#39;NCR RNA 줄기 루프 구조는 모두 바이러스 게놈 번역 및 복제의 개시에 중요한 역할을한다. 게놈의 구조적 성분은 캡시드, 막 및 외피 단백질로 구성된다. 비 구조 단백질은 게놈 복제를 위해 중요하다. 현재 Zika 바이러스 균주는 세 가지 주요 유전자형으로 분류된다 : 서 아프리카, 동 아프리카, 아시아 6,10-13. 그것은이 제안되어있다가 나중에 추가로 12 진화 서부 아프리카와 아시아에 확산 동부 아프리카 혈통. 아시아 유전자형은 미국에서 현재 발생에 대한 책임이 있습니다. Zika 바이러스는 모기와 포유 동물 세포 모두에서 배양 할 수있다. 기본 피부 섬유 아세포, 미성숙 수지상 세포, 대뇌 피질의 신경 전구 세포와 베로 세포 Zika 10,14,15 바이러스 감염에 취약하다. 모두 유형 I 및 유형 II 인터페론 피부 섬유 아세포 (15) ZIKV 성장을 제한하는 것으로 나타났다. 이 연구의 목적은 포유 동물 세포 배양 시스템에서 생산 및 아시아 유전자형 ZIKA 바이러스 스트레인 PRVABC59의 시금위한 단계별 상세한 프로토콜을 제공하고 약물 개발 플랫폼으로 이러한 감염 배양 시스템의 유용성을 입증한다. 이 자원은 크게 더 난을 규명 할 수있는 Zika 바이러스 및 신경 학적 연구 커뮤니티에 혜택을 가능성이있다바이러스의 발병 기전과 바이러스 독성의 진화의 TS 메커니즘.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Countess &amp;ndash; Automated Cell Counter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Countess-cell counting&amp;nbsp; chamber slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2&amp;nbsp;</td><td>English &amp;amp; Scientific Consulting Kft.</td><td>10010200</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fischer</td><td>4471088</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Vero Cell Line&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>Zika viral strain PRVABC59</td><td>Centers for Disease Control and Prevention (CDC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 alpha&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>200-01A&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alpha</td><td>Peprotech</td><td>300-01A&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Interferon alpha A&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>Interferon beta</td><td>Peprotech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI</td><td>Nikon</td><td>Visit Nikon for Request</td><td></td></tr></tbody></table>

zika virus infectious cell culture system and the in vitro prophylactic effect of interferons

Zika 바이러스 (ZIKV)는 같은 소두증, 눈 결함 및 손상 성장으로 태아의 발달 이상에 연결되어 신흥 병원균이다. ZIKV는 플라 비비 리다 가족의 RNA 바이러스이다. ZIKV 주로 모기 전송뿐만 아니라 태아 수직 전송뿐만 아니라 성적 접촉을 모체로 확산 될 수있다. 현재까지 바이러스에 감염된 사람들을 보호하기 위해 가능한 신뢰할 수있는 치료 또는 예방 접종 옵션이 없습니다. 재현 효과 Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템의 개발 ZIKV 복제뿐만 아니라 약물과 백신 개발의 분자 메커니즘을 연구하는데 중요하다. 이와 관련하여, 바이러스의 생산 및 성장 분석을 위해 포유 동물 세포 기반 체외 Zika 바이러스 배양 시스템을 설명하기위한 프로토콜은 여기에보고된다. 바이러스 역가를 측정하는 세포 단층과 상패 분석​​에 Zika 바이러스에 의한 플라크의 형성에 대한 세부 사항이 표시됩니다. 바이러스 게놈 복제 속도론및 이중 가닥 RNA 게놈 replicatory 중간체가 결정된다. 이 문화 플랫폼은 인터페론 α (IFN-α)의 식별 결과 사이토 카인의 작은 세트의 라이브러리에 대해 화면으로 사용하고, IFN-β와 Zika 바이러스 성장의 강력한 억제제로 IFN-γ. 요약하면, 시험 관내 감염 Zika 바이러스 배양 시스템 및 각종 바이러스 학적 분석은 크게 더 바이러스 발병의 메커니즘과 바이러스 독성의 진화를 해명의 연구 커뮤니티에 도움이 할 수있는 잠재력을 가지고 본 연구에서 입증된다. 바이러스 IFN 알파는 또한 감염된 임산부 포함 고위험 인구 Zika 바이러스 감염에 대한 예방제, 노광 후 예방 및 치료 방법으로 평가 될 수있다.

Zika 바이러스 변형, 아시아 유전자형 (PRVABC59 GenBank 액 번호 KU501215)은이 연구 (12)에 이용되었다. 80 % 컨 플루 언시 베로 세포는 새로이 Zika 바이러스 감염을 연구에 사용 하였다. 바이러스 생산과 바이러스 학적 특성화 이후, 초기 통로 (P3) Zika 바이러스를 사용 하였다. 바이러스 플라크를 감염 둘째 날에 관찰되었다. 초기에 감염된 세포로부터 방출 Zika 바이러...

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Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

20.7K 조회수.  Cedars-Sinai Medical Center. Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

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Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

Immunocytochemical 분석에 대 한 교양된 인간 태아 뇌 신경 줄기 세포의 Zika 바이러스 감염

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

연구

발생학

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

면역학 및 감염병학

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions in newborn infants. While mosquitos are the main route of viral transmission, it has also been shown to spread via sexual contact and vertical mother-to-fetus transmission. In this latter case of transmission, due to the unique viral tropism of ZIKV, the virus is believed to predominantly target the neural progenitor cells (NPCs) of the developing brain.
Here a method for modeling ZIKV infection, and the resulting microcephaly, that occur when human cerebral organoids are exposed to live ZIKV is described. The organoids display high levels of virus within their neural progenitor population, and exhibit severe cell death and microcephaly over time. This three-dimensional cerebral organoid model allows researchers to conduct species-matched experiments to observe and potentially intervene with ZIKV infection of the developing human brain. The model provides improved relevance over standard two-dimensional methods, and contains human-specific cellular architecture and protein expression that are not possible in animal models.

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

This protocol describes a technique used to model Zika virus infection of the developing human brain. Using wildtype or engineered stem cell lines, researchers may use this technique to uncover the various mechanisms or treatments that may affect early brain infection and resulting microcephaly in Zika virus-infected embryos.

대뇌 Organoids 파생 Zika 바이러스 감염 개발 인간의 두뇌에는 생체 외에서 줄기 세포를 사용 하 여 모델링

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

신경과학

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral load. The purpose of the procedure is to quantify viral titers in peripheral and CNS areas of the mouse at different time points post infection or under different experimental conditions to identify virologic and immunological factors that regulate Zika virus infection. The organ isolation procedures demonstrated allow for both focus forming assay quantification and quantitative PCR assessment of viral titers. The rapid organ isolation techniques are designed for the preservation of virus titer. Viral titer quantification by focus forming assay allows for the rapid throughput assessment of Zika virus. The benefit of the focus forming assay is the assessment of infectious virus, the limitation of this assay is the potential for organ toxicity reducing the limit of detection. Viral titer assessment is combined with quantitative PCR, and using a recombinant RNA copy control viral genome copy number within the organ is assessed with low limit of detection. Overall these techniques provide an accurate rapid high throughput method for the analysis of Zika viral titers in the periphery and CNS of Zika virus infected animals and can be applied to the assessment of viral titers in the organs of animals infected with most pathogens, including Dengue virus.

The goal of the protocol is to demonstrate the techniques used to investigate viral disease by isolating and quantifying Zika virus, from multiple organs in a mouse following infection.

마우스의 여러 장기에서 Zika 바이러스의 격리 및 정량화

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) formats. The flavivirus non-structural (NS) proteins are thought to co-translationally assemble on the endoplasmic reticulum (ER) membranes, forming the replication complex (RC). The NS3 and NS5 are the most studied enzymes of the RC and constitute the main targets for drug development due to their crucial roles in viral genome replication. NS3 protease domain, which requires NS2B as its cofactor, is responsible for the cleavage of the immature viral polyprotein into the mature NS proteins, whereas NS5 RdRp domain is responsible for the RNA replication. Herein, we describe in detail the protocols used in replicon-based screenings and enzymatic assays to test large compound libraries for inhibitors of the Zika virus (ZIKV) replication. Replicons are self-replicating subgenomic systems expressed in mammalian cells, in which the viral structural genes are replaced by a reporter gene. The inhibitory effects of compounds on viral RNA replication can be easily evaluated by measuring the reduction in the reporter protein activity. The replicon-based screenings were performed using a BHK-21 ZIKV replicon cell line expressing Renilla luciferase as a reporter gene. To characterize the specific targets of identified compounds, we established in-vitro fluorescence-based assays for recombinantly expressed NS3 protease and NS5 RdRp. The proteolytic activity of the viral protease was measured by using the fluorogenic peptide substrate Bz-nKRR-AMC, while the NS5 RdRp elongation activity was directly detected by the increase of the fluorescent signal of SYBR Green I during RNA elongation, using the synthetic biotinylated self-priming template 3&#8242;UTR-U30 (5&#39;-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3&#39;).

In this work, we describe the protocols used in replicon-based and viral enzyme-based assays to screen for inhibitors of Zika virus replication in a high-throughput screening format.

지카 바이러스 복제억제제에 대한 화면에 높은 처리량 항 바이러스 적 소사

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) ...

Cell-Based Electrical Impedance Platform to Evaluate Zika Virus Inhibitors in Real Time

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture plate wells embedded with electrodes. The technology can be used to monitor the consequences of Zika virus (ZIKV) infection and adherent cell replication in real time, as this virus is highly cytopathogenic. It is a straightforward assay that does not require the use of labels or invasive methods and has the benefit of providing real-time data. The kinetics of ZIKV infection are highly dependent on the employed cell line, virus strain, and multiplicity of infection (MOI), which cannot be easily studied with conventional endpoint assays. Furthermore, the CEI assay can also be used for the evaluation and characterization of antiviral compounds, which can also have dynamic inhibitory properties over the course of infection. This methods article gives a detailed explanation of the practical execution of the CEI assay and its potential applications in ZIKV research and antiviral research in general.

Here, we demonstrate the use of cell-based electrical impedance (CEI) as a very easy and straightforward method to study Zika virus infection and replication in human cells in real time. Furthermore, the CEI assay is useful for the evaluation of antiviral compounds.

지카 바이러스 억제제를 실시간으로 평가하기 위한 세포 기반 전기 임피던스 플랫폼

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture ...

An In Vitro Assay for Screening Interferons as Potent Inhibitors of Zika Virus Growth

Source: Contreras, D. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54767">Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates an in vitro assay for screening interferons with antiviral activity against the Zika virus, a human pathogen. Within the host cell, the Zika virus undergoes multiplication upon internalization, infecting neighboring cells and creating distinct zones or viral plaques. Type I interferon, acting as an antiviral agent, hinders virus multiplication, thereby preventing the formation of viral plaques in the host cell monolayer.

지카 바이러스 성장의 강력한 억제제로서 인터페론을 스크리닝하기 위한 체외 분석

1. Screening Cytokine Library against Zika Virus Infection

	Seed naive Vero cells at 1 x 105 cells per well using a 12-well plate. Once the cells are ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunotherapy

Immunogenics and Vaccine Development

Zika Virus Infection of Fetal Neural Stem Cells

Source: McGrath, E. L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/56917">Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a procedure to infect human fetal neural stem cells with Zika virus. The infected cells can be used for further studies.

Source: McGrath, E. L., et al., Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis. J. Vis. Exp. (2018)
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Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과

요약

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