Zika 바이러스 감염 도중, T 세포는 바이러스 제거를 위한 면역 특권 기관에 침투할 수 있습니다 그러나 또한 Guillain-Barre 증후군 또는 고환 상해와 같은 면역 병인에 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Zika 바이러스 감염 과 백신 예방 접종 후 모두 면역 특권 기관에서 항원 별 T 세포의 테트라머 기반 검출을 용이하게한다는 것입니다. 이 모델에서, Zika 바이러스 감염은 인터페론 알파/베타 수용체 녹아웃 마우스에서 시작되어 뇌, 고환 및 비장에서 Zika 바이러스 특이적 T 세포의 추적을 허용합니다.
테트라머 염색 접근법을 사용하여, 면역 보호 및 면역 병원성 세포에 T 세포 기여를 탐구하기 위하여 Zika 바이러스 특정 T 세포에 침투하는 면역 특권 기관의 단지 특성을 조사할 수 있습니다. Zika 바이러스 감염을 위해, 6-8 주 된 인터페론 알파 /베타 수용체 녹아웃 마우스로 레트로 궤도 접종을 통해 PBS의 100 마이크로 리터에서 Zika 바이러스의 4 개의 초점 형성 단위에 10 을 10 을 전달합니다. 그런 다음, 15 일 동안 매일 감염된 동물의 체중과 임상 징후를 모니터링하십시오.
7일 후 접종후, 수술폼의 척추 위치에 감염된 동물을 고정하고, 멸균 메스를 사용하여 복부의 중간선을 따라 피부 절개를 한다. 가위를 사용하여 복부 근육을 열고 간을 부드럽게 추출하십시오. 이어서, 비장을 제거하고, PBS에서 조직을 세 번 헹구고 혈액을 제거한다.
마지막 세척 후, 비장을 모든 비장이 수집 될 때까지 얼음에 얼음 차가운 RPMI 매체의 1.5 밀리리터에 비장을 놓습니다. 단일 셀 서스펜션을 생성하려면 비장을 멸균, 40 마이크로미터 메쉬 셀 스트레이너를 50 밀리리터 튜브 위에 넣고 10%의 태아 소 혈청 또는 FBS로 보충된 얼음 냉기 RPMI 배지 2밀리리터를 스트레이너에 추가합니다. 이어서, 5밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 필터를 통해 조직을 제거하고, 신선한 배지를 사용하여 메쉬를 통해 방출된 세포를 플러시한다.
단일 세포 현탁액을 원심분리를 위한 15밀리리터 원모튜브로 옮기고, 적혈구 용해 완충제의 5밀리리터에서 펠릿을 재보선한다. 실온에서 5~6분 후에는 얼음 냉간 RPMI 10밀리리터와 FBS로 리시스를 멈추고 두 번째 원심분리를 위해 펠릿을 10밀리리터의 완전한 배지로 재보습합니다. 7일 후 접종, 안락사, 감염, 수컷 마우스를 도마에 걸리기 쉬운 위치에 고정하고, 직선 1-2-2-치아 집게로 두피를 고정시한다.
홍채 가위를 사용하여 두피에 중간 선 절개를 하고 두개골을 노출하고 날카로운 핀셋을 사용하여 날카로운 핀셋으로 궤도의 양면을 고정하여 뇌를 고정시하십시오. 날카로운 홍채 가위의 한 쪽 끝을 포라멘 매그넘에 넣고 측면으로 양쪽의 두개골로 자른다. 조심스럽게 같은 구멍에서 중간선까지 잘라, 코를 향해, 뇌를 다치게하지 않도록 가능한 피상적 인 가위 팁을 유지.
집게로 뇌를 들어 올리고 날카로운 홍채 가위를 사용하여 두개골 신경 섬유를 조심스럽게 해부하십시오. 그런 다음 집게를 사용하여 얼음 차가운 RPMI 와 FBS 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 뇌를 전송하십시오. 고환을 분리하려면, 집게로 복부 피부를 들어 올리고, 홍채 가위를 사용하여 정립및 복벽을 통해 세로 절개를 하고 복부의 가장 낮은 부분을 노출하십시오.
고환을 절개까지 밀어 내고 핀셋을 사용하여 지방 층을 부드럽게 당겨 양쪽에 구형 고환을 노출시십시오. 홍채 가위를 사용하여 지방 층과 부피증을 조심스럽게 해부하고 고환을 얼음 차가운 RPMI 플러스 FBS 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 옮춥춥시튜브로 옮춥춥시다. 수확된 조직 중 하나에서 단일 셀 서스펜션을 생성하려면 50 밀리리터 튜브 위에 100 미크론 메쉬가 있는 멸균 세포 스트레이너에 장기를 배치하고, 스트레이너에 얼음 차가운 RPMI 플러스 FBS 2밀리리터를 추가합니다.
5 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 으깨고 필터를 메쉬를 통해 완전히 접지 될 때까지 신선한 배지로 필터를 씻으셔도됩니다. 단일 셀 서스펜션을 원심분리를 위한 15밀리리터 튜브로 옮기고, 30% 밀도 그라데이션 배지의 5밀리리터로 펠릿을 재보선한다. 새로운 15 밀리리터 튜브에 70%밀도 그라데이션 배지의 2밀리리터 위에 세포 용액을 신중하게 층동하고 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리합니다.
그런 다음, 두 밀도 그라데이션 사이의 중간 단계에서 다른 원심분리를 위해 10밀리리터의 콜드 RPMI 플러스 FBS를 포함하는 새로운 15 밀리리터 튜브로 세포를 전송하고, 계산을 위해 10 밀리리터의 얼음 차가운 RPMI/FBS의 10 밀리리터에서 펠릿을 재연한다. 세포순환을 유동하여 분석하기 위해 FACS 완충 농도에서 100마이크로리터당 6개의 세포로 세포를 5배 10으로 희석시키고, 샘플당 항체를 차단하는 10마이크로리터로 세포 샘플을 배양한다. 실온에서 10분 후, 실험적인 유동 세포분석 스테인링 프로토콜에 따라 96웰, 라운드 하단 플레이트의 적절한 수의 우물에 20 마이크로리터를 추가하고, 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 각 웰에 E-protein 테트라메트 믹스 20마이크로리터를 첨가한다.
인큐베이션의 끝에서, 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 30분 배양에 대한 관심있는 세포 표면 항체를 세포에 추가한다. 다음으로, 세척당 FACS 버퍼 200 마이크로리터로 세포를 두 번 세척하고 신선한 FACS 버퍼 200 마이크로리터로 각 우물의 세포를 조심스럽게 재보힙합니다. 그런 다음, 유동 세포계에 대한 분석까지 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 샘플을 저장합니다.
골마비및 운동 파라파증과 같은 병리학적 증상 및 징후는 인터페론 알파/베타 수용체 1 녹아웃 마우스에서 관찰되며 7일 동안 지카 바이러스를 접종한 후 접종을 하였다. 감염된 인터페론 알파/베타 수용체 1 녹아웃 동물의 체중 변화는 15일 동안 모니터링되었으며, 감염 후 4일 후 체중 감소가 처음 관찰되어 감염 후 7일째부터 감염 및 체중 회복이 시작되었습니다. 감염된 뮤린 뇌의 대표적인 이미지는 Zika 바이러스를 가진 명백한 부종 및 hyperemia 7 일 후에 접종을 드러냅니다.
뮤린 지카 감염 고환의 대표적인 이미지는 감염 후 7일에서 30일로 점진적으로 감소하는 것을 보여줍니다. Zika에 감염된 두뇌 및 고환 조직 단면도의 조직 병리학 분석은 또한 감염되지 않은 통제에 비교된 파괴적인 병리학적인 변경의 효력을 보여줍니다. 매크로 및 조직 병리학 분석에서 예상대로, 높은 바이러스 부하는 또한 면역 염색에 의해 Zika 바이러스 감염 마우스의 두뇌 및 고환에서 검출됩니다.
그것은 강력한 CD3 양성 T 세포 감염 후 뇌에 침투동반. Zika 바이러스 특이적 CD3 양성, CD8 양성 T 림프구는 E-단백질 테트라머 염색에 의한 Zika 바이러스 감염 및 백신 면역 마우스 에서 모두 검출된다. E-단백질 테트라머 특이적 CD8 양성 T 세포는 또한 뇌에서 검출될 수 있고 Zika 바이러스를 가진 7일 후에 접종을 고환할 수 있습니다.
개발 후, 이 기술은 동물 모델의 자연 감염 중 면역 유행 기관에서 병원균 별 T 세포 특성화 의 연구에서 연구원을위한 길을 열었습니다. 이 방법은 또한 다른 면역 유행 기관에 적용 될 수 있습니다., 태 반 또는 눈 등, 바이러스 성 감염 및 암 둘 다에. 이 절차에 따라, MHC-I 테트라머는 뇌 또는 고환 침투 T 세포의 분포에 액세스하기 위해 병원체 별 T 세포의 면역 조직 화학 적 또는 면역 형광 검출에 사용될 수 있다.
