이 비디오에서 우리는 바이러스 감염의 충격 및 Zika 감염의 Murine 모형을 사용하여 결과 면역 반응을 심문하기 위하여 디자인된 절차의 세트를 기술합니다. 이 프로토콜은 바이러스가 신체 전체에 퍼진 정도를 식별하고 물리적 장벽을 변형시키고 조직에 액세스하여 감염과 면역에 대한 기계적 이해를 개발할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술은 바이러스 성 병인의 상세한 이해를 허용하고 백신 또는 치료에 의해 제공되는 보호 메커니즘을 해부 할 수있는 능력을 제공합니다.
여기서 우리는 마우스의 Zika 바이러스 감염을 사용하여 이 방법을 보여줍니다, 그러나 이 방법은 뎅기열 바이러스 와 Chikungunya 바이러스 같이 그밖 flaviviruses를 포함하여 바이러스 감염의 범위에 적용될 수 있습니다. 중추 신경계의 장기를 수확하는 것은 어려울 수 있으므로 작은 실험을 계획하고 사전에 기술을 연습할 준비를하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜을 사용하면 실험 데이터를 시각화, 캡처 및 저장할 수 있는 기능을 갖춘 작은 동물 모델 내에서 바이러스 확산의 신속한 해부를 허용합니다.
실험자가 중추 신경계 장기를 수확하는 방법을 이해할 수 있도록 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 또한 세포 의 합류 수준과 바이러스 성 초점의 강도를 보는 것이 중요합니다. 먼저 집게를 사용하여 감염된 마우스의 펠트를 제거합니다.
가위로 마우스의 머리를 참수하고 팔과 다리를 제거합니다. 뇌를 수확하려면 톱니 모양의 라 그레인지 가위를 사용하여 포멘 매그넘을 통해 두개골을 자른다. 집게로 두개골을 벗겨 내고 주걱으로 뇌를 떠냅니다.
강한 무딘 가위를 사용하여 척추를 둘러싼 뼈를 제거한 다음 골반 뼈를 가로질러 길루 를 잘라 요추 수준에서 척추 포먼을 노출시하십시오. 그런 다음 척추를 둘러싼 가능한 한 많은 근육을 제거하십시오. 조심스럽게, 척추 포맨 내부에 바늘의 경부 팁을 배치, 척추 몸을 침입 바늘을 방지하기 위해 과도한 압력을 피.
척추 몸과 바늘에 압력을 가하기 위해 강하게 잡고 주사기 플런저를 눌러 코드를 페트리 접시에 추방합니다. 즉시 표시된 튜브에 척수를 옮기고, 더 균일화를 위해 드라이 아이스 욕조에 놓습니다. 균질화의 경우 DMEM 1 밀리리터를 추가하고 비드비터에서 샘플을 균질화합니다.
장기가 균질화되도록 한 후, 원심분리기와 알리쿼트 샘플을 얼음에 보관하고 필요할 때까지 영하 80도에 보관하십시오. 분석 당일, 영하 80도 냉동고에서 균질화된 샘플을 제거하고 해동할 수 있도록 합니다. 얼음 에 샘플로, 희석 플레이트의 첫 번째 우물에 Zika 바이러스 열 배를 희석하고 플레이트 아래로 열 배 연속 희석을 할 멀티 채널 파이펫을 사용하여, 팁을 매번 변경합니다.
20 마이크로리터의 샘플을 180마이크로리터의 성장 매체에 추가하면 각 희석 사이에 파이펫 팁을 변경합니다. 제조된 평평한 바닥 96웰 플레이트에서 생체세포를 덮는 중점 성형 플레이트를 준비한다. 단층이 건조되는 것을 방지하기 위해, 즉시 viroplate에 있는 각 우물에 바이러스 희석의 100 마이크로리터를 추가합니다.
동일한 팁 세트를 사용하여 가장 낮은 위치에서 가장 높은 농도로 추가합니다. 바위 판은 2~4회 나란히 있고 1~2시간 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 배양합니다. 실온에 2%의 메틸셀룰로오스를 데우기.
이어서, 성장 매체에서 2%메틸셀룰로오스 용액을 약 2대 1의 비율로 희석한다. 인큐베이션 후, 메틸셀룰로오스 성장 매체의 125 마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 32~40시간 동안 이산화탄소 5%에서 섭씨 37도에서 다시 배양합니다.
비로세포를 고치려면 생물 안전 캐비닛에서 50 마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 메틸셀룰로오스 층 위에 추가합니다. 실온에서 60분 동안 배양하세요. 또는 파라필름으로 접시를 덮고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 놓습니다.
그 후, 파이펫을 사용하여 오버레이를 제거하고 세포를 생물 안전 캐비닛 내부의 일회용 용기로 매체로 넣습니다. 150 마이크로리터의 PBS로 부드럽게 씻으십시오. 플레이트에서 PBS를 제거하고 생물 안전 캐비닛에서 플레이트를 제거합니다.
PBS 세척을 두 번 반복한 다음, FFA 세척 버퍼의 1회 당 150 마이크로리터를 추가하고 고정 된 세포를 충진하기 위해 실온에서 5 ~ 10 분 동안 둡니다. 다음으로, 감염을 검출하기 위하여 1 차적인 Zika 항체를 이용합니다. 1 차적인 항체 4G2를 FFA 염색 완충제에서 밀리리터 당 1 마이크로그램의 농도로 준비한다.
Flick FFA는 플레이트에서 버퍼를 세척하고, 각 우물에 FFA 염색 버퍼에 1 차 항체의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 파라필름 또는 플라스틱 필름으로 접시를 밀봉하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. FFA 염색 버퍼에서 1-5, 000의 농도로 이차 이동 항마우스 HRP 표지 항체를 준비한다.
항체 용액을 제거한 후, 150마이크로리터 의 FFA 워시 버퍼로 세 번 세척할 수 있다. 매번 싱크대에 깜박여 세척 버퍼를 제거합니다. FFA 염색 버퍼에서 이차 항체를 가진 세포를 잘 당 50 마이크로리터로 염색하고 실온에서 1~2시간 배양한다.
그 후, FFA 세척 버퍼로 세 번 세척, 다시, 싱크대에 매번 플릭하여 세척 버퍼를 제거. TrueBlue 기판의 50 마이크로리터를 각 우물에 추가합니다. 반점이 최소한의 배경으로 완전히 정의될 때까지 2~15분 정도 기다립니다.
반점이 보이면 손으로 물로 부드럽게 씻어 서 모노레이어를 흐르는 물의 힘으로부터 보호합니다. 종이 타월에 마른 것을 두드려 주세요. 얼마 지나지 않아 해부 범위를 사용하여 각 우물의 반점을 수동으로 계산하거나 자동화된 스팟 카운터를 사용합니다.
ImmunoCapture 소프트웨어에서 각 샘플당 20~200개의 쉽게 구별할 수 있는 희석을 선택하고 복제 된 우물의 평균을 사용하여 밀리미터당 초점 형성 단위로 티터를 계산합니다. 이 실험에서, 이프나르 마우스가 지카 바이러스를 피하로 투여한 후 말초 및 중추 신경계 조직에서 바이러스 부담이 나타났다. 검출의 한계는 기관에 근거를 둔 그램 당 100에서 500 FFU 사이이었습니다.
포커스 형성 분석서를 수행할 때 기술적 실수는 최적이 아닌 결과를 초래할 수 있습니다. 간 독성, 간 고농도에 의해 구동, 분석의 감도 변경. 기관의 바이러스 성 티터가 독성보다 낮았을 때, FFA는 바이러스 성 티터를 정확하게 기록 할 수 없었습니다.
신장 세포는 높은 기관 농도로 독성을 도시했지만 낮은 장기 농도에서 바이러스 성 티터에 의해 극복되었다. 격렬한 파이펫팅 이나 세척은 단층을 제거 할 수 있습니다, 티터 결과의 잘못된 데이터보고로 이어지는. 실험실 벤치 흡수 성 용지에 존재하는 섬유 또는 머리카락은 개별 우물을 오염시키고 자동화 된 카운팅 프로그램을 사용하는 경우 상당한 오류를 일으킬 수 있습니다.
세포 밀도는 초점 형성 분석의 성공에 극적으로 영향을 미칠 수있는 또 다른 문제입니다. 분석의 시작 시 약 60%의 수렴성에서 세포는 90%의 수렴성으로 도금된 세포에 비해, 초점 형성 분석서에 영향을 미치는 극적인 차이를 보였다. 장기 수확이 효율적으로 완료되도록 실험의 크기와 범위를 계획하는 것은 절차의 가장 중요한 부분이며, 이어서 고품질 의 세포로 초점 형성 분석서를 시작합니다.
이 절차는 여러 바이러스 가족에 대 한 바이러스를 정량화 하는 데 사용 되었습니다. 이 프로토콜은 또한 치료 화합물을 위한 스크린에 적응하고 중화 항체 titers를 정량화할 수 있습니다. 이러한 기술은 살아있는 바이러스를 양수하는 데 사용되며 BMBL에 명시된 지침에 따라 적절한 안전 조치를 취해야 합니다.
