우리는 최적화 및 프로토콜을 검증하기 위해 기여 우리의 실험실에있는 모든 사람들에게 감사합니다. 이 작품은 INSERM과 국가 연구 기관 (ANR-09-JCJC-0116 및 ANR-11 BSV1-033-02)에 의해 지원되었다. ET는 고등 교육과 연구의 프랑스 내각에서 연구 교제 그녀의 박사 과정에 지원되었다.

솔루션 1. 준비 <ol><li> PBS 14.5 ml의 37 % 포름 알데히드 5.5 mL로 희석하여 PBS (저염)에서 10 %의 포름 알데히드를 준비한다. PBS 50 ㎖ 중의 글리신 3.8 g을 용해시켜 1 M 글리신, pH가 8.0을 준비한다; 1X PBS 100 mM의 글리신을 얻기 위해 상기 용액을 희석. </li><li> 1X PBS에서 0.1 % 트리톤 - X100을 준비합니다. 3.0 M 염화 나트륨, 25 ℃에서의 pH 7.0 탈 이온수 버퍼 제조 0.30 M 시트르산 삼 나트륨을 이용하여 20 배 염 구연산 나트륨 (SSC)를 준비한다. 1x에서이 버퍼를 희석 탈 이온수를 사용하여 0.01x. </li></ol> 세포의 2. 고정 참고 : 본 연구에서 HuH7 간암 세포주를 사용하지만,이 방법은 다른 접착 세포 배양에 적용 가능하다. <ol><li> 코팅 35 mm의 유리 바닥 접시 당 150,000 세포에서 (10 % 소 태아 혈청 0.01 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 재고 보충 DMEM 1g / L의 포도당에서 배양) 플레이트 HuH7 세포. 일차 전지에 작업 할 때문화, 콜라겐 코팅 요리를 사용합니다. </li><li> 다음 날, 배지를 제거합니다. PBS와 대기음 1 ml의 세포를 씻으십시오. 포름 알데하이드 10 % 1 ㎖를 첨가하여 세포를 고정하고, 교반하에 실온 (RT)에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 1 M 글리신 1 ㎖로 반응을 중지하고 회전에 의해 섞는다. 반응 정지 액을 제거하고 1X PBS 1 ㎖를 첨가하여 세포를 세척; 회전 및 흡인에 의해 선동. 세포에 100 mM의 글리신의 1 ML을 추가하고 15 교반하면서 실온에서 분 후 흡인 그들을 품어. 주 : 여기에서의 프로토콜은 중지 될 수 있고, 다음 단계는 또 다른 일 연기 될 수있다. 이 경우, 100 mM의 글리신 1 ㎖를 추가하고, 필요한 경우, 4 ℃에서 보관. </li></ol> 세포의 3 Permeabilization <ol><li> 15 교반하면서 실온에서 분 후 흡인 부화, 1X PBS에서 0.1 % 트리톤 - X100의 1 ML을 추가합니다. 일차 전지의 cultur 작업시 20 분 -이 배양 시간은 15까지 증가 될 수있다ES (예를 들어, 기본 쥐 간세포). 1X PBS 1 ㎖를 첨가하여 세포를 씻어; 대기음. </li></ol> 4. 차단 <ol><li> (키트에서 제공) 각 샘플에 차단 솔루션의 40 μl를 추가; 이 부피는 샘플을 커버하기 위해 증가 될 수있다. 습도 챔버에서 37 ° C에서 30 분 동안 요리를 부화. </li><li> 요리의 전원 차단 솔루션을 누릅니다. 이 재현성에 영향을 미칠 것 같이, 각 슬라이드에 대해 동일한 잔류 볼륨을 얻기 위해 시도합니다. 샘플이 건조하게하지 마십시오! </li></ol> 5. 차 항체 <ol><li> 1X PBS의 기본 항체를 희석과 요리 (VDAC1 마우스 항체 : 1/100, IP3R1 토끼 항체 : 1/500)의 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 또한, GRP75 또는 CypD 항체 (1/500에서 사용 모두 마우스 항체) 대신 VDAC1 사용할 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 습도 챔버에서 밤새 품어. 0.01 % 트윈 (TBS-T)와 슬라이드를 트리스 완충 식염수를 사용하여 두 번 씻으십시오. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. 근접 내고 분석 프로브 <ol><li> 근접 결찰 검정 프로브는 키트가 제공된다. 일차 항체의 종류에 따라 프로브를 선택합니다. </li><li> 항체 희석액에 5 : 두 개의 근접 내고 분석 프로브 1을 준비합니다. 혼합물을 실온에서 20 분 동안 앉아 할 수 있습니다. 희석 근접 내고 분석 프로브 솔루션을 추가합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 예열 된 습도 챔버 내에서 요리를 부화. TBS-T로 요리 두 번 씻으십시오. </li></ol> 7. 내고 <ol><li> 현장 검출 시약 텍사스 빨간색 키트에 사용합니다. </li><li> 고순도의 물에 5 잘 섞는다 : (키트에서 제공)을 5 배 결찰 1 개를 희석. 1시 40분 및 와류 (키트로 제공)를 1X 라이 게이션 용액으로 희석 리가. 즉시 샘플뿐만 아니라 이전까지 리가 아제를 추가 할 때까지 기다립니다. </li><li> 미리 가열 습도 참에 슬라이드를 각각의 샘플이 용액 (35 mm 유리 바닥 요리 40 μl를) 추가 및 배양BER 37 ℃에서 30 분. TBS-T로 슬라이드 두 번 씻으십시오. </li></ol> 8. 증폭 참고 :주의, 빛에 민감한 시약한다. <ol><li> 고순도의 물에 5 : (키트에서 제공)을 5 배 증폭 1 개를 희석. 냉동 블록을 사용하여 냉동실에서 중합 효소를 분리합니다 (-20 ° C). (키트에서 제공) 중합 효소 1 배 증폭 솔루션과 소용돌이에서 1:80 희석. 혼합물을 사용하기 전에 즉시 중합 효소를 추가합니다. </li><li> 각각의 샘플이 용액 (35 mm 유리 바닥 요리 40 μL)를 추가합니다. 37 ℃에서 100 분 동안 예열 된 습도 챔버에 슬라이드를 부화. 슬라이드의 오프 증폭 - 중합 효소 솔루션을 누릅니다. </li></ol> 9. 최종 세척 <ol><li> 2 분 동안 1 배 SSC 세척 버퍼에 슬라이드를 씻으십시오. 2 분 동안 0.01x SSC 세척 버퍼에 슬라이드를 씻으십시오. 요리는 어둠 속에서 실온에서 건조 시키십시오. </li></ol> 이미징 10. 준비 <ol&gt; <li> 공기 방울이 커버 슬립 아래에서 발견되지 얻을 보장 (수성 및 응고되지 않음) DAPI를 포함하는 설치 매체의 최소한의 볼륨을 사용하여 슬라이드를 탑재합니다. 매니큐어 가장자리를 밀봉하기 위해 사용될 수있다. (: 594 nm의, 방출 : 624 nm의 배율 : 63X 여기) 형광 또는 공 초점 현미경을 사용하여 분석하기 전에 약 15 분 동안 기다립니다. </li><li> 촬상 후, 어둠 속에서 -20 ° C에서 슬라이드를 저장한다. </li></ol>

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M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria.">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li><li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+anion-selective+channel+(VDAC)+in+the+plasma+membrane.">Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane.</a> FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).</li><li>Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortalin:+present+and+prospective.">Mortalin: present and prospective.</a> Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b...

미토콘드리아 소포체 (ER)은 세포 소기관 독립적 아니지만 미토콘드리아 관련 소포체 막 (MAM)로 정의 접촉 부위에서 구조적 및 기능적으로 상호 작용한다. 사실, MAMS은 양쪽에서 단백질 간의 상호 작용을 가능하게하여 ER의 세포막과 미토콘드리아가 밀접하게 나란히 놓이는되는 지역에 해당합니다. 그럼에도 불구하고,이 세포 소기관의 멤브레인은이 지역 내에서 융합하지 않는, 그래서 그들은 자신의 별도의 기관을 유지한다. MAMS은 에너지 대사 및 세포 생존 1-3에 영향을 미치는, 미토콘드리아에 ER에서 칼슘의 중요한 역할 (칼슘)과 인지질 전송을한다. 응급실과 미토콘드리아 사이의 관계는 제 1 전자 현미경으로 1970 년대에 가시화되었다. 그 이후, 투과 전자 현미경 4,5-, 6,7- 전자 단층 또는 ER 및 미토콘드리아 특정 형광의 면역 지역화S / 형광 단백질 (8)는 고전 ER-미토콘드리아의 상호 작용을 연구하는 데 사용되었다. MAM의 분석을위한 다른 유용한 도구는 세포 이하 분획의 사용에 기초한다. 이것은 퍼콜 구배 (9)에 결합 된 차동 초 원심 MAM 분획을 분리 할 수있다. 그러나, 최종 제품은 풍부한 MAM 분획이 아닌 순수한 분획을 포함한다. 전부,이 전략은 특히 민감한 및 / 또는 정량적하지 않습니다, 그들은 큰 심사에 쉽게 의무가 없습니다. 다르게는, 약물 - 유도 성 형광 간 소기관 링커를 사용하여 유전 학적 접근이 등장 있지만 단백질 10의 내인성 발현 수준 소기관 상호 작용의 분석을 허용하지 않는다. MAM 11의 IP3R / GRP75 / VDAC 복잡 Szabadkai의 발견에 기초하여, 우리는 ER-미토콘드리아의 상호 작용을 분석하는 정량적 방법을 개발 하였다. 우리는 현장 근접 ligati에 사용분석에 감지하고 VDAC1 및 IP3R1 사이의 상호 작용을 정량화하고, 고정 셀 (12)의 MAM 인터페이스에서 칼슘 2 + -channeling 복잡한에 관여하는 두 소기관 표면 단백질. 간단히 말해서, 우리는 ER 막에서 외부 미토콘드리아 막 (마우스 항 - VDAC1 차 항체) 및 IP3R1 (토끼 항 IP3R1 차 항체) (그림 1, 패널)에서 VDAC1을 프로빙. 그리고, 상기 분석에있어서, 우리는 항 - 마우스와 상보적인 올리고 뉴클레오티드로 확장되어 접합 항 - 토끼 IgG를 (마우스 및 토끼 근접 결찰 분석법 프로브) 모두를 추가했다. 두 개의 표적 단백질이 40 내지 이하의 거리에있는 경우, 올리고 뉴클레오티드는 원형의 DNA를 주형 (도 1, 패널 B)의 형성을 허용하도록 연속적으로 첨가 커넥터 올리고와 혼성화 할 수있다. 이 원형 DNA 분자에 공유 변위 센서 중 하나에 장착 된 단일 가닥 DNA 생성물 생성 결찰 증폭된다 (도 1, 패널 c) </stro&gt; NG. MAM 계면에서 ER 및 미토콘드리아 간의 거리 내지 6 근접 결찰 증폭 인해 텍사스 레드 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브 (도 1, 패널 (D)의 혼성화에이어서 검출 선도 할 수있는 (25)는 10 nm 내지 때문에 ). 각 형광 점 따라서 개별 셀의 현장에서 ER-미토콘드리아 상호 작용의 정량화를 허용 VDAC1 / IP3R1 사이의 상호 작용을 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54899/54899fig1.jpg" /> 그림 1 : 제자리 근접 내고 분석에 의해 소포체 - 미토콘드리아 상호 작용의 검출의 개략도. a) VDAC1 및 MAM의 계면 근방에서 그 에피토프에 결합 할 수 IP3R1 향한 토끼 차 항체에 대해 유도 마우스 일차 항체 b) 인접 결찰 프로브 쌍의 또마우스와 토끼 IgG에 대해 지시했다. 이 프로브는 커넥터 올리고의 결찰에 대한 템플릿을 형성 할 수있는 DNA 가닥을 첨부했습니다. c) 결찰 후 형성된 원형의 DNA 가닥이 텍사스 레드 표지 된 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 형광 현미경으로 도트 시각화) D 증폭 될 수있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54899/54899fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 시츄 근접 결찰 분석 실험에서 유사한 항체 GRP75 / IP3R1 쌍뿐만 아니라 시클로 필린의 D (CypD) 수행 될 수있다 / IP3R1 항체 CypD는 MAM 계면에서 IP3R / GRP75 / VDAC 복합체와 상호 작용하는 것으로 나타났다 것을 고려 12-14.

<table><tbody><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F-8775</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G-8898</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glass bottom culture dishes</td><td>MatTeK corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td>Sigma</td><td>DUO-92004 or DUO-92002</td><td>provided in the Duolink PLA probes, Sigma</td></tr><tr><td>VDAC1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>IP3R1-H80 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc28614</td><td></td></tr><tr><td>CypD antibody</td><td>Abcam</td><td>ab110324</td><td></td></tr><tr><td>Grp75 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc13967</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>euromedex</td><td>ET220</td><td>Dilute to obtain 1x</td></tr><tr><td>Tween 100x</td><td>euromedex</td><td>2001-B</td><td>dilute in TBS to obtain 0,01%</td></tr><tr><td>PLA Probes Mouse MINUS</td><td>Sigma</td><td>DUO-92004</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td>PLA Probes Rabbit PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO-92002</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td>Duolink detection reagents red</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td>Ligation solution</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Part of the Duolink detection reagents red, Sigma</td></tr><tr><td>Ligase</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Part of the Duolink detection reagents red, Sigma</td></tr><tr><td>Amplification solution</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Part of the Duolink detection reagents red, Sigma</td></tr><tr><td>Polymerase</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Part of the Duolink detection reagents red, Sigma</td></tr><tr><td>Duolink Mounting Medium</td><td>Sigma</td><td>DUO80102</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Softwares&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Blob-finder software</td><td></td><td></td><td>BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td>Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr></tbody></table>

study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

이 프로토콜을 사용하여 우리의 경험을 바탕으로, 우리는 안전하게 고정 된 세포에서 ER-미토콘드리아 상호 작용의 시각화 및 정량이 방법을 추천 할 수 있습니다. 항체의 여러 쌍을 사용 HuH7의 간암 세포주 인 시츄 근접 결찰 분석법 - 가시 ER-미토콘드리아 상호 작용의 대표 화상이 도시되어있다. 형광 현미경에 의해도 2에 도시 된 바와 같이, 각?...

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Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

여기, 우리는 고정 된 세포에서 소포체와 미토콘드리아의 내생 적 상호 작용을 시각화하고 고감도로 정량화 할 수있는 절차를 설명합니다. 프로토콜은이 미토콘드리아 관련 막 계면에서 이노시톨에게 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 / 혈당 조절 단백질 75 / 전압 가변 음이온 채널 / 시클로 필린의 D 복합체 타겟팅 시츄 근접 결찰 분석법 최적화 기능.

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

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Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

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비디오: Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation is a popular technique to detect protein-protein interactions. Subsequent Western blot analysis is the most common method to visualize co-immunoprecipitated proteins. Recently, the proximity ligation assay has become a powerful tool to visualize protein-protein interactions in situ and provides the possibility to quantify protein-protein interactions by this method. Similar to conventional immunocytochemistry, the proximity ligation assay technique is also based on the accessibility of primary antibodies to the antigens, but in contrast, proximity ligation assay detects protein-protein interactions with a unique technique involving rolling-circle PCR, while conventional immunocytochemistry only shows co-localization of proteins.
Nuclear factor 90 (NF90) and RNA-binding motif protein 3 (RBM3) have been previously demonstrated as interacting partners. They are predominantly localized in the nucleus, but also migrate into the cytoplasm and regulate signaling pathways in the cytoplasmic compartment. Here, we compared NF90-RBM3 interaction in both the nucleus and the cytoplasm by co-immunoprecipitation and proximity ligation assay. In addition, we discussed the advantages and limitations of these two techniques in visualizing protein-protein interactions in respect to spatial distribution and the properties of protein-protein interactions.

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

연구

생화학

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes such as development are affected. The Caenorhabditis elegans germline is a great model system for studying PPIs that are related to the regulation of stem cells, meiosis, and development. There are a variety of well-developed techniques that allow proteins of interest to be tagged for recognition by standard antibodies, making this system advantageous for proximity ligation assay (PLA) reactions. As a result, the PLA is able to show where PPIs occur in a spatial and temporal manner in germlines more effectively than alternative approaches. Described here is a protocol for the application and quantification of this technology to probe PPIs in the C. elegans germline.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates use of the proximity ligation assay to probe for protein-protein interactions in situ in the C. elegans germline.

근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

발생학

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

검출<em&gt; 현장에서</em상기&gt; 단백질 - 단백질 복합체<em&gt; 초파리</em근접 내고 분석을 사용하기&gt; 애벌레 신경 근육 접합부

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

신경과학

<meta charset="utf8"></head><body>고처리량 스크리닝을 위한 ER-Mitochondria 접촉을 측정하기 위한 간단한 분석

Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells

Endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites play a critical role in cell health and homeostasis, such as the regulation of Ca2+ and lipid homeostasis, mitochondrial dynamics, autophagosome and mitophagosome biogenesis, and apoptosis. Failure to maintain normal ER-mitochondrial coupling is implicated in many neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s disease, Parkinson&#39;s disease, amyotrophic lateral sclerosis, and hereditary spastic paraplegia. It is of considerable significance to explore how the dysregulation of ER-mitochondrial contacts could lead to cell death and whether repairing these contacts to the normal level could ameliorate neurodegenerative conditions. Thus, improved assays that measure the level of these contacts could help to illuminate the pathogenic mechanisms of these diseases. Ultimately, establishing simple and reliable assays will facilitate the development of new therapeutic strategies. Here we describe&#160;a split-luciferase assay to quantitatively measure the level of ER-mitochondria contacts in live cells. This assay can be used to study the pathophysiological role of these contacts as well as to identify their modulators in high-throughput screening.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: ER-미토콘드리아 접촉의 조절 및 조절 장애 - 신경퇴행성 질환 발병에 대한 시사점

We have established a split-luciferase reassembly assay to monitor the endoplasmic reticulum-mitochondria contacts in live cells. Using this assay, we describe a protocol to quantitatively measure the level of these inter-organelle couplings in HEK293T cells, under the condition of chemical treatment.

살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하기 위한 Split-Luciferase 재조립 분석

Endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites play a critical role in cell health and homeostasis, such as the regulation of Ca2+ and lipid ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

생물학

Correlative Microscopy Reveals Stress-Induced Mitochondria-Lysosome Interactions

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interactions between Mitochondria and Lysosomes

Cellular organelles, such as mitochondria and lysosomes, display dynamic structures. Despite the higher resolution of transmission electron microscopy for structural analysis, light microscopy is essential for the visualization of dynamic organelles by target-specific labeling. The following protocol describes a method that combines dual-color correlative light and electron microscopy (CLEM) to observe the interactions between mitochondria and lysosomes. In this study, mitochondria were labeled with mEosEM (Mito-mEosEM) and lysosomes with TMEM192-V5-APEX2. The results obtained from CLEM images enable us to observe the changes in the interactions between mitochondria and lysosomes under external stress conditions. Treatment with bafilomycin (BFA), which inhibits lysosomal function, resulted in an increase in contact between mitochondria and lysosomes, leading to the formation of fragmented mitochondria trapped inside lysosomes. Conversely, treatment with U18666A, which inhibits cholesterol export from lysosomes, caused lysosomes to be surrounded by mitochondria, indicating a distinct form of interaction. This study presents an effective method for observing the interactions between mitochondria and lysosomes in fixed cells. Furthermore, CLEM imaging with dual-color probes offers a powerful tool for future investigations of organelle dynamics and their implications for cell function and pathology.

This protocol describes a mechanism for using correlative light and electron microscopy to visualize the interaction of mitochondria and lysosomes labeled with mEosEM and APEX2, respectively.

Cellular organelles, such as mitochondria and lysosomes, display dynamic structures. Despite the higher resolution of transmission electron microscopy for ...

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해

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검출

살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하기 위한 Split-Luciferase 재조립 분석

살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하기 위한 Split-Luciferase 재조립 분석

살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하기 위한 Split-Luciferase 재조립 분석

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interactions between Mitochondria and Lysosomes