미토콘드리아 기능 장애는 많은 질병, 특히 신경 퇴행성 및 대사 장애와 관련이 있습니다. 따라서 미토콘드리아가 리소좀에 의해 어떻게 조절되는지 이해할 수 있다면 새로운 치료 전략을 개발하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜에서는 미토콘드리아 리소좀 접촉을 시각화하는 이중 색상 CLEM 방법을 시연했습니다.
Correlative light and electron microscopy는 광학 현미경과 전자 현미경의 장점을 결합한 이미징 기술입니다. 이 프로토콜에서는 이중 색상 프로브를 사용하여 미토콘드리아 리소좀 접촉을 시각화하는 CLEM의 이점을 극대화합니다. 전통적인 전자 현미경 샘플링 방법을 사용하여 리소좀 내에서 분해되는 미토콘드리아를 명확하게 구별하는 것은 어렵습니다.
본 연구는 리소좀과 미토콘드리아의 effector domain을 명확하게 보여준 고분해능 CLEM 결과를 제시한다. 이중 색상 채취 방법은 리소좀 내에서 미토콘드리아 효과기를 정확하게 구별하는 데 사용되었습니다. 우리의 연구는 미토콘드리아가 리소좀과 상호 작용한다는 것을 밝혀냈습니다.
우리의 연구에 따르면 미토콘드리아는 다양한 외부 스트레스에 반응하여 다양한 방식으로 리소좀과 상호 작용합니다. 이러한 현상의 원인과 조절 요인을 연구함으로써 세포 내 미토콘드리아 품질 관리를 이해하는 데 도움이 되는 통찰력을 얻을 수 있습니다. 먼저 HeLa 세포를 35mm 유리 격자 바닥 배양 접시에서 1의 10의 5의 거듭제곱 밀도로 배양합니다.
다음 날, transfection 시약을 사용하여 plasmid와 30%-40% confluency로 세포를 동시 transfection합니다. 형질주입 후 18시간 동안 디메틸설폭사이드 또는 U18666A와 바필로마이신 A1으로 세포를 처리합니다. 컨포칼 이미징의 경우, 배양 배지를 제거하고 즉시 섭씨 30-37도에서 250마이크로리터의 따뜻한 고정액을 첨가합니다.
즉시 정착액을 제거하십시오. 1.5ml의 새 고정액으로 교체하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 10분 동안 세포를 세 번 세척하고 각각 1ml의 얼음처럼 차가운 0.1몰 카코딜산 나트륨 완충액으로 세척합니다.
다음으로, 차가운 20밀리몰 글리신 용액 1ml를 첨가하여 알데히드를 담금질합니다. 얼음 위에서 10분 동안 세포를 배양한 후, 차가운 0.1몰 카코딜레이트 나트륨 완충액에서 각각 10분씩 3회 세척합니다. 그런 다음 샘플 접시에 500마이크로리터의 Amplex 레드 용액을 넣고 얼음에서 5분 동안 배양합니다.
그 후, Amplex 레드 용액을 제거하고 0.1몰 카코딜레이트 나트륨 완충액으로 각각 10분씩 세포를 세 번 헹굽니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 3x3 타일 스캔 모드에서 관심 세포 주변 영역을 이미지화합니다. 미분 간섭 대비와 형광 신호를 모두 캡처하여 40배 대물렌즈를 사용하여 그리드 접시의 그리드와 문자를 식별하고 기록합니다.
40배 대물렌즈를 사용하여 고배율로 표적 세포를 이미지화하고 Z 스택 이미지를 획득합니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 Amplex 붉게 염색된 세포를 이미징한 후 섭씨 4도에서 1% 감소된 사산화오스뮴 1ml를 첨가하고 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도의 증류수로 각각 10분 동안 세 번 헹굽니다.
등급이 매겨진 에탄올 시리즈에서 실온에서 매번 15분 동안 탈수합니다. 이제 에탄올과 에폭시 수지를 3 대 1, 1 대 1, 1 대 3의 부피 비율로 혼합하여 각 혼합물의 총 300 마이크로 리터를 준비합니다. 각 에폭시 수지 혼합물을 접시에 붓고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
다음으로, 새로운 에폭시 수지로 채워 매립 캡슐을 준비합니다. 관심 영역에서 튜브 또는 캡슐을 거꾸로 뒤집어 섭씨 60도의 오븐에 48시간 동안 넣어 중합시킵니다. 그런 다음 바닥 유리와 폴리머 블록을 액체 질소에 담그어 분리합니다.
표본 블록을 s에 놓습니다.amp울트라 마이크로톰의 le 홀더를 선택하고 트리밍 블록에 설정합니다. 면도날을 사용하여 관심 물체 주위의 수지를 직사각형 또는 사다리꼴 모양으로 자릅니다. 트리밍된 시편 블록을 샘플 홀더에 놓고 다이아몬드 블레이드를 조정합니다.
초소형 절편을 사용하여 편평하게 삽입된 세포에서 약 60-70나노미터의 초박형 절편을 자릅니다. 핫 플레이트에서 건조하기 전에 formvar 코팅된 슬롯 그리드에서 일련 섹션을 수집합니다. 그 후, 2분 동안 콘트라스트 염색으로 섹션을 염색하고 1분 동안 구연산납을 첨가합니다.
그런 다음 관찰을 위해 투과 전자 현미경 또는 TEM 샘플 홀더에 그리드를 놓습니다. 광학 현미경의 미분 간섭 대비 이미지를 기반으로 관심 대상 세포를 식별하고 1, 700배 배율에서 타일형 중첩 이미지를 사용하여 전체 세포 영역을 이미지화합니다.ImageJ Fiji를 사용하여 HeLa 세포의 상관 광 및 전자 현미경 이미지를 얻으려면 ImageJ Fiji를 시작하고 파일, new, TrakEM2 blank를 클릭합니다. 을 클릭하고 저장 폴더를 선택하여 새 TrakEM2 프로젝트를 만듭니다. 원시 타일 이미지 데이터를 작업 공간으로 끌어다 놓아 타일 이미지 데이터셋을 엽니다.
마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 선을 선택하고, 이 레이어의 모든 이미지를 몽타주하고, 탄성 비선형 블록 대응을 선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 나머지 매개 변수에 대한 기본값을 수락합니다. 그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 내보내기를 선택한 다음 평면 이미지 만들기를 선택하여 스티치된 이미지를 만듭니다.
그런 다음 파일을 클릭하고 다른 이름으로 저장하여 이미지를 저장합니다. 형광 이미지의 크기를 조정하려면 사진 확대 소프트웨어를 엽니다. 파일을 클릭하고 이미지를 열고 선택합니다.
너비와 높이를 입력합니다. 전자 현미경 이미지의 크기와 일치합니다. 크기 조정 방법에 적용할 알고리즘을 선택합니다.
파일을 클릭하고 다른 이름으로 저장하여 크기가 조정된 이미지를 저장합니다. ImageJ Fiji를 열고 크기가 조정된 형광과 스티칭된 전자 현미경 사진을 작업 공간으로 끌어다 놓습니다. 플러그인 빅 데이터 뷰어 및 빅 워프를 클릭하여 등록을 시작합니다.
그런 다음 드롭다운 메뉴를 클릭하여 형광 현미경 사진 이미지를 동영상 이미지로, 전자 현미경 사진 이미지를 대상 이미지로 선택합니다. 확대/축소, 이미지 회전 및 이동과 같은 기능을 사용하여 형광 및 전자 현미경 사진 이미지를 비교합니다. 키보드의 스페이스 바를 눌러 랜드마크 모드로 전환하고 마우스 왼쪽 버튼을 눌러 두 이미지에서 식별된 랜드마크를 3개 이상 표시합니다.
식별된 모든 랜드마크를 표시한 후 파일로 이동하여 동영상을 내보내고 확인을 클릭합니다. 변환된 형광 현미경 사진 이미지가 있는 새 팝업 창이 나타납니다. 파일을 클릭하고 다른 이름으로 저장하여 변환된 형광 현미경 사진 이미지를 저장합니다.
CLEM 이미지를 오버레이하려면 변환된 형광 현미경 사진 이미지와 스티칭된 전자 현미경 사진 이미지를 ImageJ 작업 공간으로 끌어다 놓습니다. 이미지, 유형 및 8비트 색상을 클릭합니다. 형광 및 전자 현미경 사진 이미지 모두에 대해 동일한 이미지 유형을 설정합니다.
이미지를 클릭하고, 색상을 지정하고, 채널을 병합합니다. 이미지를 결합합니다. 파일을 클릭하고 다른 이름으로 저장하여 CLEM 이미지를 저장합니다.
바필로마이신 A1 처리한 세포에서 리소좀에 갇힌 미토콘드리아가 관찰되어 자가포식이 억제되고 미토콘드리아 질이 저하되었음을 나타냈으며, 대조 세포는 미토콘드리아가 리소좀과 상호 작용하지만 리소좀에 휩싸이지는 않았음을 보여주었으며, 대조 세포에서 관찰된 미토콘드리아 파괴는 미토콘드리아가 리소좀에 삼켜지지 않고 둘러싸고 있음을 보여주었습니다. U18666A 처리된 세포는 미토콘드리아와 리소좀 사이의 상호 작용이 증가했으며, 일부 리소좀은 미토콘드리아에 휩싸였습니다.
