우리는 시아 노 박테리아 균주를 제공하기 위해 대학교 자치시 마드리드에서 박사 안토니오 Quesada에 감사합니다. 이 작품은 스페인 Ministerio 드 Economía y를 Competitividad의 Subdirección 일반 드 Proyectos 드 Investigación (MINECO)에 의해 투자되었다, 더를 부여하지 않습니다. AYA2011-24803 및 ESP2014-58494-R.

면역원 1. 준비 <ol><li> 표 1에 기재된 조건 하에서 해당 배지에서 각각 시아 노 박테리아 균주를 성장한다. 참고 : 각 시아 노 박테리아 균주에 대한 성장 매체와 문화 조건은 표 1에 나열되어 있습니다. 모든 시아 노 박테리아 균주, K17를 제외하고, 자치시 대학 (마드리드, 스페인)에서 안토니오 사다의 그룹에 속한다. Planktothrix의 rubescens에 대한 항체는 Vilasouto 저수지 (북부 스페인)에서이 cyanobacterium의 특이 꽃의 자연 시료에서 생성되었습니다. </li><li> 늦은 지수 또는 고정 성장 단계의 배양으로 약 108 세포 / ㎖를 얻기 위해 광학 현미경으로 세포 계수 챔버를 이용하여 세포 수를 정량화. </li><li> 5 분 2,000 XG에 원심 분리하여 문화의 5 ㎖에서 수확 세포. </li><li> 뜨는을 취소하고 10 ML의 욕조에서 세포를 재현 탁1X 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖ (1X PBS)와 E는 / ㎖를 약 108 세포를 얻었다. </li><li> 균질화 및 휴대용 핸드 헬드 초음파 처리기를 사용하여, 얼음에 30 내지 60-S, 일시 정지, 5 회, 30 초마다 초음파 처리하여 현탁액의 용균 또는의 수욕에 튜브를 침지하여 최대 진폭 (30 kHz에서)에서 셀 계 장애. </li><li> cyanobacterium의 각 변형 1.5 - 반복 1.3 단계를 반복합니다. 주 : 초음파 처리가 세포 분열 및 세포 콘텐츠 자료를 생산하고 있습니다. 단백질과 다당류는 지질 및 핵산 좋은 면역원, 특정 분자가 있지만, 그들 자신에 의해 체액 성 면역 반응을 유도하지 않습니다. 따라서, 이들은 분자의 복잡성을 증가시키는 등의 다당류 나 단백질 등의 담체에 결합한다. 또한, 초음파 항체 생산을 트리거 할 수 있습니다 세포 내 물질을 해제합니다. </li></ol> 폴리 클로 날 항체 2. 생산 <ol><li> 첫 번째 IMM 준비완전 프로 인트 보조제 0.5 ㎖의 단계 150에서 얻어진 초음파 파쇄 0.5ml를 혼합하여 투여 unogen. 다중 클론 토끼 항체 생산 용 동물 시설의 오퍼레이터에게 제공한다. </li><li> 불완전 프로 인트 보조제 0.5 ㎖의 단계 150에서 얻어진 동일한 파쇄 / 해물을 0.5 mL로 혼합하여 항체 생산 공정 메모리 부스트로서 더 사용 전과 3 개의 투여 량을 준비한다. 항체의 제조 방법을 수행하기 위해 동물 시설에 보내기. </li><li> 반복 2.1 및 각각의 새로운 항체 생산 공정에 대한 2.2 단계를 반복합니다. 참고 : 적절한 라이선스 및 교육을 동물로 작업해야하기 때문에 일반적으로 항체 생산, 전문 동물 시설이나 회사에 위탁된다. 회사는 혈청 시료 내에 존재하는 항원 - 특이 적 항체의 양의 상대적 효소 면역 분석법 (ELISA) 측정을 공급한다. </li></ol> 3. 항체을 정제ication <ol><li> 면역 단백질-A 친화도 크로마토 그래피에 의해 2 단계에서 수집 된 예비 면역 혈청 모두에서 면역 글로불린 G (IgG의) 부분을 정제. 일부 상용 정제 키트, 카트리지 시스템을 기반으로, 잘 작동; 공급자의 지침을 따르십시오. </li><li> 정제 키트 탈염 시스템을 제공하지 않는 경우, 투석 또는 100 kDa의 (또는 그 이하) 막 공극 크기 원심 여과 장치를 이용하여 역시 PBS를 0.1X하는 정제 된 항체의 용출 버퍼를 변경. </li><li> 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 또는 브래드 퍼드 (23) 라 24 또는 Bicinchoninic 산 (BCA) 25 비색 방법을 사용하여 항체 농도를 결정한다. 주 : 그들은 에폭시기로 활성화 된 고체 표면에 대한 결합에 대해 항체와 경쟁하기 때문에, 용출 버퍼 (예, 트리스 완충액) 아민기를 포함하지 않도록하는 것이 중요하다. 푸 후rification ELISA로 항체의 활성을 시험하는 것이 중요하다. </li></ol> 4. 형광 항체 라벨링 <ol><li> 디메틸 술폭 시드 100 μL (DMSO)로 표지 한 단백질 mg의 염료를 함유하는 상업적 바이알을 용해하여 형광 색소 (예를 들어, 원적외선 형광 염료)와 (3)에서 얻어지는 정제 항체를 라벨. 50mM의 인산 완충 식염수 (PH 8.5) 50 μL의 최종 부피에 2 ㎎ / ㎖의 농도에서 각각의 항체 제조에 용해 된 염료의 2 μL를 추가한다. </li><li> 주위 온도에서 1 시간 및 진동 플랫폼에서 1,200 rpm으로 연속 교반하에 라벨 반응을 유지한다. </li><li> 크기 배제 크로마토 그래피에 의해 표지 된 항체를 정제하여 (예를 들어, 컬럼에 포획 1.5 내지 30 kDa의 사이에 분별 범위의 겔을 사용하는) 제조업체 권고 다음. </li><li> 280 nm에서와 용출액에서 650 nm에서의 흡광도를 측정하고 라베를 계산공급 업체의 권장 사항은 다음 링의 효율성. 참고 : 최대 50 × 50가-μL 항체 - 라벨 반응은 단백질의 표지 1 mg을위한 형광 염료의 단일 유리 병으로 수행 할 수 있습니다. 4.3 단계 후 담금질 처리를 피하기 위해 불투명 0.5 ㎖의 튜브를 사용하여, 또는 알루미늄 박이나와 튜브를 덮도록 권장된다. 의 IgG 항체의 경우, 최적의 라벨은 항체의 몰 당 3-7 몰의 염료에 의해 달성된다. </li></ol> 5. CYANOCHIP 생산 <ol><li> 인쇄 액의 항체 및 컨트롤 <ol><li> 0.01 % (v / v)의 트윈 20 (비 - 이온 성 세제), 최종 농도로서 모두와 상용 1X 단백질 인쇄 버퍼에 1 ㎎ / ㎖에서 각각의 항체를 혼합하여 인쇄 솔루션의 각 정제 된 항체 30 μL를 준비한다. 주 : 대안 적으로, 항체 용액을 20 % 글리세롤, 1 % 수크로오스 (또는 트레할로스, 보존제 등), 0.01 % (/ V w) (v / v)의 탄산 완충액 트윈 20 (PH 8.5)를 포함 할 수있다. </li><li> 30 μL 컨트롤과 같은 프린팅 용액의 준비 : 1 밀리그램 (a) 1X 단백질 인쇄 버퍼 0.01 % (v / v)의 트윈 20, (b) 단백질 정제 된 예비 면역 혈청 / 1X 단백질 인쇄 버퍼와 용액 0.01 % (v / v)의 트윈 20, 1 밀리그램 (c) 소 혈청 알부민 (BSA) / ㎖의 0.01 %와 1X 단백질 인쇄 버퍼 (v / v)의 트윈 20. </li><li> (예를 들어, 1 μg의 / mL의 50 μg의 / ㎖에서) 트윈 (20) 1 배 단백질 인쇄 버퍼, 단계 5.1.1에서와 같이 서로 다른 농도에서 형광 표지, 정제 미리 면역 혈청의 30 μL를 준비합니다. 이 샘플은 형광 프레임 마커로 및 안보 후 상대 형광 정량에 사용됩니다. </li><li> 폴리 프로필렌과 같은 고품질로 384 웰 마이크로 마이크로 어레이 제조 30 단계 5.1.1, 5.1.2에서 제조 한 인쇄 용액 웰 당 μL 및 5.1.3 추가. 주 : 단백질 인쇄 버퍼는 항체의 품질과 안정성을 증가시키고, 트윈 20은 스폿 모 균일화rphology 및 단백질 커플 링까지를 구축합니다. 사용하기 전에 4 ° C에서 384 웰 마이크로 플레이트를 유지하는 것이 좋습니다. 오랜 시간 동안 -20 ° C에서 보관합니다. 폴리 프로필렌은 낮은 DNA, 단백질, 세포 추출물 및 고유 바인딩 작은 분자를 가지고있다. </li></ol></li><li> 현미경 슬라이드 상에 항체 인쇄 주 : 접촉 분할 바늘 또는 압전 프린터 또는 &quot;잉크 젯&quot;기술로서 비접촉 형 장치와 같이, 서로 다른 배열의 플랫폼을 사용하여 활성화 된 현미경 슬라이드 상에 항체를 출력한다. 이 작품에서, CYANOCHIP는 정기적으로 μm의 규모에 항체의 거리 nL 수량에 얼룩을지게 할 수있는 로봇 시스템 (Arrayer에)를 사용하여 접촉에 의해 인쇄되어 있습니다. <ol><li> 상대 습도 50 % - 20 ° C, 40 행의 인쇄 실내의 환경 조건을 설정한다. </li><li> 슬라이드 기판을 설정 (예를 들어, 75- × 25-mm 에폭시 활성화 현미경 유리 슬라이드는) 여러 동일한 항체 ARRA을 수행 할 수각 슬라이드에 YS. </li><li> 중으로 스폿 패턴 제어 및 기준 프레임을 포함하여 각각의 정제 된 항체를 스폿; 직경이 200㎛ - 이러한 조건에서, 스폿 (180)이다. </li><li> 인쇄 후, 4 ℃에서 보관 한 후이를 건조 수 있도록 주변 온도에서 적어도 30 분 동안 슬라이드를두고; 현장에서의 작업에 대한 상기 슬라이드를 반송 할 수 있고, 몇 달 동안 주위 온도에서 저장된다. 주 : CYANOCHIP는 슬라이드 당 3 × 8 동일한 마이크로 어레이 또는 1 × 9 마이크로 어레이 형식으로 9 동일한 배열을 가진 세중 자리 마이크로 어레이 형식으로 인쇄됩니다. 각 배열의 크기는 24 웰 개스킷 (3 × 8 혼성화 챔버 내에서 일반적으로 7.5 X 6.5 mm)에 대한 반응 챔버의 크기보다 클 수 없습니다해야합니다. </li><li> 환경 시료를 분석하는 마이크로 어레이를 사용하기 전에 적정 곡선의 각 항체 작용 희석액을 결정 FSMI를 사용한다. 각 항체에 대해 해당 IMM 표준 농도를 사용하여unogen (3월 10일에서 4월 10일까지 세포 / ㎖) 및 형광 항체의 연속 희석 (1 내지 500 및 1 : 32,000). 최적의 항체 농도는 적정 곡선에서 얻어진 최대 신호 강도의 50 %에 상당한다. 블란 등의 알에 기재된 바와 같이 또한, 각 항체에 대한 민감도와 특이도가 결정되어야한다. 22. </li></ol></li></ol> 형광 샌드위치 마이크로 어레이의 면역을위한 환경 다중 동시 추출 6. 준비 (FSMI) <ol><li> 액체 샘플에서 다중 동시 추출 <ol><li> (물이 저수지의 해안에서, 예를 들어 물) 멸균 주사기로 액체 시료 100 mL에 - 1을 시료의 양이 대상의 전위 농도에 따라 크게 좌우된다. </li><li> 3 ㎛의 기공 크기, 47 mm 직경의 폴리 카보네이트 필터를 통해 물이 샘플을 통과시켜 세포를 농축; 휴대 농도(3) 10 내지 - 108 세포 / ㎖의 양성 검출하는 것이 바람직하지만, 실제 농도는 알려져 있지 않다. </li><li> 그것을 긁어; 변형 TBS 버퍼 1 ㎖, 트윈 20 보강 완충액 (0.4 M 트리스 -HCl (pH를 8), 0.3 M의 NaCl, 0.1 % 트윈 20 TBSTRR)와 필터에 수집 된 매스를 복구 15 ML의 튜브에 주걱. </li><li> 균질화 또는 바로 아래로 여러 번을 피펫 팅에 의해 단계 1.5에 기재된 바와 같이, 휴대용 초음파 처리를 이용하여 해리하는; 이는 마이크로 어레이 분석을 위해 샘플을 준비한다. </li></ol></li><li> 고체 시료에서 다중 동시 추출 <ol><li> 10 ㎖의 튜브에 고체 시료 0.5 g (예를 들면, 바위, 토양 또는 퇴적물)까지 달아 TBSTRR 2 용액을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 강력한 초음파 처리 혼 수조로 튜브를 침지함으로써, 또는 휴대용 초음파 처리기를 사용하여, 상기 튜브에 소니 케이 터 프로브를 침지시켜 초음파 처리. 적어도 5 × 30의를 수행얼음 동안 30 초 동안 정지 30 kHz의에서 사이클. </li><li> 10 - 12 mm 직경에 연결된 10 mL의 주사기 -5- 20 μm의 공경 나일론 필터 홀더 모래, 점토, 기타 거친 물질을 제거하는 필터. 1.5 mL의 튜브에 필터를 통해 샘플을 누릅니다. 필터가 포화되면, 주사기의 현탁액을 교반하고 새에 가지고; 이 면역 분석 (단계 7)에 여과 재료를 준비한다. 주 : TBSTRR의 완충 능력은 시료의 종류에 따라 다릅니다. 이는 분석 물질의 효소 분해의 영향을 피하기 위해 환경 추출물의 제조 직후 면역 측정법을 수행하는 것이 중요하다. 대안으로, 다음 단계까지 -80 ℃에서 환경 추출물 및 동결로 프로테아제 억제제를 추가한다. </li></ol></li></ol> 7. 형광 샌드위치 마이크로 어레이 면역 (FSMI) <ol><li> CYANOCHIP 차단 참고 : 즉시 사용하기 전에 페이지를 처리rinted 슬라이드 모든 자유 에폭시기를 차단 및 비 - 공유 결합 된 항체의 잉여를 제거하는 슬라이드. <ol><li> 5 %와 0.5 M 트리스 - 염산 (pH를 9)에 마이크로 어레이를 담가 5 분 로커 플랫폼에서 온화한 교반과 함께 깨끗한 표면에 BSA 용액 (예를 들어, 페트리 접시 또는 50 mL의 관) (/ V w). 또는, 직면하고있는 마이크로 어레이의 관광 명소와 상기 용액의 100 ~ 200 μL에 드롭에 아래로 슬라이드를 배치합니다. 3 남겨 - 5 분 ​​후 진행합니다. </li><li> 조심스럽게 플라스틱 스쳐 집게를 사용하여 슬라이드를 선택; 감동 마이크로 어레이 영역을 피하려고. 부드럽게 종이 타월에 슬라이드를 노크하여 액체의 초과를 제거합니다. 2 %와 0.5 M 트리스 - 염산 (pH를 8) 로커 플랫폼에서 온화한 교반과 함께 30 분 동안 (w / v)의 BSA 용액에 담가. </li><li> 현미경 슬라이드에 적합한 시판의 microcentrifuge 사용 - (1 분 동안 300 XG 200) 짧은 원심 분리를 수행하여 슬라이드를 건조. 또한, 부드럽게 ONT 노크하여 슬라이드를 건조OA 종이 수건. </li></ol></li><li> 마이크로 어레이와 다중 동시 샘플 추출물의 배양 <ol><li> 다수의 마이크로 어레이 24 우물과 상업 마이크로 어레이 혼성화 카세트에서 슬라이드를 설정; 공급자의 지침을 따르십시오. </li><li> 슬라이드와 카세트 조립 후, 시료 추출물 또는 카세트의 각 웰에 TBSTRR에서의 희석액 50 μL까지 피펫. </li><li> 각 샘플 단계를 반복 7.2.2 분석한다. </li><li> 빈 대조군으로 TBSTRR 피펫 50 μL 카세트 중 적어도 두 개의 분리 된 웰로 버퍼. </li><li> 매 15 분 또는 피펫 온화한 진탕을 남겨 혼합하면서 주위 온도에서 1 시간 동안 인큐베이션. 또한, 4 ℃에서 12 시간 동안 배양. 주 : 마이크로 어레이 패턴의 함수로 다른 배양 가스켓을 사용합니다. 시간 단계 7.2.5의 배양 온도는 통상의 친 화성 및 결합 KI에 의존 경험적 파라미터들이다각각의 동력학은 항원 - 항체를 쌍. </li></ol></li><li> 세탁 <ol><li> 아래 카세트를 넣고 조심스럽게 깨끗하고 흡수성 종이에 그것을 노크하여 샘플을 제거합니다. </li><li> 위와 같이, 각 사람에게 TBSTRR 150 μL를 추가하여 우물을 세척하고, 버퍼를 제거한다. </li><li> 단계를 반복 7.3.2 세 번 이상. </li></ol></li><li> 형광 검출기 항체 배양 <ol><li> 17 항 시아 노 박테리아 - 변형 항체를 포함하는 항체 혼합물의 50 μL를 추가, 각각 1 % (w / v)의 BSA와 TBSTRR의 형광 색소로 표지. (0.7 μg의 2 / ㎖로) 혼합물을 각 형광 항체의 농도를 측정 각 항원 / 항체 쌍 (22)의 적정 실험을 수행하여. </li><li> 단계 7.2.5에서 설명하는, 4 ℃에서 12 시간에 관해서는, 주위 온도에서 1 시간 동안 배양. </li></ol></li><li> 형광 항체를 세척 &lt;&gt; / 강해 <ol><li> 단계 7.3에서와 같이, 형광 언 바운드 항체를 제거합니다. </li><li> 카세트를 분해하고 빠른 헹굼 용 (50 ㎖의 튜브 예) 0.1X PBS로 슬라이드를 담가. </li><li> 단계 7.1.3에서와 같이 슬라이드를 건조시킵니다. </li></ol></li></ol> 형광 8. 검색 <ol><li> 형광을위한 스캐너에서 멀리 붉은 형광 염료의 최대 발광 형광 피크에서 형광의 슬라이드를 스캔합니다. 일반적으로, 레이저 이득 값을 낮춤으로써, 다른 주사 파라미터의 마이크로 어레이의 여러 이미지를 가라. 참고 : 피 포화 반점 (&gt; 65,000 형광 카운트) - 그들은 규모에서하고 정량화 오류가 발생할 수 있습니다. </li></ol> 9. 이미지 프로세싱 및 데이터 분석 <ol><li> 이미지 분석 및 정량화를위한 ​​상용 소프트웨어를 사용; E의 (하나의 지점에서 모든 픽셀의 평균 또는 중앙값 FI) 소프트웨어는 형광 강도의 측정을 제공한다전체 마이크로 어레이의 ACH 지점. - FI 지역 배경 FI = FI의 자리 : 스팟 주변 지역의 배경을 뺍니다. </li><li> FI 데이터를 저장하고 스프레드 시트 프로그램을 사용하여 엽니 다. </li><li> 거짓 탐지를 확인하고 폐기하는 음성 대조군으로 빈 배열에 대해 얻은 값을 사용합니다. 각 항체 지점에 대한 FI 계산하려면 다음 방정식을 적용 : - FI 샘플 = FI 지점 - 마이크로 어레이에서 FI 지역 배경 샘플 추출 및 빈 FI = FI 지점 실행 - FI = (FI 빈 FI 샘플) FI 지역 배경 빈 마이크로 어레이한다. </li><li> 2-에 추가적인 차단 임계 적용 위양성의 가능성을 최소화하기 위해 마이크로 어레이 전체의 FI의 평균을 3 배; 이는 열악한 품질의 마이크로 어레이 이미지 및 낮은 신호대 잡음비에 특히 적합하다. </li><li> 플롯을 생성 및 / 또는 필요에 따라 추가 분석을 수행합니다. </리&gt; </ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+Bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using Bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., Gonz&#225;lez-Toril, E., Parro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graph-based+deconvolution+analysis+of+multiplex+sandwich+microarray+immunoassays:+applications+for+environmental+monitoring.">Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring.</a> Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).</li><li>Blanco, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+prokaryotic+community+and+metabolisms+in+south+african+deep-mine+biofilms+through+antibody+microarrays+and+graph+theory.">Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory.</a> PloS One. 9 (2), e114180 (2014).</li><li>Gas, F., Baus, B., Quer&#233;, J., Chapelle, A., Dreanno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+quantification+of+the+marine+toxic+algae,+Alexandrium+minutum,+using+a+super-paramagnetic+immunochromatographic+strip+test.">Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test.</a> Talanta. 147, 581-589 (2016).</li><li>Parro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOLID3:+a+multiplex+antibody+microarray-based+optical+sensor+instrument+for+in+situ+life+detection+in+planetary+exploration.">SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration.</a> Astrobiology. 11, 15-28 (2011).</li><li>McKay, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Icebreaker+Life+Mission+to+Mars:+a+search+for+biomolecular+evidence+for+life.">The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life.</a> Astrobiology. 13, 334-353 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기서, CYANOCHIP, 시아 노 박테리아 장군의 넓은 범위의 검출 및 식별을 위해 17 항체 마이크로 어레이를 이용하여 멀티 플렉스 형광 샌드위치 면역 검정은 22를 설명한다. 이 시아 노 박테리아는 담수 서식지에서 그들 중 일부있는 독소 생산을 가장 많이 저서 및 플랑크톤 장군을 나타냅니다. 최근, 형광 면역 샌드위치 형식 애플리케이션 환경 <sup class="xref"...

검출하고 복잡한 자연 미생물 지역 사회의 미생물 모니터링 생물 의약, 환경 생태, 그리고 우주 생물학 등 많은 분야에서 중요하다. 조수의 셀 꽃 (과도 증식)을 형성하는 능력에 대해 공지의 원핵 미생물은 박테리아이다. 그들은 어디에나있다, 많은 종은 인간의 건강에 대한 잠재적 인 위험뿐만 아니라, 생태에 미치는 영향에뿐만 아니라 선도, 독소를 생성 할 수 있습니다. 이 점에서, 박테리아 및 / 또는 토양, 물에서의 독소의 조기 발견을위한 빠르고 민감한 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 물 관리자가 적절한 물 관리 프로그램을 구현하는, 그 결과, 의사 결정을 도울 수 있도록이를 위해, 멀티 플렉스 형광 마이크로 어레이 샌드위치 면역 측정법 (FSMI)의 도구로 개발되고있다. 방법의 다양한 범위는 감지 시안 식별하기 위해 개발되었다광학 현미경, 분자 생물학 및 면역 학적 기술을 포함한 토양과 물에 obacterial 세포와 cyanotoxins. 이러한 방법은 그들이 제공하는 정보에 크게 다를 수 있습니다. 현미경 기술은 세포 형태 및 피코시 아닌 색소 등의 시아 노 박테리아로부터 생체 내 형광 감지 또는 1 클로로필에 기초한다. 그들은 유형과 샘플에 존재하는 시아 노 박테리아의 수에 대해 알려 실시간 자주 모니터링을위한 신속하고 저렴한 방법이 있지만, 그들은 잠재적 독성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 또한, 그들은 종종 밀접한 관련 종이 구별하기가 매우 곤란하다는 점을 감안하면, 전문의 특정 수준을 필요로한다. 이러한 한계를 극복하기 위해 광학 현미경은 생물학 및 생화학 검사 분석 및 cyanotoxins의 식별 및 정량 물리 화학적 방법 모두 동반해야합니다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 효소 면역 분석법 (ELISA), 단백질 인산 억제 분석 (PPIA), 및 생쥐에서 신경 화학 시험 cyanotoxins의 검출을위한 생화학 적 스크리닝 분석법의 예이다. 처음 두 빠르고 민감한 방법이지만하여 ELISA 및 PPIA 시험 독소의 세 가지 유형으로 제한되는 경우, 위양성이 설명되었다. 마우스 생물 검정이 필요 낮은 감도와 정밀도, 특별 라이선스 및 교육을 질적 기술이다. 또한, 시료에 존재하는 독소의 종류에 대한 정보를 제공하지 않는다. Cyanotoxins 식별 및 고성능 액체 크로마토 그래피와 같은 다른 분석법 (HPLC), 액체 크로마토 그래피 질량 분석에 의해 정량 할 수있다 (LC-MS), 가스 크로마토 그래피 (GC), 가스 크로마토 그래피 질량 분석 (GC-MS), 또는 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 비행 (MALDI-TOF). 표준품 필요하는 경우, 이것은 가능복잡한 시료의 개별 독소의 농도를 결정하는 편은, 3, 4 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 시간이 많이 소요된다; 비용이 많이 드는 장비, 소모품 및 샘플 준비가 필요합니다; 경험이 풍부한 전문 직원에 의해 수행되어야합니다. 분자 기반 방법은 게놈 데이터베이스에 게시 된 순서 정보 덕분에, 탐지, 식별 및 시아 노 박테리아와 해당 cyanotoxins을 정량화하기 위해 수십 년 동안 적용되어왔다 (예를 들어, 생명 공학 정보, NCBI을위한 국립 센터). 이들 방법 중에서 DNA 증폭 용 프라이머 세트의 설계를 필요로하고 다른 시아 노 박테리아 종의 DNA 시퀀스의 사전 지식에 의존하는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 기초한 것들이다. 유전자 검출은 피코시 아닌 오페론 같은 속 레벨에서의 정확한 식별을 초래하지만, 어떤 종 또는 균주와 들키지있다이 방법. 그러나, 예를 들면 마이크로 시스틴 오페론에 속하는 것과 같은 독소를 코딩하는 유전자, 생산자는 5 부족하다 시료에서 독성 물질의 식별을 용이하게한다. 그럼에도 불구하고, PCR에 의한 독소 마커의 검출은 반드시 환경에 독성을 의미하지는 않습니다. 또한, 시료에 존재하는 박테리아 독소 생산 종의 전체 범위를 분석하기 위해 개발 된 프라이머 세트는 아직 완전하지 않으며, 추가적인 연구가 알려지지 종을 식별하기 위해 수행되어야한다. 다른 분자 기술 등 현장 하이브리드 (FISH) 및 DNA 마이크로 어레이에 형광 같이-PCR 비를 기준으로합니다. 지난 20 년 동안, 마이크로 어레이 기술은 특히 환경 모니터링, 응용 프로그램의 많은 분야에서 중요성을 얻고있다. DNA 마이크로 어레이는 종과 분석 (4) 사이의 차별, 6, 7 허용 </SUP&gt;, 8, 9, 10, 그들은 거의 힘들고 시간 소모적 인 다단계 (예를 들어, 마이크로 어레이 성능 DNA 추출, PCR 증폭 및 혼성화) 관련 태스크를 고려한다. 그 때문에, 예컨대 샌드위치 경쟁 면역 마이크로 어레이와 같은 항체를 기반으로 적은 시간을 소모 분석은 여러 환경 분석 11 (12, 13)의 검출을위한 필수적인 안정적인 높은 처리량 방법이되었다. 항체의 기능을 구체적으로 타겟 화합물을 인식하고 거의 모든 물질에 대한 항체를 생산할 수있는 가능성과 함께, 분석 및 단백질의 적은 양을 검출, 항체 마이크로 어레이를 환경 적 용도를위한 강력한 방법을 만든다. 또한, 배수를 달성하는 능력은로 분석화롯불의 분석은, PPM로 PPB에 이르기까지 검출 한계,이 방법 (14)의 주요 장점 중 하나입니다. 항체 기반의 바이오 센서는 환경 모니터링 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 병원균 독소의 넓은 범위의 검출에 민감하고 신속한 도구로 입증되었다. DNA 방법은 여러 단계를 포함하는 반면, 항체 기반의 마이크로 어레이는 주로 적절한 용액 버퍼 짧은 용해 공정을 기반으로 작은 시료 전처리를 필요로한다. Delehanty 및 Ligler 15 4 PPB의의 단백질 농도를 검출 할 수있는 항체 샌드위치 면역 분석에 기초하여 단백질과 복합 혼합물 세균 분석 물의 동시 검출을보고D 10 4 CFU / 세포의 용액. Szkola 등. (21)는 생물학적 전쟁에 사용될 수 proteotoxins 작은 독소, 화합물의 동시 검출을위한 저렴하고 신뢰할 수있는 다중 마이크로 어레이를 개발했다. 그들은보다 20 분에서 3 PPB의 검출 한계로, 리신 독소의 농도를 감지했습니다. 최근 CYANOCHIP 독성 및 독성 박테리아의 시츄 검출, 항체 마이크로 어레이 기반 바이오 센서 (22)를 설명 하였다. 이 마이크로 어레이는 주로 현미경으로 식별하기 어려운 수생 환경에서 잠재적 인 시아 노 박테리아 꽃의 식별이 가능합니다. 심지어 종 레벨에서 다중 검출 및 박테리아의 식별을위한 비용 - 효과적인 수단이 바이오 센서로 선회 가장 종 × 103 세포 - 마이크로 어레이의 검출 한계는 10 2이다. 이러한 모든 속성은 antibo을DY 마이크로 어레이 기술이 연구에서 제시된 방법은 특히,보다 신속하고 간단한 방법은 상기 기술들에 비하여. 이 작업은 토양, 물 샘플에서 박테리아의 존재를 검출하기위한 마이크로 어레이, 항체 기반의 바이오 센서를 사용하는 실험의 두 가지 예를 나타낸다. 매우 작은 샘플 볼륨과 매우 기본적인 시료 전처리를 필요로하는 샌드위치 면역 분석법 포맷에 기초하여 간단하고 신뢰할 수있는 방법이다. 이 방법은 짧은 시간을 필요로하고 현장에서 쉽게 수행 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>0.22 mm pore diameter filters</td><td>Millipore</td><td>GSWP04700</td><td>For preparation of immunogens</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp; 5424R microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>For preparation of immunogens</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011036</td><td>50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Ultrasonic processor UP50H</td><td>Hielscher</td><td></td><td>For preparation of immunogens</td></tr><tr><td>Complete Freund&#039;s adjuvant&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881</td><td>Immunopotentiator</td></tr><tr><td>Incomplete Freud&#039;s adjuvant</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F5506</td><td>For boost injections</td></tr><tr><td>Protein A antibody purification kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PURE1A&amp;nbsp;</td><td>For isolation of IgG</td></tr><tr><td>Centrifugal filter devices MWCO&amp;lt;100 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC510096-96K</td><td>For isolation of IgG</td></tr><tr><td>Dialysis tubings, benzoylated</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7884-10FT</td><td>For isolation of IgG</td></tr><tr><td>Illustra Microspin G-50 columns&amp;nbsp;</td><td>GE-HealthCare</td><td>GE27-5330-02</td><td>For isolation of IgG</td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500 mL</td><td>To quantify the antibody concentration</td></tr><tr><td>MicroBCA protein assay kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td>To quantify the antibody concentration</td></tr><tr><td>Protein arraying buffer 2x</td><td>Whatman (Sigma Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>S00537</td><td>Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20</td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9416</td><td>Non-ionic detergent</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9418</td><td>Control&amp;nbsp; for printing; blocking reagent</td></tr><tr><td>384-wells microplate</td><td>Genetix</td><td>X6004</td><td>For antibody printing</td></tr><tr><td>Robot arrayer for multiple slides</td><td>MicroGrid II TAS arrayer from Digilab</td><td></td><td>For antibody printing</td></tr><tr><td>Epoxy substrate glass slides</td><td>Arrayit corporation</td><td>VEPO25C</td><td>Solid support for antibody printing</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester&amp;nbsp;</td><td>Molecular probes</td><td>A20006</td><td>Fluorochrome</td></tr><tr><td>DMSO&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D8418</td><td>Fluorochrome dissolvent</td></tr><tr><td>Heidolph Titramax vibrating platform shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>For antibody labeling&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Illustra Microspin G-50 columns&amp;nbsp;</td><td>Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td>For purification of labeled antibodies</td></tr><tr><td>Safe seal brown 0.5 mL tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72,704,001</td><td>For labeled antibodies storage&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nanodrop 1000 spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>To quantify antibody concentration and labeling efficiency</td></tr><tr><td>3 &amp;micro;m pore size polycarbonate 47 mm diameter filter</td><td>Millipore</td><td>TMTP04700</td><td>To concentrate cells</td></tr><tr><td>1 M Trizma hydrochloride solution pH 8</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T3038</td><td>For TBSTRR preparation; to block slides</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>For TBSTRR preparation</td></tr><tr><td>20 &amp;micro;m nylon filters&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>NY2004700</td><td>For environmental extract preparation</td></tr><tr><td>10 - 12 mm filter holders</td><td>Millipore</td><td>SX0001300</td><td>For environmental extract preparation</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P8340</td><td>For environmental extract storage</td></tr><tr><td>1 M Trizma hydrochloride solution pH 9</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T2819</td><td>To block slides</td></tr><tr><td>Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker</td><td>VWR</td><td></td><td>To block slides; for incubation processes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VWR Galaxy miniarray microcentrifuge</td><td>VWR</td><td>C1403-VWR</td><td>To dry slides</td></tr><tr><td>Multi-Well microarray hybridization cassette</td><td>Arrayit corporation</td><td>AHC1X24</td><td>Cassette for 24 assays per slide</td></tr><tr><td>GenePix 4100A microarray scanner&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Scanner for fluorescence</td></tr><tr><td>GenePix Pro Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software for image analysis and quantification</td></tr></tbody></table>

experimental protocol for detecting cyanobacteria in liquid and solid samples with an antibody microarray chip

지구 온난화와 부영양화는 일부 수생 생태계가 신속하고 대규모 시아 노 박테리아의 성장을 유발 true로 생물 반응기를 작동 할; 이 관련 건강과 경제적 결과가 있습니다. 대부분의 시아 노 박테리아 균주는 독소를 생산하며, 단지 몇 세포는 환경에 치명적인 손상을 유도 할 필요가있다. 따라서, 물 바디 당국과 정부는 예방 또는 치료 의사 결정을 지원하기 위해 신뢰할 수있는 데이터를 제공하는 신속하고 효율적인 조기 경보 시스템이 필요합니다. 이 원고는 분류 학적 해상도 (CYANOCHIP) 17 항체 (ABS)와 항체 마이크로 어레이 칩을 사용하여 독소를 생산하는 시아 노 박테리아 균주의에서 필드 검출을위한 실험 프로토콜을보고합니다. 여기에, 17 시아 노 박테리아 균주의 동시 모니터링을위한 멀티 플렉스 형광 샌드위치 마이크로 어레이 면역 (FSMI)이 자주 담수 생태계에 피는 발견, 그들 중 일부는 독소 생산자는 설명한다. 멀티있는 마이크로 어레이PLE CYANOCHIP의 (24까지) 동일한 복제 동시에 샘플의 비슷한 번호를 테스트하기 위해 하나의 현미경 슬라이드에 인쇄되었다. 액체 샘플은 항체 (ABS)과 직접 배양에 의해 또는 1 내지 3 μm의 필터를 통해 여과하여 세포 농도 이후에 테스트 할 수있다. 이러한 퇴적물 접지 바위 고체 시료는, 제 균질화 인큐베이션 완충액 휴대용 초음파에 의해 분산된다. 거친 물질을 제거하기 위해 - (20 μm의 5), 여과와 ABS 배양 그런 다음 여과된다. 면역 반응은 17 형광 표지 복근의 혼합물 최종 인큐베이션 드러난다 휴대용 형광 검출기에 의해 판독된다. 전체 과정은 대부분의 배양이 1 시간주기에 대응하는 약 3 시간 걸린다. 출력은 밝은 반점이 시아 노 박테리아 마커의 양의 검출에 대응하는 이미지입니다.

이 작품은 CYANOCHIP 항체 마이크로 어레이를 사용하여 가장 관련성이 담수 시아 노 박테리아 종의 동시 식별 (표 1)에 대한 다중 면역 테스트를 설명합니다. 마이크로 어레이는 현미경 슬라이드에 인쇄 된 3 × 8 마이크로 어레이 형식이 될 수 있습니다. 각각의 마이크로 어레이는 음성 대조군으로 A A 세중 자리 패턴 인쇄 (17) 항체의 설정, 해당 사전 면역 항체 및 ...

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Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

검출 실험 프로토콜<em&gt; 시아 노 박테리아</em&gt; 항체 마이크로 어레이 칩과 액체 및 고체 시료에

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

experimental-protocol-for-detecting-cyanobacteria-liquid-solid

Research

JoVE Journal

Environment

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

9.0K 조회수.  Centro de Astrobiología (CAB, INTA-CSIC). The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

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Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

연구

생체공학

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy

Fast detection of cyanobacteria and cyanotoxins is achieved using a Fast Detection Strategy (FDS). Only 24 h are needed to unravel the presence of cyanobacteria and related cyanotoxins in water samples and in an organic matrix, such as bivalve extracts. FDS combines remote/proximal sensing techniques with analytical/bioinformatics analyses. Sampling spots are chosen through multi-disciplinary, multi-scale, and multi-parametric monitoring in a three-dimensional physical space, including remote sensing. Microscopic observation and taxonomic analysis of the samples are performed in the laboratory setting, which allows for the identification of cyanobacterial species. Samples are then extracted with organic solvents and processed with LC-MS/MS. Data obtained by MS/MS are analyzed using a bioinformatic approach using the online platform Global Natural Products Social (GNPS) to create a network of molecules. These networks are analyzed to detect and identify toxins, comparing data of the fragmentation spectra obtained by mass spectrometry with the GNPS library. This allows for the detection of known toxins and unknown analogues that appear related in the same molecular network.

A fast-multidisciplinarystrategy for early detection of cyanobacterial blooms and associated cyanotoxins is described here. It allows for the detection of cyanobacteria and related cyanotoxins in water samples and in organic matrices, such as bivalve samples, in 24 h.

빠른 검출 전략을 사용하여 시아노균 꽃과 관련 된 Cyanotoxins의 조기 발견

Fast detection of cyanobacteria and cyanotoxins is achieved using a Fast Detection Strategy (FDS). Only 24 h are needed to unravel the presence of ...

화학

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

생물학

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

세포 기반 분석 결과 의해 인간의 혈 청 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 G 검출

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

면역학 및 감염병학

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

An Assay to Detect Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G

Source: Liu, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/59014">Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019)
The video demonstrates a cell-based assay for detecting anti-aquaporin-4 immunoglobulin G using a biochip containing untransfected cells and transfected cells expressing aquaporin-4. This method has applications in diagnosing neuromyelitis optica spectrum disorders, confirmed by strong green fluorescence on the biochip.

혈청 항 아쿠아포린-4 면역글로불린 G를 검출하기 위한 분석

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Antibody Microarray: A Technique to Study the Protein Expression of miRNA Treated Lung Cancer Cells

Source: Hossian, A. et. al. <a href="https://www.jove.com/v/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique to study the protein expression in miRNA transfected lung cancer cells by using antibody microarray to measure specific gene expression. In the featured protocol, we perform antibody microarray for the identification of the activity of a combinatorial miRNA treatment in halting cell cycle and angiogenesis.

항체 마이크로어레이: miRNA 처리된 폐암 세포의 단백질 발현을 연구하는 기술

Source: Hossian, A. et. al. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes ...

암 연구학

Lung Cancer

In vitro study

A Technique to Detect Cyanobacterial Strains Using an Antibody Microarray Chip

Source: Blanco, Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54994">Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a method to detect the Cyanobacterial strains in an environmental sample using an antibody microarray chip. Samples carrying various bacteria interact with printed antibodies, and immunostaining with fluorophore-labeled anti-cyanobacterial-strain antibodies reveals the presence of specific cyanobacterial strains through fluorescence in distinct spots.

항체 마이크로어레이 칩을 이용하여 시아노박테리아 균주를 검출하는 기술

1. Preparation of the Immunogens

	Grow each cyanobacterial strain in the corresponding culture medium under conditions described in&#160;Table ...

Antibody-Based Imaging and Detection Methods

Viral Antigen Microarray Assay to Detect Antibody Isotypes in Serum Against Viral Antigen

Source: Khan, S., et al., <a href="https://app.jove.com/v/59973">Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we demonstrate the process for detecting antibody isotypes in multiple human serum samples using a microarray slide printed with antigenic subtypes of influenza virus strains.

바이러스 항원에 대한 혈청 내 항체 동형을 검출하기 위한 바이러스 항원 마이크로어레이 분석

Source: Khan, S., et al., Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes. J. Vis. Exp. (2019)
In ...

검출 실험 프로토콜

요약

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