저자는 기꺼이 원고, 맞춤형 압력 제어 시스템의 건설을위한 C. Bärtschi 및 H. 벤츠의 증거 독서 톰 로빈슨을 인정합니다. 우리는 또한 클린 룸 시설 FIRST 두 ETH 취리히에서 빛을 현미경 센터 (LMC)의 사용을 인정하고 싶습니다. 작품은 7 번째 프레임 워크 프로그램 (ERC 그랜트를 시작, 프로젝트 없음. 203428, nμLIPIDs)에서 머크 세로 노, 유럽 연구위원회 (ERC)에 의해 투자되었다.

1. SU-8 마스터 제작 다음과 같은 프로토콜을 사용하지만 서로 다른 마스크 패턴 (회로도 및 치수는 그림 2 참조, 유체 제어) 채널을 모두 마스터 금형을 준비합니다. 공정은도 3a에 도시된다. <ol><li> 180 ℃에서 10 분 동안 4 인치 실리콘 웨이퍼를 가열함으로써 시작 스핀 코터에 탈수 웨이퍼를 넣고 스핀 코팅 SU-8 2015 년 다음과 같은 프로토콜을 사용합니다 : <ol><li> (분배 후이 단계 닫아서 동안 SU-8을 분배, 스핀 코터의 열린 뚜껑) 20 초 동안 100 rpm에서 웨이퍼를 스핀. </li><li> 10 초 동안 500 rpm으로 회전 웨이퍼 (이것은 웨이퍼 전체에 저항을 전파합니다.) </li><li> 30 초 동안 1,750 rpm으로 회전 웨이퍼 (20 μm의 저항의 높이를 정의한다). </li></ol></li><li> 이것은, 그렇지 않으면 다음 단계에서 열판 행할 것이다 아세톤 (면봉을 사용)와 함께 웨이퍼의 에지로부터 레지스트를 제거한다. 아 웨이퍼 이동4 분 동안 95 ° C 열에서 otplate. 소프트 베이크 후, (365 nm에서 측정 된 150 엠제이 / cm 2) 자외선 마스크 얼 라이너에 유리 소다 라임에 녹화 포토 마스크를 통해 저항을 노출합니다. </li><li> 노출 후, 핫 플레이트에서 5 분 동안 95 ° C에서 다시 웨이퍼를 가열한다. RT에 웨이퍼를 냉각 한 후 4 분간 SU-8 개발자의 목욕에 젖어. 노출되지 않은 SU-8을 제거하기 위해 부드럽게 흔들어. 클린 룸 등급의 이소프로판올로 웨이퍼를 세척하고 질소로 건조한다. 개발 (특히 세포 트랩)에 성공하면 현미경으로 확인합니다. 셀 트랩이 완전히 개발하는 경우, 실리콘 웨이퍼의 반사 표시해야한다. 필요한 경우, 몇 분 동안 다시 웨이퍼를 개발한다. </li><li> 모든 잔류 용매를 제거하기 위해 180 ° C에서 2 시간 동안 오븐에서 웨이퍼를 굽는다. 단계 프로파일과 채널의 높이를 확인합니다. 높이가 원하는 높이와 다를 경우,이 프로토콜은 새로운 웨이퍼 단계 1.1에서 시작하여 반복회전 속도 (단계 1.1.3)를 변경합니다. 1H, 1H, 2H, 하룻밤 데시​​ 케이 2H-퍼플 루오로 데실-dimethylchloro 실란과 웨이퍼 silanizing하여 마스터 몰드의 제조를 완결한다. </li></ol> 2. 미세 접촉 인쇄를위한 마스터 제작 <ol><li> 마이크로 콘택트 인쇄 마스터 주형을 제조하기 위하여, 180 ℃에서 10 분 동안 실리콘 웨이퍼를 탈수 (저항이 실릴 화 표면에 잘 부착) 30 초 동안 7,500 rpm에서이 웨이퍼에 1 ㎖의 HDMS을 코트에게 스핀. AZ1518의 스핀 코트 2 ㎖ 긍정적이 프로토콜을 사용하여 저항 : <ol><li> 정적 분배는 웨이퍼에 저항한다. </li><li> 500 rpm에서 5 초 동안 웨이퍼를 스핀. </li><li> 4000 rpm에서 60 초 동안 웨이퍼를 스핀. </li></ol></li><li> 핫 플레이트에서 100 ° C에서 50 초 소프트 베이크 후, 노출하는 포토 마스크를 통해 마스크 얼 라이너에 UV 광 (365 nm에서 21 엠제이 / cm 2)에 저항한다.에게 75 초 동안 AZ (726)의 욕조에 저항을 개발한다. DI-물과 타격 D로 개발 된 웨이퍼를 씻어질소, 공예. 50 초 동안 115 ° C에서 웨이퍼를 가열하여 잔류 용매를 제거합니다. 밤새 진공 하에서 웨이퍼 Silanize. </li></ol> 3. 미세 유체 칩의 제조 이층 장치 설계는 이들 실험을 위해 사용된다. 칩 최종적 유리 슬라이드 (도 3b)에 접착되기 전에 두 층은 별도로 준비되어 함께 접착된다. 이 단계는 PDMS 층의 제조 및 마이크로 콘택트 인쇄 PDMS 스탬프를 설명한다. <ol><li> 10:1 PDMS의 혼합 및 경화제를 준비합니다. 총 약 80 g의 PDMS를 준비합니다 (우리의 디자인을 사용하여,이 10 칩 발생합니다). 혼합물이 자유로운 거품 (~ 30 분) 될 때까지 적극적으로하고 가스를 제거 두 부분 PDMS를 섞는다. </li><li> 바닥에 페트리 접시와 테이프를 내부 제어 계층과 웨이퍼를 놓습니다. 다음으로, 위에 PDMS의 ~ 50g을 넣어 완전한 보장하기 위해 80 ° C의 오븐에서 최소 2 시간 동안 웨이퍼를 넣어PDMS의 경화. ~ 20g의 PDMS가 필요한이를 위해, 마이크로 콘택트 프린팅 웨이퍼에 대해 동일한 절차를 반복한다. </li><li> 스핀 코트 웨이퍼상의 PDMS를 2000 rpm의 회전 속도로 유체 층을 약 40 ㎛의 높이 PDMS 층을 형성한다. 80 ℃에서 최소 1 시간 동안 오븐에서 PDMS 치료 </li><li> 두 부분이 경화 될 때, 웨이퍼로부터 제어 층을 제거하고 면도날 조각으로 잘랐다. 1mm 생검 펀치를 사용하여 압력 연결 구멍을 펀치. 스토리지의 경우, 채널을 통해 테이프의 조각을 넣어하는 것이 바람직하다. </li><li> 두 층을 결합하기 위해, 스핀 코팅 웨이퍼와 상단 부분을 플라즈마 클리너 (23)에 배치합니다. 플라즈마 처리 후, 신속하게 큰 작동 거리를 가진 현미경으로 두 부분을 맞 춥니 다. 배치하는 상단 부분의 주위에 약간의 여분의 PDMS를 추가합니다. 그러나이 단계는 웨이퍼로부터 PDMS의 제거를 용이하게, 필수 아니다. 적어도 1 시간 동안 80 ° C의 오븐에서 웨이퍼를 배치. </li><li> 조심스럽게 웨이퍼에서 PDMS를 제거하고 마이크로 칩을 잘라 메스를 사용합니다. 1.5 mm 생검 펀치와 유체 연결에 대한 액세스 구멍을 펀치. </li><li> PDMS 칩은 현재 완료와 달 동안 저장 될 수있다. 옵션 : 칩이 저수지와 함께 사용되는 경우, 200 μL 피펫 팁의 상부를 잘라 상단에 접착제 일부 예비, 반경 화 PDMS를 사용합니다. 적어도 1 시간 동안 80 ° C에서 다시 오븐에 칩을 넣어. </li></ol> 4. 유리 슬라이드에 결합 직접 효소 분석을위한 장치를 사용하려면, 접합 후 필요한 유일한 단계는 표면의 차단입니다. 이 프로토콜의 경우, 면역 또는 ELISA를위한 마이크로 유체 칩을 사용하는, 그러나 A.로 진행, 만 (즉, TIRF 현미경 또는 SPR에 대한) 유리 슬라이드에 결합 부위를 제한하는 프로토콜 B를 참조하십시오. 이러한 제한은 중요하지 않은 경우를 참조하지만, 단계 8.6에서 비오틴 콘쥬 게이트를 사용하여 단계 4.8를 계속프로토콜 B에 완전한 기능의 표면을 만들 수 있습니다. 이전 프로토콜 A와 B를 수행하기 : 그것은 이전의 칩에 그들을 소개에 사용 된 단백질의 모든 솔루션을 필터링하는 것이 좋습니다. 파편과 단백질 응집체는 그렇게함으로써, 분석을 위해 사용할 수있는 챔버의 수를 줄이고, 세포 트랩을 차단할 수있다. 이를 위해, 채널에 그들을 도입하기 전에 모든 해법을 필터링하는 비 단백질 흡착 필터 장치를 사용한다. 프로토콜 A (효소 분석) <ol><li> 미세 유동 장치를 마무리하기 위해, 유리 슬라이드 상에 PDMS 부품 접합. 이를 위해, 제 비누, 증류수와 에탄올을 유리 슬라이드를 청소. 질소 스트림을 사용하여 슬라이드를 건조. 스카치 테이프로 PDMS 부분을 청소합니다. </li><li> 단단한 결합을 보장하기 위해 18 W.에서 45 초 동안 플라즈마 클리너로 PDMS 부분과 청소 유리 슬라이드를 넣고 5 분 동안 핫 플레이트 (100 ° C)에 칩을 넣어. </li><li> 접합 후, F와 칩을 채우기luids. 이것을 달성하는 쉬운 방법은 원심력을 사용하는 것입니다. 200 μL 피펫 팁의 아래 부분을 잘라. 유체 채널의 경우, 블로킹 용액들을 채우기 (소 혈청 알부민 (4 % w / v) 또는 폴리-L-라이신) 그래프트 폴리에틸렌 글리콜 (0.05 % w / v) 및 유입구에 팁을 배치. 물 중 하나 또는 삼투 성 용액, 예를 들면 PBS로 제어 계층의 입구를 입력합니다. 5 분 동안 원심 분리기 (800 XG)에 칩을 놓습니다. 채널은 이제 완전히 액체로 가득해야합니다. 되지 않은 경우,이 단계를 반복합니다. </li><li> 실온에서 적어도 30 분 동안 블로킹 용액을 배양한다. 주사기 펌프를 이용하여 10 μL / 분의 유속으로 PBS와 유체 층 중 용액을 씻는다. 이 장치는 현재 세포 실험을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 프로토콜 B (면역) 이후 단계 4.7 표면 개질의 전체 개요는 표 1을 참조하십시오. <ol start="5"><li> 에BBSA / BSA 용액 (예를 들어 1 ~ 100)와 미세 접촉 인쇄를위한 cubate PDMS 스탬프. 30 분 후, 증류수로 철저히 우표를 청소하고 질소의 흐름에 따라 스탬프를 건조. 빨리 청소 유리 슬라이드 (그림 4)에서 스탬프를 배치합니다. </li><li> 함께 플라즈마 클리너 최대 전력 (18 W)에서 45 초 동안 산소 플라즈마에 미세 유체 칩의 상단 부분에 스탬프 유리 슬라이드를 노출합니다. 플라즈마 처리 후, 스탬프를 제거하고 장치의 microchambers 아래에 인쇄 된 표면에 정렬. 50 ℃의 핫 플레이트에 30 분 동안 칩을 놓습니다 </li><li> 나머지 표면을 차단하려면 원심 분리기와 칩에 멸균 여과 BSA 용액 (4 %를 (W / V) PBS에서) (단계 4.2 참조) 소개합니다. 1 시간 동안 품어 PBS와 유체 층 (단계 4.3 참조) 밖으로 솔루션을 씻어. 이 칩은 습기가 상자에 4 ° C에서 직접 사용 또는 최대 2 주 동안 저장 될 수있다. </li><li> 완전한 기능의 결합 계면에 대한전자, 저수지에 아비딘 (0.025 % (W / V) PBS에)을 소개합니다. 유체 채널을 통해 아비딘 용액을 인출을 30 분 동안 5 μL / 분의 유속을 사용한다. 그 후, 10 분 동안 PBS를 플러시. 철저하게 탱크를 씻어. </li><li> 그 후, 단백질 G (0.0025 % (W / V) PBS에) 또 다른 30 ​​분 동안 세척을 추가합니다. 그 후 또 다른 10 분 동안 PBS로 세척. 다음, 10 분 동안 관심의 항체 (0.0001 % (W / V) PBS에있는)를 추가합니다. 10 분 후, 바인딩 할 수 있도록 15 분 동안의 흐름을 중지합니다. 다음, 10 분 동안 PBS로 세척. </li></ol> 5. 세포 실험 프로토콜은있을 수 있기 때문에 분석의 다양성의 일반적인 용어로 작성됩니다. 예로서 G6PDH 독성 분석에 필요한 시약은 주어진다. 장치의 초기 셀 포집 효율 즉, 200 세포 중 5 갇혀되며, 약 2.5 %이다. 세포 트랩의 최종 인원은 강력하게 사용되는 세포주 일시 중단하는 프로토콜에 따라 달라집니다세포주 및 시간은 셀 채널을 통해 플러싱된다. 자연적으로 (예 : U937)를 서스펜션에서 성장 세포를 들어, 하나의 세포는 몇 분 후 챔버의 75 % 정도에서 찾을 수 있습니다. 다른 챔버들 중 하나 가득, 또는 두 개 이상의 셀에 의해 점유되지 않는다. 일반적으로, 단일 셀 점유도는 점착성 세포주 작다. 여기에 제시된 오히려 온화한 현탁 프로토콜을 사용하는 경우, 비율 (HEK MLT 세포)를 대략 30 %로 감소한다. 단일 셀 점유도는 세포를 트립신 처리에 의해 개선 될 수 있지만,이 또한 실험 결과를 변경할 수있다. 표적 분자에 따라, PDMS에 흡착 또는 흡수가 결과에 영향을 미칠 수있다. 흡착 BSA 또는 PLL-g-PEG를 가진 표면을 차단함으로써 감소 될 수있다. 흡수는 대부분 친수성 ​​생체 분자에 대한 확률이지만, (소) 친 유성 세포 성분에 대해 검사되어야한다. <ol><li> 특정 프로토콜에 따라 세포를 준비 (예를 들어 </EM&gt; 약물 중독). 정지 세포의 경우, 칩에 직접 세포를 추가합니다. 접착제 세포주, 세포 현탁액을 생성 효소 프리 해리 완충액을 사용한다. 셀 클러스터의 양을 줄이기 위해 칩에 도입하기 전에 세포를 필터. </li><li> 주사기 펌프 및 순방향 흐름을 이용하여 칩 상에 세포를 넣고보다는 세포 현탁액을 철회. 채널 벽에 세포의 비특이적 부착을 감소시키기 위해 이후 접착제 셀 현탁 세포주 및 20 μL / 분의 높은 유량을위한 5 μL / 분의 유속을 사용한다. </li><li> 트랩이 채워지면, 실을 닫습니다. 많은 세포 표면에 비특이적으로 부착하는 경우, 10-30 μL / 분의 유속으로 세포 해리 완충액으로 그들을 씻어 흘려하려고. </li></ol> 프로토콜 A (효소 분석) <ol start="4"><li> 칩을 통해 용해 버퍼를 철회. 이것은 예를 들어, 현재의 버퍼가 추가 트윈 20 (10 mM 트리스 - 염산, (10)와 버퍼이다 hypoosmolar밀리미터의 KCl, 1.5 mM의 MgCl2를, 1 % (V / V) 트윈 20). 용해를 들어, 신속하게 개폐 챔버 (즉, 10 ~ 50 μL / 분 7,21의 유량을 500 밀리 초). G6PDH 분석의 경우, 2 mM의 포도당 -6 - 인산, 0.5 ㎜ NADP, 0.5 U / ㎖ 디아 포라 제 및 용해 버퍼에 레사 주린 0.3 ㎜를 추가합니다. 즉시 용해 후 운동 반응을 모니터링하기 시작합니다. </li></ol> 참고 : 분석에 적합합니다 모든 버퍼를 선택 (트리톤, SDS 등) 강한 세제를 Lyse 세포가 즉시 실 개방시 분석의 손실로 이어질 것입니다 염두에 그러나 벌거 벗은. 프로토콜 B (면역) ELISA 세포 실험 (유량, 챔버 상태 등)에 대한 간단한 설명은 표 1을 참조하십시오. <ol start="5"><li> ELISA에 직접 용해 버퍼에 필요한 검출 시약 (예를 들면 차 항체, 표지 항원)를 추가합니다. 여기에는 트위 추가N (20)는 비특이적 흡착을 줄일 수 있습니다. 5.4 단계에 따른 세포를 Lyse. (사용 된 항원과 항체에 따라 배양 시간)를 결합 할 수 있도록 10 ~ 15 분 혼합물을 품어. </li><li> 채널 벽에 비특이적으로 흡착 항체 효소 복합체는 이미 저장 및 채널 내부 검출 시약의 변환으로 이어질 수 있습니다. 이 흡착에서 문제를 줄이려면 (검출 시약을 추가하기 전에, 챔버는 폐쇄) 배양 시간 동안 칩을 사용 감지 효소의 영구 억제제를 플러시. HRP의 경우, 영구적으로 비특이적으로 흡착 효소를 불 활성화하기 위해 물에 20 mM의 염산을 사용합니다. </li><li> 배양 시간 후에 칩 검출 시약 (예 Amplex 빨간색과 HRP 과산화수소)를 소개한다. 멀리 nonbound 차 항체를 씻어 곧 다시 실을 열고 검출 시약을 추가 할 수 있습니다. 즉시 운동 반응을 모니터링 시작합니다. </li><li> 교정 : 무력화관심의 대상에 대한 항체. 닫기 실. 버퍼 또는 오프 칩 (off-chip) 세포 용 해물에 분석의 서로 다른 농도를 준비합니다. 칩의 농도를 적용하고 신속하게 챔버 (개관 시간 500 밀리 초) 내부의 볼륨을 교환한다. 이 개방 시간은 추가 축적 분석 플러싱에서 발생하지 않도록 충분히 짧고, microchamber의 볼륨에서 분자 만 특정 번호가 검색됩니다. 용액 안에 항원의 알려진 농도와 챔버 체적 (625 PL)에서, 챔버 내부의 양을 계산한다. 그 후, 단계 5.5 계속 검출 부분을 소개합니다. </li></ol>

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T., Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+platform+for+in+situ+cellular+cytokine+secretion+immunophenotyping.">An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping.</a> Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).</li><li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., K&#252;ster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells.">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 .</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+housekeeping+gene+encoding+glucose+6-phosphate+dehydrogenase+(G6PD):+G6PD+is+dispensable+for+pentose+synthesis+but+essential+for+defense+against+oxidative+stress.">Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress.</a> EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

미세 유체 기술은 단일 세포 분석을위한 새로운 매혹적인 가능성을 열었습니다. 특히, 트랩 가능성 및 미세 도구를 사용하여 개별적으로 세포를 고정화는 단일 셀의 속성과 응답에 대한 체계적인 장단기 연구를 허용했다. 또한, 마이크로 칩에서 생성 고주파 미세 방울, 셀의 캡슐화는, 통상적 계측법 장치로 수행 할 수없는 단일 세포 분비 연구를 사용할 수있다. 의 microdroplet 방법은, 그러나, 배양...

과거의 많은 연구는 세포에 세포 대 세포 인구 1-3 이내의 차이, 특히 신호 4를 처리, 또는 단백질 5,6, 대사 및 보조 인자 7,8 세포 내 생체 분자의 양을 제시했습니다. 이러한 이질성은 세포의 적응과 진화 9 근본적으로 중요 할뿐만 아니라, 암과 10-13과 같은 질병의 출현 및 치료에 중요한 역할을하는 것으로 간주됩니다. 따라서, 단일 세포 수준에서의 연구는 이러한 연구는 생리 활성 화학 물질로 처리 한 후 다른 세포 반응을 표시하는 경우 특히, 생물학적, 약리학 적 연구에 높은 관심이다. 최근, 많은 분석 플랫폼은 하나의 살아있는 세포의 분석이나 세포 함량의 화학 성분을 용이하게 개발되었다. 형광 활성 세포 정렬 (FACS)는 금 성 동안andard 단일 살아있는 세포의 매우 높은 처리량 분석을 위해,이 방법은 세포 내 또는 분비 화합물의 정량에 이용 될 수 없다. 미세 유체 플랫폼의 출현 위치, 치료 및 단일 세포의 관찰에 대한 새로운 분석 전략을 약속했다. 미세 유체의 이정표가 지진 및 동료 (14, 15)에 의해 실현 유연한 PDMS 밸브의 통합에 도달 하였다. 그들은 칩 영역을 분리 할 수 있기 때문에이 밸브가 유용합니다, 예를 들어, 두 문화 (16)를 분리합니다. 게다가, 그들은 단일 세포 분석에 특히 적용 가능하며, 따라서 분석 희석의 문제를 줄일. 단일 세포 분석을위한이 방법의 파워는 최근 한센 평행 17 단셀 수백 개 유전자 발현을 분석하는 동료에 의해 ​​입증되었다. 단백질 및 대사 산물을 대상으로하는 경우, 분석 인해 최적의 부족으로 아주 어렵다mplification 방법, 다른 본 발명의 화합물 및 화학 특성에서의 변화의 큰 수입니다. 또한, 대부분의 세포 내 생체 분자가 몇 가지 수만 18의 순서로 낮은 사본 번호에 존재하는 것으로 예상된다, 따라서 사용 된 분석 방법은 높은 감도를 가지고 있어야합니다. 이러한 면역 효소 결합 면역 분석법 (ELISA)와 같은보다 강력한 분석은 여러 세척 및 배양 단계뿐만 아니라 표면의 고정을 필요로하기 때문에 마이크로 유체 장치에 통합하기가 어렵습니다. 때문에 이러한 문제로, 그것은 단백질 또는 대사 산물이 단일 세포 수준에서 정량화 된 곳에서만 몇 가지 예는보고 된 것은 놀라운 일이 아니다. 예를 들어, 형광 화합물의 분비 연구 19,20보고되었다. 최근, ELISA와 구현은 세포 배양에서 분비 (비 형광) 단백질 (THP-1 세포) (21)와 하나의 (난의 분석을 제시했다mmune) 세포 10. 세포 내 단백질을 표적시 등이. 면역 측정법 (11)의 수단에 의해 종양 세포에서의 신호 전달 경로의 분석을위한 세포 내 단백질의 식별을 용이하게 미세 유동 장치를 개발했다. 그러나, 단백질의 단지 상대적인 양을 결정하고, 어떤 효소 증폭 낮은 풍부한 단백질에 대한 신호를 증가하는 데 사용되지 않았다. 최근에는 형광 분석법 (8) 및 면역 분석 (22)와 단일 셀 트래핑 마이크로 디바이스 (도 1)에 결합 할 수 있었다. 세포는 수동적으로 공급하고 세포의 움직임이없는 매체 및 기타 화학 물질의 (빠른) 교환을 할 수 microsized 장애물 구조에 갇혀있다. 각 트랩의 주위에 고리 모양의 밸브는 매우 작은 양 ( &quot;microchamber&quot;)에서 세포의 분리를 가능하게한다. 이 밸브는 바로 그가, 세포 용균 (hypoosmolar) 버퍼를 도입 한 후 작동되는NCE 멀리 확산 세포 내 분자 또는 분자의 분비를 방지한다. 가장 중요한 점으로 인해 부피 (625 PL)의 작은 사이즈에 분자의 대규모 희석은 회피된다. 용해 및 분석을 칩의 동일 위치에서 수행되기 때문에 한층, 운송에 의한 분석 물질의 손실이 없다. 여기에 설명 된 칩 설계는 60 microchambers 총 7,8 어느 microchambers 13 교번 행을 포함한다. 라인을 따라 교차 오염이 배제되도록 챔버, 행에 작동된다. 플랫폼은 형광 분석법뿐만 아니라 면역 분석법 (도 1D)와 조합하여 사용할 수있다. 후자의 경우에, 우리는 칩 생산 및 조립 공정과 호환되는 항체의 고정화를위한 프로토콜을 확립. 따라서 플랫폼은 단일 세포 수준에서, 중요한 신뢰성과 정량 분석​​을위한 길을 엽니 다. 지금까지, 우리는 I의 분석 장치를 사용했다ntracellular 분비 효소 (효소 분석에 의해 상대 정량), 세포 내 보조 인자, 단백질과 작은 분자 (엔드 포인트 분석 또는 ELISA에 의한 절대 정량). 이하에서, 우리는 마이크로 콘택트 프린팅 및 표면 화학에 의해 다층 소프트 리소그래피 및 항체의 패터닝을위한 프로토콜에 의해 칩의 제조 공정을 설명한다. 또한, 칩의 사용과 작업의 몇 가지 예는 제공됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">REAGENTS:</td>
			<td style="width:284px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:344px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:284px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:153px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">SU-8 2015</td>
			<td style="width:284px;">MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane</td>
			<td style="width:284px;">ABCR (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">AB103608</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">4-Methylumbelliferyl &#946;-D-N,N&#8242;-diacetylchitobioside hydrate</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M9763</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Acetone</td>
			<td style="width:284px;">Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">100014</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Avidin</td>
			<td style="width:284px;">AppliChem (Axon Lab AG)</td>
			<td style="width:103px;">A-2568</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">AZ 1518</td>
			<td style="width:284px;">AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">AZ 726 developer</td>
			<td style="width:284px;">AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A-4503</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Bovine serum albumin, biotin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A-8549</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">13151-014</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hexamethyldisilazane (HDMS)</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">40215</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">84422</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:284px;">Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">109634</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">63068</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">MR developer 600</td>
			<td style="width:284px;">Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PBS</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">10010-031</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PLL-g-PEG grafted</td>
			<td style="width:284px;">SuSoS, (D&#252;bendorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PLL-g-PEG grafted biotin</td>
			<td style="width:284px;">SuSoS, (D&#252;bendorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">60132</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Protein G, biotin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">41624</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:284px;">Si-Mat (Kaufering, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td style="width:284px;">Dow Corning</td>
			<td>39100000</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:284px;">Biorad</td>
			<td style="width:103px;">1610716</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Tween 20</td>
			<td style="width:284px;">Biorad</td>
			<td style="width:103px;">1706531</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:344px;">Material Name</td>
			<td style="width:284px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:153px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">0.22 &#181;m PES syringe filter</td>
			<td style="width:284px;">TRP</td>
			<td style="width:103px;">99722</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">1/1.5 mm biopsy puncher</td>
			<td style="width:284px;">Miltex, York PA</td>
			<td style="width:103px;">33-31AA/33-31A</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Cell Trics filter 20 &#181;m</td>
			<td style="width:284px;">Partec</td>
			<td style="width:103px;">04-004-2325</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Centrifuge Sigma 3-18K</td>
			<td style="width:284px;">Kuehner</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hotplate HP 160 III BM</td>
			<td style="width:284px;">Sawatec, Sax, Switzerland</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">MA-6 mask aligner</td>
			<td style="width:284px;">Karl Suess</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Multizoom AZ100M microscope</td>
			<td style="width:284px;">Nikon Corporation</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Photomask</td>
			<td style="width:284px;">Microlitho, Essex, U.K.</td>
			<td style="width:103px;">n.a</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Plasma Cleaner PDC-32G</td>
			<td style="width:284px;">Harrick</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td>
			<td style="width:284px;">Laurell</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Spin Modules SM 180 BM</td>
			<td style="width:284px;">Sawatec, Sax, Switzerland</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Step profiler Dektak XT Advanced</td>
			<td style="width:284px;">Bruker</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Syringe pump neMESYS</td>
			<td style="width:284px;">Cetoni</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells

우리는 병렬로 복수의 단일 세포에서 세포 내 생체 분자의 정량적 측정을 가능하게하는 미세 유체 장치를 제시한다. 이를 위해, 세포는 수동적 microchamber의 중간에 갇혀있다. 제어 층의 활성화시에, 셀은 작은 챔버에서 주변 볼륨으로부터 분리된다. 주변 음량은 고립 셀에 영향을주지 않고 교환 될 수있다. 그러나, 챔버의 짧은 개방 및 폐쇄시에, 챔버 내 용액을 몇 백 밀리 초 내에서 대체 될 수있다. 때문에 실의 가역성에, 세포 배양, 세척, 및 최종적으로, 세포 용해 예 : 고도로 제어 가능한 방식으로 다른 솔루션을 순차적으로 노출 할 수있다. 단단히 밀봉 microchambers은 해물의 유지를 가능하게 최소화하고 세포 용해 후 희석을 제어 할 수 있습니다. 용해 및 분석은 동일한 위치에서 발생하기 때문에, 고감도가 유지되어 더 이상의 D보기 때문에분석의 ilution 또는 손실이 운송 중에 발생합니다. microchamber 디자인 따라서 각각의 세포에서 방출 세포 내 분자 (아토 몰, zeptomoles)의 매우 작은 크기의 숫자의 신뢰성과 재현성 분석을 가능하게한다. 또한, 많은 microchambers 적합한 광학 기기가 모니터링을 위해 사용되는 관련 한번에 많은 세포의 분석을 가능하게 배열 형식으로 배열 될 수있다. 우리는 이미 세포 내 단백질, 효소, 보조 인자 및 상대 또는 절대 하나를 정량화 할 수있는 방법으로 두 번째 메신저를 분석하기 위해 개념 증명 연구를위한 플랫폼을 사용하고 있습니다.

우리의 플랫폼에 존재하거나 단일 세포에 의해 생산 세포뿐만 아니라 다양한 분비 분자를 분석 할 수있다. 여기에서, 우리는 가능한 분석의 다양성을 강조하기 위해 다른 예를 들어 연구를 제시하고 싶습니다. 우리는 분비 효소 (그림 5a)뿐만 아니라 세포 내 효소 (그림 5b)와 단백질 (그림 5C와 D)에 대한 예를 제공합니다. 이러한 보조 인자 또는 작은 분자로 더...

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A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K 조회수.  ETH Zurich, Switzerland.  이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화. 

비디오: A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

종양 Microenvironment를 재현을위한 마이크로 유체 장치<em&gt; 체외에서</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

연구

생체공학

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

단일 입자 Microfluidic 기반 유체 트랩

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

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The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

ICPMS 샘플 소개를위한 미세 유체 칩

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

멀티 장기 칩 - 장기 멀티 조직 공 배양을위한 미세 유체 플랫폼

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 Electrotaxis 연구

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

패터닝 단백질과 세포의 다목적 방법

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...