This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

윤리 문 : 동물 주제와 관련된 절차는 의학의 서던 일리노이 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 시간적 뼈 1. 추출 <ol><li> 마우스 두개골 (13)의베이스에 시간적 뼈를 확인하고 표준 패턴 집게를 사용하여 두개골 신경을 멀리 쳤어요. </li><li> 캡슐화 된 달팽이관을 제거하기 위해 귀의 캡슐의 끝에서 아래로 후부 반원의 운하에 반대 손으로 언론의 엄지 손가락으로 표준 패턴 집게를 놓습니다. </li><li> 수동으로 엄지와 검지 손가락으로 또는 10.5 cm 미세 가위를 사용하여 두개골에서 시간적 뼈의 아래쪽 절반을 무료로 제공됩니다. </li></ol> 2. 임시 뼈를 포스트 - 수정 <ol><li> 10 mM의 인산 완충 식염수에 희석 500 μL 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) (PBS)의 pH 7.4와 incub - (250)를 포함하는 2 ml의 마이크로 원심 튜브에 시간적 뼈를 배치20 시간 - 2 RT에서 먹었다. 참고 : 원형 또는 타원형 창에 PFA의 정점 캡 또는 주입의 어떠한 개구가 필요하지 않습니다. 유리 병에 16 % 농도에서 구입할 수 있습니다 메탄올 무료, 초순수, 전자 현미경 (EM) 등급 PFA를 사용하는 것이 좋습니다. 유리 병은 개방 한 희석되면 : 4 % 용액을, PBS로 4 (일부 항체가 허용 할 수있는 짧은 정착 등을 필요로 4 ℃로 저장 될 때, 그것은 최대 2 주 동안 사용할 수있는 O / N (O / N) 고정). </li></ol> 3. 석회 시간적 뼈 <ol><li> 고정 후, 피펫을 사용하여 PFA를 제거하고 120 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 약간 이상 2 ㎖로 대체합니다. 튜브를 닫을 때 공기가 거품 방지하기 위해 전체 2 ML의 microcentrifuge 관을 채우기해야합니다. <ol><li> 바로 decalcifying하지 않는 경우, 4 O ℃에서 10 mM의 PBS 산도 7.4 저장 샘플 PFA 교체 참고 : 고정 후, 시간적 뼈가 variab 저장할 수 있습니다제작 : 항원에 따라 탈회가 조사되기 전에 시간의 양. </li></ol></li><li> 엔드 오버 엔드 회전에 장소 튜브 및 실온에서 4 rpm으로 회전. 피펫을 사용하여 매일 EDTA 솔루션을 변경합니다. 탈회의 길이는 시료의 나이와 절개를하고있는 과학자의 취향에 따라 달라집니다. <ol><li> 배양 시간에 대한 다음 지침을 사용하여 EDTA에 시간적 뼈를 품어 : 8 P15에 샘플 출생 후 하루 (P)의 경우 : 2-4 시간; P21에 샘플 P15의 경우 : O / N; P30에 샘플 P21의 경우 : 2 O / N; 3 개 이상의 O / N : P30보다 오래된 샘플하십시오. 참고 : 탈회 시간은 사용자의 환경에 제한이있을 수 있으며, 필요에 따라 확장 할 수 있습니다. 탈회 시간은 약 8 시간 간격, 하루 두번 EDTA 용액을 변화시킴으로써 감소 될 수있다. 오염을 방지하기 위해 이상 3 일간 decalcifying 때 일부 연구소는 EDTA 용액에 1 % PFA를 추가합니다. </li></ol></li><li> 시료가 적절하게 탈회하는 경우 O 시간적 뼈를 배치, 확인하려면NA 실리콘 해부 접시를 엘라스토머 코팅 부드럽게 달팽이 모양의 달팽이관에 집게를 누릅니다. 조직 spongey이면 탈회가 완료되었습니다. </li><li> 탈회가 완료되면, 피펫을 사용하여 EDTA를 제거하고 10 mM의 PBS 산도 7.4의 500 -1,000 μl를 추가합니다. 준비까지 4 O C에서 보관 샘플을 해부합니다. </li></ol> 4. 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시 만들기 <ol><li> 베이스와 제조자의 지시에 따라 실리콘 엘라스토머 밀봉 키트 경화제 수확기 철저히 혼합한다. </li><li> 이 솔루션은 검은 색이 될 때까지 가루 숯 3 큰술과 잘 혼합 - 약 2를 추가합니다. 주 : 습식 잉크 또는 액체 숯 용액과 혼합되지 않고 사용할 수 없다. 실리콘 엘라스토머 밀봉 키트는 4.2 단계를 생략 할 수 있도록, 검정에서 구입할 수있다. </li><li> 코트에 충분히 바닥을 작성, 60mm 유리 또는 플라스틱 배양 접시에 솔루션을 붓는다. BU 경우bbles이 존재하는 표면에 공기 퍼프. 설정 실온에서 최소 24 시간을 서 보자. 주 : 실리콘 엘라스토머 코팅 접시 년간 반복 사용할 수있다. 이 실리콘 엘라스토머는 균열의 원인이됩니다 그러나, 청소를​​ 위해 에탄올을 사용하지 마십시오. </li></ol> (P7과 이전 샘플) 달팽이관 5. 전체 마운트 해부 <ol><li> 중간 / 혀끝의 회전에서 기저 회전을 분리 <ol><li> 10 mM의 PBS pH를 7.4으로 3 분의 2 가득 채워진 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시에 한 탈회 측두골을 놓고 다음 단계에 대한 스테레오 해부 현미경을 사용합니다. </li><li> # 4, # 5 연속 보석상의 집게를하고 5mm Vannas-튀빙겐 스프링 가위를 이용하여 전정 지역에서 측두골을 잡고, 측면을 따라 꼭대기 위에 여분의 귀 캡슐 조직을 절단. </li><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여 타원형 창에 하나의 블레이드를 삽입하고 나선 인대 / 측면을 따라 여러 개의 작은 상처를 만들기초 차례의 벽. </li><li> 5mm Vannas-튀빙겐 스프링 가위를 사용하여, 그냥 잘라 영역에 하나의 블레이드를 삽입하고 측두골 외부의 다른 블레이드를 배치, 타원형 창으로 내측. 이 컷은 중간과 혀끝의 회전에서 기저 회전을 분리한다. </li></ol></li><li> 기초 차례의 전체 해부. <ol><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 기초 차례로 긴장을 풀고 전정 기관에서 별도의 기저 차례 이하로 잘라 modiolus에 연결 나선 신경절 신경 섬유를 잘라. </li><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 코르티 기관 위와 아래 모두에서 나선 인대 / 측면 벽을 제거하기 위해 작은 상처의 시리즈를 확인합니다. 조직을 안내하는 # 4, # 5 연속 보석상의 집게를 사용합니다. 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시에 나선 신경절 신경 섬유를 핀하지만 조직이 눈물로이 지역에 보유하지 않습니다. </li><li> 이전 단계, Reissner의 membran의 일부 중전자는 종종 제거됩니다. 어떤이 여전히 남아있는 경우, # 4, # 5 직선 보석의 집게와 Reissner의 멤브레인을 파악하고 코르티 기관에서 멀리 당기십시오. 참고 : tectorial 멤브레인은 거의 볼 수 있고 일반적으로 제거를위한 특정 단계를 필요로하지 않고 멀리 수레. </li><li> 마지막에, 가능한 한 평면 회전을하고 나선 신경절의 나머지 축삭을 잡고, 해부 기저 차례 전송 # 4 또는 # 5 직선 보석의 집게를 사용하여, 나선 신경절 축삭의 두께를 감소시키기 위해 여러 컷을 만드는 48 웰 플레이트 (또는 챔버 슬라이드) 10 mM의 PBS pH가 7.4 ~ 500 μl를 포함. </li></ol></li><li> 별도의 중간과 혀끝의 회전 <ol><li> 달팽이관, 아래로 정점 측의 나머지 3 분의 2를 놓습니다. </li><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 사용 중간 차례 기초 차례에 연결되는 스칼라 매체에 하나의 블레이드를 삽입하고 일의 나선 인대 / 측면 벽을 따라 여러 개의 작은 상처를 만들전자 중앙의 전원을 켭니다. </li><li> 5mm Vannas-튀빙겐 스프링 가위를 사용하여, 바로 블레이드의 상단에 배치 된 중간 차례 절단 영역에 하나의 블레이드를 삽입하고 혀끝의 끝에서 90 오 각도, 뼈 미로 외부에 다른 블레이드를 배치합니다. 이 혀끝의 차례에서 중간 차례를 분리한다. </li></ol></li><li> 기초 차례 유사한 방식으로 중간 차례의 전체 해부 (5.2.4 단계 5.2.2 참조). </li><li> 혀끝의 차례의 전체 해부. <ol><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 혀끝의 회전을 커버 뚜껑을 엽니 다. 기초 차례 유사한 방식으로 완전 해부 (5.2.4 단계 5.2.2 참조). 주 : 해부 달팽이관 회전은 면역 염색 전에 몇 주 동안 4 O C에서 48 웰 플레이트 (또는 챔버 슬라이드)에 10 mM의 pH 7.4의 PBS에 저장 될 수있다. 에 세균이나 곰팡이의 성장을 초래할 수 3 주 - 그러나 PBS는 더 이상 2보다 증발 주기적으로 보충 할 필요가 및 저장합니다화상의 품질을 감소시킬 수있다 조직. 우리 undissected 시간적 뼈 같은 샘플 장기간 저장을 추천한다. </li></ol></li></ol> 찬란 태그 항체 6. 면역 염색 <ol><li> 절개 한 후, 10 mM의 PBS pH를 7.4 ~ 500 μL에 잠긴 48 웰 플레이트 (또는 챔버 슬라이드)에 별도의 잘 각각의 인공 차례를 저장합니다. 다음 각 단계를 들어 인공 차례, 액체에 잠긴한다 위에 떠 있지 않거나 잘의 측면에 붙어. 참고 : 물론 각에서 액체를 제거 할 때, 그것은 인공 회전을 잃거나 피펫 팁에서 그것을 빨아 쉽다. 해부 범위를 사용하여 200 μL 피펫 팁과 솔루션을 변경하면이 문제를 방지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 피펫을 사용하여, 각 웰로부터 PBS를 제거하고 교체 ~ 200 - / 차단 투과성으로 용액 (웰당 300 ㎕의 1 % 트리톤 X-100, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 및 10 % 정상 염소 혈청 (NGS) 10 mM의 PBS 피에 희석H 7.4). 3D 회전에 실온에서 1 시간을 품어. 주 : 사용 된 일차 항체가 염소 숙주에서 만들어진 경우, 보조 항 - 염소 항체를 필요로 할 것이며, NGS는 어떤 단계에 사용되어서는 안된다. 정상 말 혈청 NGS위한 대체로서 사용할 수있다. </li><li> 피펫을 사용하여 차단 / 투과성으로 솔루션을 제거하고 차 항체 용액을 잘 당 ~ 100 μL로 교체 (0.1 % 트리톤 X-100, 10 mM의 PBS의 pH 7.4에 희석 1 % BSA, 5 % NGS). 각각의 일차 항체의 희석 배수는 다릅니다. 3D 회전에서 4 ℃로 O / N (최소 14 시간)을 품어. 주 : 하나 이상의 차 항체가 사용되는 경우, 모든 단지 각 차 항체가 다른 호스트를 가지고 있는지 확인 인큐베이션 동일한 용액에 결합 될 수있다. </li><li> 피펫을 사용하여 일차 항체 솔루션을 제거하고 잘 당 ~ 500 μL에서 10 mM의 PBS 산도 7.4의 3 세척을 수행합니다. 각 세척 3D 회전기에 RT에서 5 분의 최소 잠복. </li><li> 마지막으로 P를 제거BS는 피펫을 사용하여 이차 항체 용액을 웰 당 100 μL ~와 교체 워시 (0.1 % 트리톤 X-100, 10 mM의 pH 7.4의 PBS로 희석하고, 1 % BSA, 5 % NGS). 500 또는 1 : 1,000 각 희석 배수는 형광 이차 항체는 일반적으로 1 태그. 찬란 보호 빛 차 항체를 태그하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 놓습니다. 3D 회전에 실온에서 3 시간 - 2를 품어. 주 : 둘 이상의 이차 항체가 필요한 경우, 그들은 동일한 배양 용 용액에 결합 될 수있다. 크로스 라벨의 가능성이없는 것을 확인합니다 (예., 염소 항 - 토끼와 닭고기 방지 염소 이차 항체 사용) </li><li> 피펫을 사용하여 이차 항체 솔루션을 제거하고 잘 당 ~ 500 μL에서 10 mM의 PBS 산도 7.4의 3 세척을 수행합니다. 3D 회전에 실온에서 5 분의 최소 각 세척을 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 유지합니다. </li><li> 피펫을 사용하여 마지막 PBS 세척을 제거하고 Hoec 잘 당 ~ 100 μL로 교체핵을 레이블 : HST 33342 (10 mM의 PBS pH를 7.4에서 2000 1 희석). 3D 회전에 실온에서 20 분 - 15 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 유지합니다. 이상 20 분 부화하지 마십시오. </li><li> 피펫을 사용하여 훽스트 (Hoechst) 솔루션을 제거하고 잘 당 ~ 500 μL에서 10 mM의 PBS 산도 7.4의 3 세척을 수행합니다. 3D 회전에 실온에서 5 분의 최소 각 세척을 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 유지합니다. </li><li> 필요한 경우 모든 단계는 몇 시간, 훽스트 배양을 제외하고, 확장 할 수 있습니다. 모든 단계에서의 반응을 일시 중지하려면 단지 10 mM이 PBS pH 7.4로의 ~ 500 UL의 샘플 잠수함 및 프로토콜 시간 1 재개 할 준비가 될 때까지 4 ℃로 48 - 글쎄 플레이트 (또는 챔버 슬라이드)를 저장 - 2 일 이상 . </li></ol> 7. 산 달팽이는 슬라이드를 켭니다 <ol><li> 라벨에 사용되는 샘플과 항체에 대한 관련 정보를 슬라이드. </li><li> 피펫 설치 미디어의 ~ 50 μL를 각 슬라이드에 및주의거품을 방지한다. 임의의 기포를 제거하기 위해 설치 미디어를 포함하는 튜브를 원심 분리기. </li><li> # 4, # 5 연속 보석상의 집게를 사용하여 부드럽게 장착 매체에 슬라이드와 장소에 48 웰 플레이트에서 하나의 인공 차례를 전송하기 위해 나선 신경절의 축삭을 파악. 슬라이드 당 장착 한 인공 차례 이미징 과정에서 빛 노출과 광표백을 방지합니다. </li><li> 인공 차례, 접힌 트위스트, 또는 기포 근처되지 않도록 스테레오 해부 현미경을 사용합니다. 이러한 상황이 발생하면, 사용 # 4, # 5 직선 보석의 집게는 인공 차례의 위치를​​ 변경합니다. </li><li> 슬라이드 커버 슬립의 한쪽 끝을 놓고 부드럽게 coverslip에 가을 있도록 놓습니다. </li><li> 인공 차례, 접힌 트위스트, 또는 기포 근처되지 않도록 스테레오 해부 현미경을 사용합니다. 이러한 상황이 발생하면, 부드럽게 인공 차례의 위치를​​ 앞뒤로 coverslip에 이동합니다. </li><li> 장소 슬라이드그래서 슬라이드 폴더에 그들은 평면 배치. 설치하자 미디어 경화 O / RT에서 N (어둠 속에서 계속) </li><li> 명확한 매니큐어 및 저장 실온에서 또는 -20 O를 C와 인감 된 커버가 될 때까지 몇 군데. 슬라이드는 슬라이드 폴더 또는 슬라이드 박스에 저장 될 수있다. 참고 : 슬라이드 -20 O를 C 또는 -80 O C와 형광에서 장기 저장 될 수는 몇 달 동안 유지됩니다. </li><li> 면역 염색 과정 중에 사용되는 이차 항체에 따라 적절한 파장의 공 초점 현미경을 사용하여 화상 슬라이드. 명도 및 콘트라스트 조정 촛점 벤더에 의해 제공된 이미지 소프트웨어를 이용하여 수행 될 수있다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> 성공적인 전체 마운트 해부 및 면역 염색에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이러한 방법 중 하나를 수행하지만 전에, 인공 조직의 적절한 고정이 필요하다. 우리는 메탄올 무료, 초순수, EM 등급 PFA를 사용하는 것이 좋습니다. PFA는 메탄올과 면역의 품질을 감소 불안정의 pH의 흔적을 가질 수 분말했다. 다른 그룹은 유사한 해부 포름 알데히드 14-16를 포함하지 않는 수 사용하여 ?...

측두골에 포함 된 내이의 나선형 모양의 달팽이관은 코르티, 포유 동물의 청각 감각 최종 기관의 장기 주택. 달팽이관 tonotopically 편성 일반적 혀끝, 중앙으로 분할하고, 기초가 정점 1베이스와 낮은 주파수 검출에 고주파 사운드 검출과 상이한 주파수 영역들에 대응하도록 설정 한. 헤어 셀, 코르티 기관의 mechanosensory 세포는 쥐 2,3 약 6mm 길이 달팽이관의 길이를 실행합니다. 이러한 셀 구조체 중심부의 청각 신경에 의해 처리되는 신호들로, 유체 충전식 멤브레인 미로를 통해 전송되는 음파의 기계적 에너지로 변환. 여기에 설명 된 기술은 (나이 일주일로부터 성인에 이르기까지의 샘플에 대해) 달팽이관의 석회화 후 코르티 기관의 전체 마운트를 제조하는 방법이 완료 제공한다. 우리는 또한 immunosta에 대한 방법을 제시한다전체 ining 인공 조직을 설치. 인공 와우 전체 마운트는 모든 유모 세포의 시각화 및 자연 공간 배치에서 지원하는 세포를 둘러싸는 매우 중요하며, 공 초점 현미경을 사용하여 세 가지 차원에서 분석 할 수 있습니다. 박사. 한스 엥 스트롬과 할로우 아데스는 원래 그들은 빠르게 현미경 분석 4 코르티 기관의 짧은 그대로 세그먼트를 보존, 수정 및 포유 동물의 다양한 액체에 잠긴 석회화 cochleae를 해부하는 방법을 자세히 설명 1966 년 전체 마운트 인공 해부 방법을 설명했다. 고정되지 않은, 석회화 쥐 달팽이관의 해부는 교육 비디오 5에 도시되어있다. 박사. 바바라 BOHNE 워싱턴 대학의 게리 하딩은이 방법에 몇 가지 중요한 수정을했다. 인공 전체 마운트 방법의 자신의 버전에서는 시간적 뼈, 탈회했다 플라스틱에 포함, 5 반 회전, 10 분기 턴은 dissec했다테드 6,7. 그 플라스틱 삽입이 8 필요하지 그래서 찰스 박사 Liberman과 이튼 피바디 연구소, 매사추세츠 눈과 귀 의무실에서 연구팀은이 기술을 수정했습니다. 기술의 추가 수정은 여기에 제시된 해부 방법을 알려 세인트 주드 아동 연구 병원 9-12 박사 지안 주오의 실험실에서 발생했습니다. 우리는 완전한 혀끝의, 중간 및 기저 회전의 분리를 허용 BOHNE와 Liberman보다 코르티의 기관에 액세스하기 위해 다른 전략을 사용합니다. 따라서 해부 조직은 크고 해부 또는 면역 염색 과정에서 손실되거나 손상 될 가능성이 적습니다. 또한, 현재의 방법은 팁 선단 또는 주파수 영역을 식별하는 기저 후크로부터의 거리 측정을 용이하게한다. 많은 연구소가 인공 조직의 면역 염색을 수행하지만이 방법이 발생한 위치, 그것은 명확하지 않다. 그 결과 buffe을 차단하기위한 다양한 조리법이있다RS 및 개별 일차 항체의 성능에 영향을 미칠 수있다 항체 인큐베이션 버퍼. 여기서는 청각 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 항체에도 적용 가능하다 형광 태그 항체로 면역 염색을위한 하나의 방법을 제시한다. 달팽이관의 복잡한 모양, 코르티 기관의 섬세한 구조 및 뼈에 넣음은 조직 학적 및 생화학 적 분석을위한 도전을 제공합니다. 다양한 기술이 현재 어려운 특징을 극복하고 코르티 자체 장단점 각 기술의 장기 내에서 세포를 시각화하기 위해 청각 분야에서 사용된다. 여기에 제시된 프로토콜은 약간의 수정과, 잠재적으로 다른 분야에서 사용되는 모델이 다양한 유기체로부터 cochleae 내의 중요한 구조를 검사하는 데 사용될 수 있으며, 성인 마우스 달팽이관의 전체 마운트 박리 가능하고.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1074">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:377px;">Standard&#160; pattern forceps</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11000-12</td>
			<td style="width:395px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">10.5 cm fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18814</td>
			<td style="width:395px;">TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">end-over-end tube rotator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-450-127</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">activated charcoal</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC134372500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereo dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #4 jeweler&#39;s forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 jeweler&#39;s forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mm Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td>curved&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Vannas-Tubingen spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td>straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48 well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-52</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8 well chamber slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1256518</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA, fraction V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGS</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NHS</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3D rotator</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>R3D-710</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western blot incubation box XL</td>
			<td>Licor</td>
			<td>929-97401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Prolong gold antifade mounting media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td style="width:395px;">can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coverslips 22 x 22 x 1</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clear nail polish</td>
			<td>Local drug store</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cardboard slide folder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-10</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스) 그림 1에 제시된 키 해부 단계, 석회화이다 인공 조직에서 같이 코르티 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 개발의 첫 번째 출생 후 주의 석회화 중 마우스 달팽이관이 불완전하고 더 간단한 박리 법 (13)을 사용할 수있다. 코르티 기관의 P7에서 달팽이관과 눈물의 오래된 마우스 결과와 분쇄와 신생아 ...

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Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

whole-mount-dissection-immunofluorescence-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

54.7K 조회수.  Southern Illinois University, School of Medicine.  우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다. 

비디오: Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

연구

신경과학

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

성인 전체 마운트 준비 Drosophila</em장 섬유 염료 주입을위한> 복부 신경 코드

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear. Since there is no cell line that satisfactorily represents mammalian hair cells, research on hair cells relies on primary organ cultures. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice (Figure 1) 1-6. The utricle is a vestibular organ, and the hair cells of the utricle are similar in both structure and function to the hair cells in the auditory organ, the organ of Corti. The adult mouse utricle preparation represents a mature sensory epithelium for studies of the molecular signals that regulate the survival, homeostasis, and death of these cells.
Mammalian cochlear hair cells are terminally differentiated and are not regenerated when they are lost. In non-mammalian vertebrates, auditory or vestibular hair cell death is followed by robust regeneration which restores hearing and balance functions 7, 8. Hair cell regeneration is mediated by glia-like supporting cells, which contact the basolateral surfaces of hair cells in the sensory epithelium 9, 10. Supporting cells are also important mediators of hair cell survival and death 11. We have recently developed a technique for infection of supporting cells in cultured utricles using adenovirus. Using adenovirus type 5 (dE1/E3) to deliver a transgene containing GFP under the control of the CMV promoter, we find that adenovirus specifically and efficiently infects supporting cells. Supporting cell infection efficiency is approximately 25-50%, and hair cells are not infected (Figure 2). Importantly, we find that adenoviral infection of supporting cells does not result in toxicity to hair cells or supporting cells, as cell counts in Ad-GFP infected utricles are equivalent to those in non-infected utricles (Figure 3). Thus adenovirus-mediated gene expression in supporting cells of cultured utricles provides a powerful tool to study the roles of supporting cells as mediators of hair cell survival, death, and regeneration.

Mechanosensory hair cells are the receptor cells of the inner ear. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice. We present the dissection of the adult mouse utricle, and we demonstrate adenovirus-mediated infection of supporting cells in cultured utricles.

성인 마우스 Utricle 및 아데노 바이러스 - 매개 지원하는 세포 감염의 해부

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

전신 탈염 신경 근육 정션 분석을위한 트랜스 대 복부 근육의 해부

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

마우스의 메인 후각 시스템의 섬모의 전체 마운트 라벨링

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