Name: whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea at JoVE.com

This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

윤리 문 : 동물 주제와 관련된 절차는 의학의 서던 일리노이 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 시간적 뼈 1. 추출 <ol><li> 마우스 두개골 (13)의베이스에 시간적 뼈를 확인하고 표준 패턴 집게를 사용하여 두개골 신경을 멀리 쳤어요. </li><li> 캡슐화 된 달팽이관을 제거하기 위해 귀의 캡슐의 끝에서 아래로 후부 반원의 운하에 반대 손으로 언론의 엄지 손가락으로 표준 패턴 집게를 놓습니다. </li><li> 수동으로 엄지와 검지 손가락으로 또는 10.5 cm 미세 가위를 사용하여 두개골에서 시간적 뼈의 아래쪽 절반을 무료로 제공됩니다. </li></ol> 2. 임시 뼈를 포스트 - 수정 <ol><li> 10 mM의 인산 완충 식염수에 희석 500 μL 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) (PBS)의 pH 7.4와 incub - (250)를 포함하는 2 ml의 마이크로 원심 튜브에 시간적 뼈를 배치20 시간 - 2 RT에서 먹었다. 참고 : 원형 또는 타원형 창에 PFA의 정점 캡 또는 주입의 어떠한 개구가 필요하지 않습니다. 유리 병에 16 % 농도에서 구입할 수 있습니다 메탄올 무료, 초순수, 전자 현미경 (EM) 등급 PFA를 사용하는 것이 좋습니다. 유리 병은 개방 한 희석되면 : 4 % 용액을, PBS로 4 (일부 항체가 허용 할 수있는 짧은 정착 등을 필요로 4 ℃로 저장 될 때, 그것은 최대 2 주 동안 사용할 수있는 O / N (O / N) 고정). </li></ol> 3. 석회 시간적 뼈 <ol><li> 고정 후, 피펫을 사용하여 PFA를 제거하고 120 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 약간 이상 2 ㎖로 대체합니다. 튜브를 닫을 때 공기가 거품 방지하기 위해 전체 2 ML의 microcentrifuge 관을 채우기해야합니다. <ol><li> 바로 decalcifying하지 않는 경우, 4 O ℃에서 10 mM의 PBS 산도 7.4 저장 샘플 PFA 교체 참고 : 고정 후, 시간적 뼈가 variab 저장할 수 있습니다제작 : 항원에 따라 탈회가 조사되기 전에 시간의 양. </li></ol></li><li> 엔드 오버 엔드 회전에 장소 튜브 및 실온에서 4 rpm으로 회전. 피펫을 사용하여 매일 EDTA 솔루션을 변경합니다. 탈회의 길이는 시료의 나이와 절개를하고있는 과학자의 취향에 따라 달라집니다. <ol><li> 배양 시간에 대한 다음 지침을 사용하여 EDTA에 시간적 뼈를 품어 : 8 P15에 샘플 출생 후 하루 (P)의 경우 : 2-4 시간; P21에 샘플 P15의 경우 : O / N; P30에 샘플 P21의 경우 : 2 O / N; 3 개 이상의 O / N : P30보다 오래된 샘플하십시오. 참고 : 탈회 시간은 사용자의 환경에 제한이있을 수 있으며, 필요에 따라 확장 할 수 있습니다. 탈회 시간은 약 8 시간 간격, 하루 두번 EDTA 용액을 변화시킴으로써 감소 될 수있다. 오염을 방지하기 위해 이상 3 일간 decalcifying 때 일부 연구소는 EDTA 용액에 1 % PFA를 추가합니다. </li></ol></li><li> 시료가 적절하게 탈회하는 경우 O 시간적 뼈를 배치, 확인하려면NA 실리콘 해부 접시를 엘라스토머 코팅 부드럽게 달팽이 모양의 달팽이관에 집게를 누릅니다. 조직 spongey이면 탈회가 완료되었습니다. </li><li> 탈회가 완료되면, 피펫을 사용하여 EDTA를 제거하고 10 mM의 PBS 산도 7.4의 500 -1,000 μl를 추가합니다. 준비까지 4 O C에서 보관 샘플을 해부합니다. </li></ol> 4. 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시 만들기 <ol><li> 베이스와 제조자의 지시에 따라 실리콘 엘라스토머 밀봉 키트 경화제 수확기 철저히 혼합한다. </li><li> 이 솔루션은 검은 색이 될 때까지 가루 숯 3 큰술과 잘 혼합 - 약 2를 추가합니다. 주 : 습식 잉크 또는 액체 숯 용액과 혼합되지 않고 사용할 수 없다. 실리콘 엘라스토머 밀봉 키트는 4.2 단계를 생략 할 수 있도록, 검정에서 구입할 수있다. </li><li> 코트에 충분히 바닥을 작성, 60mm 유리 또는 플라스틱 배양 접시에 솔루션을 붓는다. BU 경우bbles이 존재하는 표면에 공기 퍼프. 설정 실온에서 최소 24 시간을 서 보자. 주 : 실리콘 엘라스토머 코팅 접시 년간 반복 사용할 수있다. 이 실리콘 엘라스토머는 균열의 원인이됩니다 그러나, 청소를​​ 위해 에탄올을 사용하지 마십시오. </li></ol> (P7과 이전 샘플) 달팽이관 5. 전체 마운트 해부 <ol><li> 중간 / 혀끝의 회전에서 기저 회전을 분리 <ol><li> 10 mM의 PBS pH를 7.4으로 3 분의 2 가득 채워진 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시에 한 탈회 측두골을 놓고 다음 단계에 대한 스테레오 해부 현미경을 사용합니다. </li><li> # 4, # 5 연속 보석상의 집게를하고 5mm Vannas-튀빙겐 스프링 가위를 이용하여 전정 지역에서 측두골을 잡고, 측면을 따라 꼭대기 위에 여분의 귀 캡슐 조직을 절단. </li><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여 타원형 창에 하나의 블레이드를 삽입하고 나선 인대 / 측면을 따라 여러 개의 작은 상처를 만들기초 차례의 벽. </li><li> 5mm Vannas-튀빙겐 스프링 가위를 사용하여, 그냥 잘라 영역에 하나의 블레이드를 삽입하고 측두골 외부의 다른 블레이드를 배치, 타원형 창으로 내측. 이 컷은 중간과 혀끝의 회전에서 기저 회전을 분리한다. </li></ol></li><li> 기초 차례의 전체 해부. <ol><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 기초 차례로 긴장을 풀고 전정 기관에서 별도의 기저 차례 이하로 잘라 modiolus에 연결 나선 신경절 신경 섬유를 잘라. </li><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 코르티 기관 위와 아래 모두에서 나선 인대 / 측면 벽을 제거하기 위해 작은 상처의 시리즈를 확인합니다. 조직을 안내하는 # 4, # 5 연속 보석상의 집게를 사용합니다. 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시에 나선 신경절 신경 섬유를 핀하지만 조직이 눈물로이 지역에 보유하지 않습니다. </li><li> 이전 단계, Reissner의 membran의 일부 중전자는 종종 제거됩니다. 어떤이 여전히 남아있는 경우, # 4, # 5 직선 보석의 집게와 Reissner의 멤브레인을 파악하고 코르티 기관에서 멀리 당기십시오. 참고 : tectorial 멤브레인은 거의 볼 수 있고 일반적으로 제거를위한 특정 단계를 필요로하지 않고 멀리 수레. </li><li> 마지막에, 가능한 한 평면 회전을하고 나선 신경절의 나머지 축삭을 잡고, 해부 기저 차례 전송 # 4 또는 # 5 직선 보석의 집게를 사용하여, 나선 신경절 축삭의 두께를 감소시키기 위해 여러 컷을 만드는 48 웰 플레이트 (또는 챔버 슬라이드) 10 mM의 PBS pH가 7.4 ~ 500 μl를 포함. </li></ol></li><li> 별도의 중간과 혀끝의 회전 <ol><li> 달팽이관, 아래로 정점 측의 나머지 3 분의 2를 놓습니다. </li><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 사용 중간 차례 기초 차례에 연결되는 스칼라 매체에 하나의 블레이드를 삽입하고 일의 나선 인대 / 측면 벽을 따라 여러 개의 작은 상처를 만들전자 중앙의 전원을 켭니다. </li><li> 5mm Vannas-튀빙겐 스프링 가위를 사용하여, 바로 블레이드의 상단에 배치 된 중간 차례 절단 영역에 하나의 블레이드를 삽입하고 혀끝의 끝에서 90 오 각도, 뼈 미로 외부에 다른 블레이드를 배치합니다. 이 혀끝의 차례에서 중간 차례를 분리한다. </li></ol></li><li> 기초 차례 유사한 방식으로 중간 차례의 전체 해부 (5.2.4 단계 5.2.2 참조). </li><li> 혀끝의 차례의 전체 해부. <ol><li> 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 혀끝의 회전을 커버 뚜껑을 엽니 다. 기초 차례 유사한 방식으로 완전 해부 (5.2.4 단계 5.2.2 참조). 주 : 해부 달팽이관 회전은 면역 염색 전에 몇 주 동안 4 O C에서 48 웰 플레이트 (또는 챔버 슬라이드)에 10 mM의 pH 7.4의 PBS에 저장 될 수있다. 에 세균이나 곰팡이의 성장을 초래할 수 3 주 - 그러나 PBS는 더 이상 2보다 증발 주기적으로 보충 할 필요가 및 저장합니다화상의 품질을 감소시킬 수있다 조직. 우리 undissected 시간적 뼈 같은 샘플 장기간 저장을 추천한다. </li></ol></li></ol> 찬란 태그 항체 6. 면역 염색 <ol><li> 절개 한 후, 10 mM의 PBS pH를 7.4 ~ 500 μL에 잠긴 48 웰 플레이트 (또는 챔버 슬라이드)에 별도의 잘 각각의 인공 차례를 저장합니다. 다음 각 단계를 들어 인공 차례, 액체에 잠긴한다 위에 떠 있지 않거나 잘의 측면에 붙어. 참고 : 물론 각에서 액체를 제거 할 때, 그것은 인공 회전을 잃거나 피펫 팁에서 그것을 빨아 쉽다. 해부 범위를 사용하여 200 μL 피펫 팁과 솔루션을 변경하면이 문제를 방지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 피펫을 사용하여, 각 웰로부터 PBS를 제거하고 교체 ~ 200 - / 차단 투과성으로 용액 (웰당 300 ㎕의 1 % 트리톤 X-100, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 및 10 % 정상 염소 혈청 (NGS) 10 mM의 PBS 피에 희석H 7.4). 3D 회전에 실온에서 1 시간을 품어. 주 : 사용 된 일차 항체가 염소 숙주에서 만들어진 경우, 보조 항 - 염소 항체를 필요로 할 것이며, NGS는 어떤 단계에 사용되어서는 안된다. 정상 말 혈청 NGS위한 대체로서 사용할 수있다. </li><li> 피펫을 사용하여 차단 / 투과성으로 솔루션을 제거하고 차 항체 용액을 잘 당 ~ 100 μL로 교체 (0.1 % 트리톤 X-100, 10 mM의 PBS의 pH 7.4에 희석 1 % BSA, 5 % NGS). 각각의 일차 항체의 희석 배수는 다릅니다. 3D 회전에서 4 ℃로 O / N (최소 14 시간)을 품어. 주 : 하나 이상의 차 항체가 사용되는 경우, 모든 단지 각 차 항체가 다른 호스트를 가지고 있는지 확인 인큐베이션 동일한 용액에 결합 될 수있다. </li><li> 피펫을 사용하여 일차 항체 솔루션을 제거하고 잘 당 ~ 500 μL에서 10 mM의 PBS 산도 7.4의 3 세척을 수행합니다. 각 세척 3D 회전기에 RT에서 5 분의 최소 잠복. </li><li> 마지막으로 P를 제거BS는 피펫을 사용하여 이차 항체 용액을 웰 당 100 μL ~와 교체 워시 (0.1 % 트리톤 X-100, 10 mM의 pH 7.4의 PBS로 희석하고, 1 % BSA, 5 % NGS). 500 또는 1 : 1,000 각 희석 배수는 형광 이차 항체는 일반적으로 1 태그. 찬란 보호 빛 차 항체를 태그하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 놓습니다. 3D 회전에 실온에서 3 시간 - 2를 품어. 주 : 둘 이상의 이차 항체가 필요한 경우, 그들은 동일한 배양 용 용액에 결합 될 수있다. 크로스 라벨의 가능성이없는 것을 확인합니다 (예., 염소 항 - 토끼와 닭고기 방지 염소 이차 항체 사용) </li><li> 피펫을 사용하여 이차 항체 솔루션을 제거하고 잘 당 ~ 500 μL에서 10 mM의 PBS 산도 7.4의 3 세척을 수행합니다. 3D 회전에 실온에서 5 분의 최소 각 세척을 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 유지합니다. </li><li> 피펫을 사용하여 마지막 PBS 세척을 제거하고 Hoec 잘 당 ~ 100 μL로 교체핵을 레이블 : HST 33342 (10 mM의 PBS pH를 7.4에서 2000 1 희석). 3D 회전에 실온에서 20 분 - 15 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 유지합니다. 이상 20 분 부화하지 마십시오. </li><li> 피펫을 사용하여 훽스트 (Hoechst) 솔루션을 제거하고 잘 당 ~ 500 μL에서 10 mM의 PBS 산도 7.4의 3 세척을 수행합니다. 3D 회전에 실온에서 5 분의 최소 각 세척을 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 유지합니다. </li><li> 필요한 경우 모든 단계는 몇 시간, 훽스트 배양을 제외하고, 확장 할 수 있습니다. 모든 단계에서의 반응을 일시 중지하려면 단지 10 mM이 PBS pH 7.4로의 ~ 500 UL의 샘플 잠수함 및 프로토콜 시간 1 재개 할 준비가 될 때까지 4 ℃로 48 - 글쎄 플레이트 (또는 챔버 슬라이드)를 저장 - 2 일 이상 . </li></ol> 7. 산 달팽이는 슬라이드를 켭니다 <ol><li> 라벨에 사용되는 샘플과 항체에 대한 관련 정보를 슬라이드. </li><li> 피펫 설치 미디어의 ~ 50 μL를 각 슬라이드에 및주의거품을 방지한다. 임의의 기포를 제거하기 위해 설치 미디어를 포함하는 튜브를 원심 분리기. </li><li> # 4, # 5 연속 보석상의 집게를 사용하여 부드럽게 장착 매체에 슬라이드와 장소에 48 웰 플레이트에서 하나의 인공 차례를 전송하기 위해 나선 신경절의 축삭을 파악. 슬라이드 당 장착 한 인공 차례 이미징 과정에서 빛 노출과 광표백을 방지합니다. </li><li> 인공 차례, 접힌 트위스트, 또는 기포 근처되지 않도록 스테레오 해부 현미경을 사용합니다. 이러한 상황이 발생하면, 사용 # 4, # 5 직선 보석의 집게는 인공 차례의 위치를​​ 변경합니다. </li><li> 슬라이드 커버 슬립의 한쪽 끝을 놓고 부드럽게 coverslip에 가을 있도록 놓습니다. </li><li> 인공 차례, 접힌 트위스트, 또는 기포 근처되지 않도록 스테레오 해부 현미경을 사용합니다. 이러한 상황이 발생하면, 부드럽게 인공 차례의 위치를​​ 앞뒤로 coverslip에 이동합니다. </li><li> 장소 슬라이드그래서 슬라이드 폴더에 그들은 평면 배치. 설치하자 미디어 경화 O / RT에서 N (어둠 속에서 계속) </li><li> 명확한 매니큐어 및 저장 실온에서 또는 -20 O를 C와 인감 된 커버가 될 때까지 몇 군데. 슬라이드는 슬라이드 폴더 또는 슬라이드 박스에 저장 될 수있다. 참고 : 슬라이드 -20 O를 C 또는 -80 O C와 형광에서 장기 저장 될 수는 몇 달 동안 유지됩니다. </li><li> 면역 염색 과정 중에 사용되는 이차 항체에 따라 적절한 파장의 공 초점 현미경을 사용하여 화상 슬라이드. 명도 및 콘트라스트 조정 촛점 벤더에 의해 제공된 이미지 소프트웨어를 이용하여 수행 될 수있다. </li></ol>

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	<li>Robles, L., Ruggero, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+the+mammalian+cochlea.">Mechanics of the mammalian cochlea.</a> Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).</li><li>Ehret, G., Frankenreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitattive+analysis+of+cochlear+structures+in+the+house+mouse+in+relation+to+mechanisms+of+acoustical+information+processing.">Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing.</a> J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).</li><li>Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+damage+in+the+C57BL/CBA+mouse+cochlea.">Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea.</a> Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).</li><li>Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+Recordings+at+Afferent+Dendrites+Contacting+Cochlear+Inner+Hair+Cells:+Monitoring+Multivesicular+Release+at+a+Ribbon+Synapse.">Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse.</a> J Vis Exp. (48), e2442 (2011).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C., Willott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Mouse Auditory Research. , 171-187 (2001).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+proliferation+of+postmitotic+cochlear+supporting+cells+by+acute+ablation+of+the+retinoblastoma+protein+in+neonatal+mice.">In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice.</a> J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).</li><li>Steigelman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-1+Is+Required+for+Stereocilia+Structure+But+Not+for+Mechanotransduction+in+Inner+Ear+Hair+Cells.">Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells.</a> J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+in+vivo+conversion+of+mouse+cochlear+pillar+and+Deiters'+cells+to+immature+hair+cells+by+Atoh1+ectopic+expression.">Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression.</a> J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).</li><li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), e1685 (2010).</li><li>Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+half+the+hair+cells+in+the+mouse+utricle+first+appear+after+birth,+with+significant+numbers+originating+from+early+postnatal+mitotic+production+in+peripheral+and+striolar+growth+zones.">Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).</li><li>Collado, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postnatal+accumulation+of+junctional+E-cadherin+is+inversely+correlated+with+the+capacity+for+supporting+cells+to+convert+directly+into+sensory+hair+cells+in+mammalian+balance+organs.">The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs.</a> J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).</li><li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium.">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li><li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome:+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology.">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> 성공적인 전체 마운트 해부 및 면역 염색에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이러한 방법 중 하나를 수행하지만 전에, 인공 조직의 적절한 고정이 필요하다. 우리는 메탄올 무료, 초순수, EM 등급 PFA를 사용하는 것이 좋습니다. PFA는 메탄올과 면역의 품질을 감소 불안정의 pH의 흔적을 가질 수 분말했다. 다른 그룹은 유사한 해부 포름 알데히드 14-16를 포함하지 않는 수 사용하여 ?...

측두골에 포함 된 내이의 나선형 모양의 달팽이관은 코르티, 포유 동물의 청각 감각 최종 기관의 장기 주택. 달팽이관 tonotopically 편성 일반적 혀끝, 중앙으로 분할하고, 기초가 정점 1베이스와 낮은 주파수 검출에 고주파 사운드 검출과 상이한 주파수 영역들에 대응하도록 설정 한. 헤어 셀, 코르티 기관의 mechanosensory 세포는 쥐 2,3 약 6mm 길이 달팽이관의 길이를 실행합니다. 이러한 셀 구조체 중심부의 청각 신경에 의해 처리되는 신호들로, 유체 충전식 멤브레인 미로를 통해 전송되는 음파의 기계적 에너지로 변환. 여기에 설명 된 기술은 (나이 일주일로부터 성인에 이르기까지의 샘플에 대해) 달팽이관의 석회화 후 코르티 기관의 전체 마운트를 제조하는 방법이 완료 제공한다. 우리는 또한 immunosta에 대한 방법을 제시한다전체 ining 인공 조직을 설치. 인공 와우 전체 마운트는 모든 유모 세포의 시각화 및 자연 공간 배치에서 지원하는 세포를 둘러싸는 매우 중요하며, 공 초점 현미경을 사용하여 세 가지 차원에서 분석 할 수 있습니다. 박사. 한스 엥 스트롬과 할로우 아데스는 원래 그들은 빠르게 현미경 분석 4 코르티 기관의 짧은 그대로 세그먼트를 보존, 수정 및 포유 동물의 다양한 액체에 잠긴 석회화 cochleae를 해부하는 방법을 자세히 설명 1966 년 전체 마운트 인공 해부 방법을 설명했다. 고정되지 않은, 석회화 쥐 달팽이관의 해부는 교육 비디오 5에 도시되어있다. 박사. 바바라 BOHNE 워싱턴 대학의 게리 하딩은이 방법에 몇 가지 중요한 수정을했다. 인공 전체 마운트 방법의 자신의 버전에서는 시간적 뼈, 탈회했다 플라스틱에 포함, 5 반 회전, 10 분기 턴은 dissec했다테드 6,7. 그 플라스틱 삽입이 8 필요하지 그래서 찰스 박사 Liberman과 이튼 피바디 연구소, 매사추세츠 눈과 귀 의무실에서 연구팀은이 기술을 수정했습니다. 기술의 추가 수정은 여기에 제시된 해부 방법을 알려 세인트 주드 아동 연구 병원 9-12 박사 지안 주오의 실험실에서 발생했습니다. 우리는 완전한 혀끝의, 중간 및 기저 회전의 분리를 허용 BOHNE와 Liberman보다 코르티의 기관에 액세스하기 위해 다른 전략을 사용합니다. 따라서 해부 조직은 크고 해부 또는 면역 염색 과정에서 손실되거나 손상 될 가능성이 적습니다. 또한, 현재의 방법은 팁 선단 또는 주파수 영역을 식별하는 기저 후크로부터의 거리 측정을 용이하게한다. 많은 연구소가 인공 조직의 면역 염색을 수행하지만이 방법이 발생한 위치, 그것은 명확하지 않다. 그 결과 buffe을 차단하기위한 다양한 조리법이있다RS 및 개별 일차 항체의 성능에 영향을 미칠 수있다 항체 인큐베이션 버퍼. 여기서는 청각 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 항체에도 적용 가능하다 형광 태그 항체로 면역 염색을위한 하나의 방법을 제시한다. 달팽이관의 복잡한 모양, 코르티 기관의 섬세한 구조 및 뼈에 넣음은 조직 학적 및 생화학 적 분석을위한 도전을 제공합니다. 다양한 기술이 현재 어려운 특징을 극복하고 코르티 자체 장단점 각 기술의 장기 내에서 세포를 시각화하기 위해 청각 분야에서 사용된다. 여기에 제시된 프로토콜은 약간의 수정과, 잠재적으로 다른 분야에서 사용되는 모델이 다양한 유기체로부터 cochleae 내의 중요한 구조를 검사하는 데 사용될 수 있으며, 성인 마우스 달팽이관의 전체 마운트 박리 가능하고.

<table><tbody><tr><td>Standard&amp;nbsp; pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>10.5 cm fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>2 ml microcentrifuge tubes</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade</td><td>Polysciences</td><td>18814</td><td>TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>end-over-end tube rotator</td><td>Fisher</td><td>05-450-127</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>60 mm petri dish</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>activated charcoal</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>stereo dissection microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dumont #4 jeweler&#039;s forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 jeweler&#039;s forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mm Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>curved&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5 mm Vannas-Tubingen spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>straight</td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Fisher</td><td>08-772-52</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>Fisher</td><td>1256518</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>BSA, fraction V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>NHS</td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>3D rotator</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Western blot incubation box XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade mounting media</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>coverslips 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>clear nail polish</td><td>Local drug store</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>cardboard slide folder</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>plastic slide box</td><td>Fisher</td><td>03-448-10</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr></tbody></table>

whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스) 그림 1에 제시된 키 해부 단계, 석회화이다 인공 조직에서 같이 코르티 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 개발의 첫 번째 출생 후 주의 석회화 중 마우스 달팽이관이 불완전하고 더 간단한 박리 법 (13)을 사용할 수있다. 코르티 기관의 P7에서 달팽이관과 눈물의 오래된 마우스 결과와 분쇄와 신생아 ...

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Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

54.9K 조회수.  Southern Illinois University, School of Medicine.  우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다. 

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Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of this cellular mosaic often requires that the organ of Corti is cross-sectioned. In particular, the nonsensory pillar and Deiters' cells, whose nuclei are located basally with respect to the hair cells, cannot be visualized without cross-sectioning the organ of Corti. However, the delicate cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, including the fine cytoplasmic processes of the pillar and Deiters' cells, is difficult to preserve by routine histological procedures such as paraffin and cryo-sectioning, which are compatible with standard immunohistochemical staining techniques.
Here I describe a simple and robust procedure consisting of vibratome sectioning of the cochlea, immunohistochemical staining of these vibratome sections in whole mount, followed by confocal microscopy. This procedure has been used widely for immunhistochemical analysis of multiple organs, including the mouse limb bud, zebrafish gut, liver, pancreas, and heart (see 3-6 for selected examples). In addition, this procedure was sucessful for both imaging and quantitificaton of pillar cell number in mutant and control organs of Corti in both embryos and adult mice 7. This method, however, is currently not widely used to examine the mammalian organ of Corti. The potential for this procedure to both provide enhanced preservation of the fine cytoarchitecture of the adult organ of Corti and allow for quantification of various cell types is described.

A simple procedure of vibratome sectioning the organ of Corti, followed by immunohistochemistry and confocal microscopy is described. This procedure allows for improved preservation of the fine cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, and consequently allows for accurate quantification of cell types.

Vibratome는 Corti의 포유 동물 조직의 Cytoarchitecture의 향상된 보존을위한 Sectioning

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

연구

신경과학

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching morphogenesis and patterning, as well as immune cell distribution at a cellular level. The analysis of peripheral nerve and blood vessel anatomical structures in adult tissues provides some insights into the understanding of functional neuro-vascular wiring and neuro-vascular degeneration in pathological conditions such as wound healing. As a highly informative model system, we have focused our studies on adult ear skin, which is readily accessible for dissection. Our simple and reproducible protocol provides an accurate depiction of the cellular components in the entire skin, such as peripheral nerves (sensory axons, sympathetic axons, and Schwann cells), blood vessels (endothelial cells and vascular smooth muscle cells), and inflammatory cells. We believe this protocol will pave the way to investigate morphological abnormalities in peripheral nerves and blood vessels as well as the inflammation in the adult ear skin under different pathological conditions.

Here, we describe a high resolution whole-mount imaging method in the entire adult mouse ear skin, which enables us to visualize branching morphogenesis and patterning of peripheral nerves and blood vessels, as well as immune cell distribution.

성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 Confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 Morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

발생학

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

의학

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

냉동 절제 및 면역 염색 마우스 내이 조직: 배아에서 성체 단계까지

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The most common method for detecting the loss of ribbon synapses is immunolabeling because it allows for quantitative sampling from several tonotopic locations in an individual cochlea. However, the structures of interest are buried deep inside the bony cochlea. Gerbils are used as an animal model for age-related hearing loss. Here, routine protocols for fixation, immunolabeling gerbil cochlear whole mounts, confocal imaging, and quantifying ribbon synapse numbers and volumes are described. Furthermore, the particular challenges associated with obtaining good material from valuable aging individuals are highlighted. 
Gerbils are euthanized and either perfused cardiovascularly, or their tympanic bullae are carefully dissected out of the skull. The cochleae are opened at the apex and base and directly transferred to the fixative. Irrespective of the initial method, the cochleae are postfixed and subsequently decalcified. The tissue is then labeled with primary antibodies against pre- and postsynaptic structures and hair cells. Next, the cochleae are incubated with secondary fluorescence-tagged antibodies that are specific against their respective primary ones. The cochleae of aged gerbils are then treated with an autofluorescence quencher to reduce the typically substantial background fluorescence of older animals' tissues. 
Finally, cochleae are dissected into 6-11 segments. The entire cochlear length is reconstructed such that specific cochlear locations can be reliably determined between individuals. Confocal image stacks, acquired sequentially, help visualize hair cells and synapses at the chosen locations. The confocal stacks are deconvolved, and the synapses are either counted manually using ImageJ, or more extensive quantification of synaptic structures is carried out with image analysis procedures custom-written in Matlab.

A protocol for processing young adult and aged gerbil cochleae by immunolabeling the afferent synaptic structures and hair cells, quenching autofluorescence in aged tissue, dissecting and estimating the length of the cochleae, and quantifying the synapses in image stacks obtained with confocal imaging is presented.

젊은 성인과 노인 Gerbil Cochleae의 면역 표지 및 카운팅 리본 시냅스

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

광시트 형광 현미경을 이용한 노화된 달팽이관 이미징

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage

An animal model of noise-induced hearing loss (NIHL) is useful for pathologists, therapists, pharmacologists, and hearing researchers to thoroughly understand the mechanism of NIHL, and subsequently optimize the corresponding treatment strategies. This study aims to create an improved protocol for developing a mouse model of NIHL. Male C57BL/6J mice were used in this study. Unanesthetized mice were exposed to loud noises (1 and 6 kHz, presented simultaneously at 115-125 dB SPL-A) continuously for 6 h per day for 5 consecutive days. Auditory function was assessed 1 day and 1 week after noise exposure, using auditory brainstem response (ABR). After the ABR measurement, the mice were sacrificed, and their organs of Corti were collected for immunofluorescence staining. From the auditory brainstem response (ABR) measurements, significant hearing loss was observed 1 day after noise exposure. After 1 week, the hearing thresholds of the experimental mice decreased to ~80 dB SPL, which was still a significantly higher level than the control mice (~40 dB SPL). From the results of immunofluorescence imaging, outer hair cells (OHCs) were shown to be damaged. In summary, we created a model of NIHL using male C57BL/6J mice. A new and simple device for generating and delivering pure-tone noise was developed and then employed. Quantitative measurements of hearing thresholds and morphological confirmation of OHC damage both demonstrated that the applied noise successfully induced an expected hearing loss.

Here, we present a protocol for a mouse model of noise-induced hearing loss (NIHL). To induce NIHL, we developed a new and simple device using corrugated plastic, a rat trap cage, and a speaker. Auditory brainstem response and immunofluorescence imaging were employed to assess the hearing function and outer hair cell damage, respectively.

생쥐의 소음성 난청에 대한 수정된 실험 조건 및 청력 기능 및 외부 유모 세포 손상 평가

An animal model of noise-induced hearing loss (NIHL) is useful for pathologists, therapists, pharmacologists, and hearing researchers to thoroughly ...