Name: directed differentiation of primitive and definitive hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2017-11-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
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이 작품은 부의 내과, 혈액 부, 워싱턴 대학의과 대학에 의해 지원 되었습니다. CD는 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소에서 T32HL007088에 의해 지원 되었다. CMS는 혈액학 학술 상을의 미국 사회에 의해 지원 되었다.

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	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations:+lessons+from+embryonic+development.">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li><li>Ditadi, A., Sturgeon, C. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo.">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li><li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+definitive+erythroid+lineage+with+unique+regulation+of+the+beta-globin+locus+in+the+mammalian+embryo.">A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo.</a> Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).</li><li>Palis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+emergence+of+high+proliferative+potential+hematopoietic+precursors+during+murine+embryogenesis.">Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).</li><li>Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+erythroid+and+myeloid+progenitors+in+the+yolk+sac+and+embryo+proper+of+the+mouse.">Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse.</a> Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).</li><li>Boiers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphomyeloid+contribution+of+an+immune-restricted+progenitor+emerging+prior+to+definitive+hematopoietic+stem+cells.">Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development.">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li><li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+Notch1+distinguishes+2+phases+of+definitive+hematopoiesis+during+development.">A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development.</a> Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).</li><li>Kumano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+but+not+Notch2+is+essential+for+generating+hematopoietic+stem+cells+from+endothelial+cells.">Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells.</a> Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).</li><li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system:+advances+and+questions.">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).</li><li>Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBPjkappa-dependent+Notch+function+regulates+Gata2+and+is+essential+for+the+formation+of+intra-embryonic+hematopoietic+cells.">RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells.</a> Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).</li><li>Chadwick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+BMP-4+promote+hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Blood. 102 (3), 906-915 (2003).</li><li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+GFP+reporter+gene+to+the+MIXL1+locus+of+human+embryonic+stem+cells+identifies+human+primitive+streak-like+cells+and+enables+isolation+of+primitive+hematopoietic+precursors.">Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors.</a> Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).</li><li>Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+on+stromal+cells+derived+from+hematopoietic+niches.">Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).</li><li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primitive+streak+gene+Mixl1+is+required+for+efficient+haematopoiesis+and+BMP4-induced+ventral+mesoderm+patterning+in+differentiating+ES+cells.">The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells.</a> Development. 132 (5), 873-884 (2005).</li><li>Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+in+serum-free+medium+reveals+distinct+roles+for+bone+morphogenetic+protein+4,+vascular+endothelial+growth+factor,+stem+cell+factor,+and+fibroblast+growth+factor+2+in+hematopoiesis.">Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis.</a> Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).</li><li>Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+CD34++cells:+efficient+production+in+the+coculture+with+OP9+stromal+cells+and+analysis+of+lymphohematopoietic+potential.">Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential.</a> Blood. 105 (2), 617-626 (2005).</li><li>Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukosialin+(CD43)+defines+hematopoietic+progenitors+in+human+embryonic+stem+cell+differentiation+cultures.">Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures.</a> Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).</li><li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+enhances+the+generation+of+hematopoietic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cell-derived+hemato-vascular+precursors.">Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors.</a> Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).</li><li>Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+progresses+through+sequential+hematoendothelial,+primitive,+and+definitive+stages+resembling+human+yolk+sac+development.">Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development.</a> Blood. 106 (3), 860-870 (2005).</li><li>Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Controls+the+Specification+of+Definitive+and+Primitive+Hematopoiesis+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).</li><li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+hemogenic+endothelial+progenitor+and+its+direct+precursor+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).</li><li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Definitive+Haemogenic+Endothelium+and+Arterial+Vascular+Endothelium+Represent+Distinct+Lineages.">Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages.</a> Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).</li><li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryo+fibroblast+(MEF)+feeder+cell+preparation.">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, (2001).</li><li>La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T-cell+development+from+human+cord+blood+hematopoietic+stem+cells+by+Delta-like+1+in+vitro.">Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro.</a> Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).</li><li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro.">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).</li><li>Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OP9-DL1+system:+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).</li><li>Polychronopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+synthesis+of+indirubins+as+potent+and+selective+inhibitors+of+glycogen+synthase+kinase-3+and+cyclin-dependent+kinases.">Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases.</a> J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+disruption+of+Wnt-dependent+signaling+in+tissue+regeneration+and+cancer.">Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.</a> Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).</li><li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. , (2017).</li><li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells.">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li><li>Peschle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic----Fetal+Hb+switch+in+humans:+studies+on+erythroid+bursts+generated+by+embryonic+progenitors+from+yolk+sac+and+liver.">Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 프로토콜 기본 또는 최종 조 혈 창시자의 분화에 대 한 빠른, 혈 청, 기질-없는 방법을 설명합니다. 기본 또는 최종 조 혈 창시자의 mesodermal 규격은 유일 하 게 정식 WNT 신호 전달의 분자 억제제를 이용 하는 우리의 프로토콜을 사용 하 여 안정적으로 얻을 수 있습니다. 반면 PORCN 억제제 IWP234 에 의해 WNT 억제 지정 원시 조 혈 mesoderm26단계 관련 WNT 활성화 GSK3β 억제제 CHIR9902133 에 의해 확실 한 조 혈 mesoderm 상승을 제공 합니다. 메모의이 방법은 튼튼하게 주지 않는다 상승 engraftable HSC 같은 인구 (표시 되지 않음). 그러나,이 방식으로 생성 하는 확실 한 조 혈 창시자는 그들의 잠재적인 미래에 변환 응용 프로그램을 강조 transgene 유도 engraftment 잠재적인35, 의무가 있습니다.
성공적인 hPSC 차별화 하는 중요 한 결정은 hPSCs에서 형성 되는 EBs의 초기 크기. EBs 주위 해야 이상적으로, 6-10 셀 크기에. Aberrantly 차별 문화는 EBs는 EB에서 부적 절 한 신호 활성화 때문에 아마도 너무 큰 경우 두 프로그램 전부의 혼합물을 지정할 수 있습니다. 차별화 문화 차별화의 첫 24 시간 내 최적의 EB 크기에 대 한 시각적으로 검열 되어야 한다. 또는,에서 hPSCs는 완전히 단일 셀에 연결 되어 있지 않으면는 hPSCs 대신 anoikis 세포 죽음36을 가난한 조 혈 차별화 인을 받 다.
IWP2 일 2와 3이 분화 프로토콜의 mesodermal 사양 중 사용 하는 경우 성공적인 차별화 독점적으로 원시 조 혈 창시자 상승을 줄 것 이다. 차별화의 날 8 일, 뚜렷한 CD34의 IWP2에서 파생 된 문화를 구성+CD43−, CD34중간/낮은 CD43+, 그리고 CD34−CD43+ 인구 (그림 2A). CD34중간/낮은 CD43+ 인구 생겨나게 기본 erythroid 및 골수성 창시자; CD34 동안−CD43+ 인구 주로 생겨나게 제한 골수성 잠재적인18로 erythroid 창시자. 원시 조 혈 잠재력 EryP CFC (6 절)는 것 주로 태아 HBG26에 비해 배아 globin HBE 표현의 존재에 대 한 스 분석 결과 의해 확인 될 수 있다 28,37. CD43 마찬가지로, 존재+ 원시 조 혈 창시자18,,2326의 존재를 나타내기 위해이 단계에서 조 혈 창시자를 안정적으로 사용할 수 있습니다. CD43 식 원시 조 혈 프로그램18,,2326의 창시자를 독점 하지 않습니다 및 기본 조 혈을 평가 하기 위해 통계를 단독으로 사용할 수 없습니다 주목 해야한다 잠재적인, immunophenotype와 인간 노치 의존으로 EMP 남아 있다 새롭거나 (3에서 검토).
2와 차별화의 3 일 동안 mesodermal 패턴화 하는 동안 CHIR99021를 사용 하는 경우 독점적으로 확실 한 조 혈 창시자 인구 지정 됩니다. 분화 프로토콜의 날 8 일에 독특한 CD34의 CHIR99021에서 파생 된 문화를 구성+거의 아무 CD43 식26CD43− 인구. CD34+CD43− 인구는 조 혈, 정 맥, 그리고 동맥 잠재력과 구분 될 수 있는 그 셀 두 의 표현 부족 CD73 CD184 식에 따라 내 피 세포의 이종 인구 27,28. CD34을 보장할 때 확실 한 그는 격리 수준의 종속 내 피-하-조 혈을 받은 후 전환 (5)28 +CD45+ 조 혈 창시자 BFU-E 및 골수성 세포 증가 줄 것 이다 스, 하지만 하지 EryP CFC26,28 (그림 2). BFU E 식민지를 격리 하 고는 지 주로 표현 배아 HBE (표시 되지 않음)26,28, 에 비해 태아 globin HBG globin 분석에 대 한 평가 수 또한, 37. 림프 잠재력을 직접 평가 될 수 있다 반대로,에서 고립 된 그는, 노치 종속 내 피-하-조 혈 전환 OP9 DL4 기질18,,2628에서 발생. 그는이 방법으로 지정 된 확실 한 erythro-myelo-림프 창시자를는 클론 레벨28, 기능적으로 EMP 또는 LMPP 창시자3의 우리의 현재 이해에서 구별에서 포함 되어 있습니다. 같은 T 림프 HBG의 존재-erythroid 잠재적인, EryP CFC 잠재력의 부재와 결합 하 여 표현 안정적으로 hPSCs에서 확실 한 조 혈 명세를 나타내는 데 사용할 수 있습니다. 메모, 전적으로 HBG을 야기할 수 있는 창시자에 대 한 평가의-확실 한 잠재력으로, 위에서 설명한, 인간의 EMP와 신호 요구 사항이 유사한 정확 하 게 결정 하지 않을 수 있습니다, 하지 않은 erythroblasts을 표현 특징-날짜 (참조3에서 검토).
이 간단한 차별화 전략은 매우 강력한 독점적으로 원시의 생성 또는 독점적으로 확실 한 조 혈 창시자, 질병 환자 파생 Ipsc에서 두 프로그램의 비교 연구를 모델링을 활성화에 대 한 수 또는 유전자 수정 hPSCs입니다. 마찬가지로, 인간의 발달 과정 수 수 심문, 어떤 추가적인 신호 pathway(s)는 자기 갱신 용량, 그리고 확실 한 조 혈 창시자에서 따라서 HSC 같은 잠재력을 부여 하는 데 필요한 발견 등.
요약 하자면, WNT 조작 hPSCs mesodermal 패턴화 하는 동안 지정 기본 CD43+ 또는 최종 CD34+CD45+ 절연 hPSC 파생 조를 공부 하는 데 사용 될 수 있는 조 혈 창시자.

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs) 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 포괄로 정의 되 고 적절 한 성장 조건 하에서 자기 갱신을 받은 뿐만 아니라의 독특한 능력을가지고 또한, 모든 세포 유형으로 분화 하는 능력 3 개의 세균 층에서 파생 하는 그러나: endoderm, mesoderm, ectoderm1. 이러한 독특한 능력으로 인해 hPSCs 재생 의학, 질병, 모델링과 세포 기반 요법2에 대 한 큰 약속을 잡으십시오. 여러 셀 형식 hPSCs에서 성공적으로 분화 되어 있다, 하는 동안 한 가지 중요 한 문제는 독점적으로 성인 같은 hPSC 파생 된 조 혈 줄기 세포 (HSCs)와 최종 조 혈 창시자의 생체 외에서 사양입니다.
HPSCs에서 인간의 HSCs의 발전에 하나의 가능성이 장벽이 인간 배아3내에서 여러 조 혈 프로그램의 존재입니다. 나온다, "원시 조," 불리는 첫 번째 프로그램 extraembryonic 노 른 자 삭 조직에서 유래 하 고 erythroblast 창시자 (EryP-CFC), macrophages, 및 없으며 일시적 생산 최고의 특징 이다. 특히,이 프로그램은 HSCs, 상승 수 주지도 않습니다 그것을 일으키 다 T와 B 림프 창시자. 그러나, 노 른 자 삭은 뚜렷이 일으키 erythro 골수성 조상 (EMP4,5,6,,78) 같은 제한 된 확실 한 조 혈 창시자 그리고 erythroid 불충분 한 림프 액 multipotent 조상 (LMPP9). 그러나, EMPs도 LMPPs는 완전히 multipotent 또는 HSC 같은 engraftment 성인 받는 사람의 수입니다. 대조적으로, 나중에 개발, 고아 하 게 정의 된 "확실 한" 조 혈 모 프로그램은 HSC를 포함 하 여 모든 성인 조 혈 계보를 야 기한 적절 한 태아의 대동맥-생식-mesonephros 지역에 지정 됩니다. Hemogenic (그가) 내 피3,10,11에서에서 내 피-하-조 혈 전환을 통해 노치 종속 패션에서 발생 하는이 내 배아 확실 한 조 혈 모 세포의 사양 ,12,,1314. 재구성 능력, 외 잠재적인 multilineage 및 이러한 셀의 노치 의존을 사용할 수 있는 EMP (검토 참조3,13 LMPP에서 이러한 확실 한 조 혈 창시자를 구별 ).
에 따라 장치를 마더보드에 hPSCs에서 원시적이 고 확실 한 조 혈 사양 관리를 이해 하는 것입니다 가능성이 확실 한 조 혈 창시자 hPSC 라인의 다양 한 걸쳐의 재현 생산에 중요 한. 최근까지 multipotent 원시적이 고 확실 한 조 혈 창시자 분리 수 hPSC 차별화 프로토콜15,,1617,18, 존재 하지 않았다 19,20,21,22,23,,2425. 먼저 소 태아 혈 청 (FBS) 및 실질 공동 문화를 사용 하 여 많은 접근 원시적이 고 확실 한 조 혈 잠재적인15,16의 혼합물으로 hPSC 차별화의 조 혈 잠재력 설명 17,,1922,,2325. 더 많은 조 혈 혈 청 무료 프로토콜 항구 조 혈 잠재적인18,20,21, hPSCs에서 mesoderm의 사양에 대 한 신호 요구 사항 설명 그러나 24., 이러한 방법은 여전히 두 프로그램 전부의 다른 유형의 혼합물을 상승 했다, 임상 응용 및 이해 발달 메커니즘에 그들의 사용 제한 될 수 있습니다.
우리는 최근 ACTIVIN/NODAL 및 WNT 신호 hPSC 파생 mesoderm18,26에서에서 원시적이 고 확실 한 조 혈 사양에 대 한 단계-특정 신호 요구 사항을 설명 하는 데 이러한 연구에 내장 . 후자 이었다 특히 독특한 무대 관련 WNT 신호 조작의 그것의 사용 중 독점적으로 기본 또는 독점적으로 확실 한 조 혈 창시자26의 사양에 대 한 수 있습니다. Mesoderm 사양 중 정식 WNT 신호 IWP2 PORCN 억제제와 억제 CD43 지정에 결과+ EryP CFC 및 감지 림프 잠재력과 골수성 창시자. 예리한 대조에서는, 정식 WNT 신호 GSK3β 억제 물, CHIR99021와 차별화의 동일한 단계에서의 자극 감지 CD43의 완전 한 부재에 결과+ EryP-CFC, 동시에 선도 하는 동안에 CD34의 사양+CD43− 그. 이 인구 보유 골수성, HBG-erythroid, 및 T-림프 잠재력을 표현. 이후 분석 CD7327,28 와 CD18428, 그리고 조 혈 잠재력의 표현 부족으로 그는 노치 종속28이 확인. 추가, 단일 셀 클론 분석 이러한 확실 한 조 혈 모 계보 multipotent 단일 셀28에서 파생 될 수 있는 시연 했다. 함께 찍은, 이러한 연구 단계 관련 WNT 신호 조작 순수 원시 조 혈 창시자, 또는 multipotent 노치 종속 확실 한 조 혈 창시자 지정할 수 나타냅니다.
여기, 우리는 그 독점적으로 기본 또는 최종 조 혈 창시자, 정식 WNT mesodermal 패턴, 그리고 그들의 다운스트림 조 혈 계보 중 신호 분석 실험의 조작을 통해 수익률 차별화 전략 개요. 이 프로토콜은 hPSCs 재생 의학 응용 프로그램에서 기본 또는 최종 조 혈 창시자의 생산에 관심이 수사에 큰 가치입니다.

<table><tbody><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMD)</td><td>Corning</td><td>10-016</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM solution</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin, porcine skin, Type A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Corning</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>Knock-out serum replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>&quot;KOSR&quot;</td></tr><tr><td>Non-essential amino acids (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoethanol, 55 mM solution</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Fraction V, Bovine Serum Albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Ham&#039;s F12</td><td>Corning</td><td>10-080</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement, no vitamin A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34 (SP34)</td><td>Life Technologies</td><td>10639011</td><td>&quot;SP34&quot;</td></tr><tr><td>Growth factor reduced Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>&quot;MAT&quot;</td></tr><tr><td>L-absorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Human serum transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol (MTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Roche</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Life Technologies</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>255-SC</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>291-G1</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>206-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>207-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-11</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>218-1L</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>288-TP</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td></td></tr><tr><td>Flt-3 ligand (FLT3-L)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>308-FK</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>IWP2</td><td>Tocris</td><td>3533</td><td></td></tr><tr><td>Angiotensin II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525</td><td></td></tr><tr><td>Losartan Potassium</td><td>Tocris</td><td>3798</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4</td><td>BD Biosciences</td><td>560650</td><td>Dilution 1:100; T cell assay</td></tr><tr><td>CD8 PE Clone RPA-T8</td><td>BD Biosciences</td><td>561950</td><td>Dilution 1:10; T cell assay</td></tr><tr><td>CD34 APC Clone 8G12</td><td>BD Biosciences</td><td>340441</td><td>Dilution 1:100; EHT assay</td></tr><tr><td>CD34 PE-Cy7 Clone 8G12</td><td>BD Biosciences</td><td>348801</td><td>Dilution 1:100; Hemogenic endothelium</td></tr><tr><td>CD43 FITC Clone 1G10</td><td>BD Biosciences</td><td>555475</td><td>Dilution 1:10; Hemogenic endothelium</td></tr><tr><td>CD45 APC-Cy7 Clone 2D1</td><td>BD Biosciences</td><td>557833</td><td>Dilution 1:50; T cell assay</td></tr><tr><td>CD45 eFluor450 Clone 2D1</td><td>BD Biosciences</td><td>642284</td><td>Dilution 1:50; EHT assay</td></tr><tr><td>CD56 APC Clone B159</td><td>BD Biosciences</td><td>555518</td><td>Dilution 1:20; T cell assay</td></tr><tr><td>CD73 PE Clone AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>550257</td><td>Dilution 1:50; Hemogenic endothelium</td></tr><tr><td>CD184 APC Clone 12G5</td><td>BD Biosciences</td><td>555976</td><td>Dilution 1:50; Hemogenic endothelium</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td>Dilution 1:10,000; T cell assay</td></tr><tr><td>OP9 DL4 cells</td><td></td><td></td><td>Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156</td></tr><tr><td>MethoCult H4034</td><td>Stemcell Technologies</td><td>4034</td><td>&quot;MeC&quot;</td></tr><tr><td>Milli-Q water purification system</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO2 incubator</td><td></td><td></td><td>Set at 37 C</td></tr><tr><td>Multigas incubator</td><td></td><td></td><td>Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2</td></tr><tr><td>6 well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24 well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>6 well low-adherence tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>24 well low-adherence tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>35 mm tissue culture dishes</td><td>Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Blunt-end needle, 16 gauge</td><td>Corning</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>3 cc syringes</td><td>Corning</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polypropylene test tube</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polystyrene test tube</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>15 mL polypropylene conical</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 mL polypropylene conical</td><td>Corning</td><td>430921</td><td></td></tr><tr><td>2 mL serological pipette</td><td>Corning</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>5 mL serological pipette</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serological pipette</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serological pipette</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Cell scrapers</td><td>Corning</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL cryovials</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>5 mL test tube with 40 &amp;micro;M cell strainer</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;M cell strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biosafety hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS AriaII or equivalent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRii or equivalent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td></td><td></td><td>Set at 37 C</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;M filtration system</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 C refrigerator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 C Freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 C Freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

directed differentiation of primitive and definitive hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells

재생 의학에 대 한 주요 목표 중 하나입니다 생성 및 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)에서 파생 된 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 유지 보수. 최근까지, HSCs로 hPSCs를 차별화 하는 노력 있다 주로 HSC 잠재력, 부족 하 고 대신 노 른 자 삭 조를 닮은 창시자 조 혈을 생성 하 게 됩니다. 이 결과 조 혈 창시자 다양 한 성인 조 혈 장애, 림프 성 계보의 특히 그의 질병 모델링 생체 외에서 유틸리티를 제한 수 있습니다. 그러나, 우리는 최근 우리 여기 개요 무대 관련 감독된 분화 프로토콜을 사용 하는 hPSCs에서 erythro-myelo-림프 multilineage 확실 한 조 혈 창시자를 생성 하는 방법을 설명 했습니다. 매트릭스-코팅 plasticware 지하실 멤브레인에 hPSCs의 효소 분리 통해 embryoid 몸 (EBs)이 형성 된다. EBs는 재조합 BMP4, 이후 GSK3β 억제 물, CHIR99021 확실 한 조 혈 모 프로그램에 지정 된 의해 mesoderm로 구분 됩니다. 또는, 기본 조 PORCN 억제 물, IWP2에 의해 지정 됩니다. 더 조는 재조합 VEGF의 추가 지원 조 혈 cytokines를 통해 구동 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여 생성 결과 조 혈 창시자 질병 및 발달 모델링, 생체 외에서사용 될 가능성이 있다.

HPSCs에서 원시적이 고 확실 한 조 혈 창시자의 유도 묘사한 회로도 그림 1에서 그림입니다. Mesoderm 정식 WNT 차별화, 조 혈 原 사양에 따라 2-3 일 동안 발생 하는 신호에 의해 패턴.
대표적인 흐름 cytometric 분석 및 스 분석 실험 조 혈 차별화 hPSC 파생 된 문화를 형성 하는 식민지는 그림 2에 표시 됩니다. IWP2 대우 차별화 문화 고유 CD34 보장할+CD43− 와 CD34낮은 /−CD43+ 인구, 그러나 CHIR 처리 차별화 문화 해야한다 &#60; 1 %CD43+ 세포의 8 일 분화 (그림 2AB)26. CHIR 대우 문화 연합사 크게 없는 것 IWP2 조건 하루 9에 고립 된에서 파생 된 원시 조 혈 창시자 주로 기본 erythroid (EryP-CFC) 및 골수성 창시자 스 분석에 상승을 줄 것 이다 (그림 2CF)이이 단계에서 가능성이 있습니다. 대신,는 CD34+CD43 CHIR99021 치료에서 파생 하는- 인구는 이질적인 인구, 포함 된 내 피 창시자, CD34+CD43-CD73-CD184- 그가 ( 그림 2B) 때 FACS에 의해 분리, 처음 다음 라운드, refractile 비 부착 결과 내 피-하-조 혈 변화를 겪 습 (2D 그림, 왼쪽된 패널), 내 피 같은 세포의 단층을 형성 합니다 조 혈 모 세포 (그림 2D, 오른쪽 패널). 이 조 혈 모 세포 CD34, CD45 표현 위한 cytometry에 의해 평가 될 수 있다 (그림 2E). EHT 분석에서 고립 된 조 혈 창시자 스 분석 실험에 사용할 수 있으며 큰 버스트와 같은 erythroid 콜로 니 형성 단위 (BFU-E), 작은 erythroid 콜로 니 형성 단위 (CFU-E), 및 골수성 창시자 (CFU-M;을 그림 2 층)입니다.
그림 3 은 CHIR99021에서 파생 된 CD34에서 잠재적인 T-림프 구 분석 실험의 대표적인 흐름 cytometric 분석 묘사+CD43−CD73−CD184− 조 혈 창시자 (그림 3A) IWP2 파생 (그림 3B) CD34+CD43− 조 혈 창시자, OP9 DL4 공동 문화 21 일을 다음. 존재는 CD45의+CD56−CD4+CD8+ CHIR 파생 창시자 인구는 입력된 CD34 내 확실 한 조 혈 잠재력+ 인구. CD34+ 그리고 CD43+ IWP2 파생 차별점에서 격리 하는 창시자 주지 않으면 상승 T-세포를 이러한 분화 조건18,26에서이 분석 결과에.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55196/55196fig1.jpg"> 
그림 1: 고 원시 조 혈 창시자의 사양에 대 한 프로토콜의 회로도. 주요 실험 단계 및 일정 하 고 원시 조 혈 창시자 EBs에서 차별화의 묘사 EBs는 날 0 매트 코팅 plasticware에 hPSCs에서 생성 됩니다. EBs는 BMP4 멀티 가스 인큐베이터에 들어 있는 SFD 미디어에서 재배 됩니다. 차별화의 주 1, 문화 미디어 BMP4와 bFGF 보충으로 먹인 다. 주 2, 미디어 변화 WNT 조작 원시 조 혈 창시자에 대 한 확실 한 조 혈 창시자 및 IWP2 CHIR99021 (CHIR)의 추가 통해 발생합니다. 하루 3, SP34, VEGF와 bFGF 보충 미디어 변경 됩니다. 하루 6, 문화 미디어 조 혈 cytokines와 보완으로 먹인 다. 원시 조 혈의 날 8 일, 미디어를 변경 하 고 셀 시 조 조 혈 모 세포 (HPC) 분석 결과 다음 24 h에 대 한 5% CO2 배양 기에 이동 됩니다. 확실 한 조 혈 사양, CD34의 8 일+CD43-CD73-CD184- 셀 FACS에 의해 격리 되며 확실 한 hemogenic 내 피 잠재력, 또는 T-림프 잠재력 (묘사 되지)에 대 한 분석. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55196/55196fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55196/55196fig2.jpg"> 
그림 2: 차별화 문화와 원시 조 혈 창시자의 세대 분석. (A) IWP2 치료 8 일 EBs에서 원시 조 혈 창시자의 대표적인 흐름 cytometric 분석. (B) CHIR99021 치료 8 일 EBs에서 대표적인 흐름 cytometric 분석. Hemogenic 내 피 (그)를 식별 및는 CD34로 고립 된 수+CD43-CD73-CD184- 인구. (C)에서 IWP2-CHIR99021-하루 9 조 혈 창시자의 식민지 형성 잠재력 (CHIR) 치료 차별화 문화. n = 3, 오차 막대를 나타내는 뜻의 SD, 별표 표시 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 통계적 의미 * * * p &#60; 0.0001. 그 4 일 후 (왼쪽) 또는 7 + (오른쪽)의 일에 매트 코팅 plasticware 성장 세포를 절연 (D) 대표 사진. 원래 확대, 100 X입니다. 바 규모 = 100 µ m. (E) 대표 cytometry 문화의 9 일 후 확실 한 조 혈 창시자에서 CD34, CD45 식의. (F) 대표 사진 EryP CFC (왼쪽), CFU-M (중간), BFU-E 및 CFU-E (오른쪽)의 형태를 보여주는. 원래 확대, 40 X입니다. 바 규모 = 100 µ m 화살표 식민지 라는 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55196/55196fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55196/55196fig3.jpg"> 
그림 3: 확실 한 조 혈 잠재력의 분석. CHIR에서 파생 된 CD34의 T 림프 구 잠재력의 대표적인 흐름 cytometric 분석+CD43−CD73−CD184− 조 혈 창시자 (A) 또는 (B) CD34 IWP2 파생 된+CD43 − 조 혈 창시자, OP9 DL4 셀과 공동 문화 후 28 일 샘플에서 T-림프 구 잠재력 CD45 100 이상의 경우 긍정적인 것으로 간주 됩니다+ 이벤트 감지. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55196/55196fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-p border="1" fo:keep-together.within-page="1"></table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-p>나이 "항상" = ><tbody>
		<tr>
			<td>SFD 미디어</td>
			<td>하루 0</td>
			<td>주 1</td>
			<td>주 2 확실 한</td>
			<td>주 2 기본</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>10 ng/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>-</td>
			<td>10 ng/mL</td>
			<td>5 ng/mL</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3 Μ M</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP2</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3 Μ M</td>
		</tr>
	</tbody>

표 1: SFD 기반 미디어 일 0 - 2.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SP34 미디어</td>
			<td>3 일</td>
			<td>주 6</td>
			<td>8 일</td>
			<td>그는</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>15 ng/mL</td>
			<td>15 ng/mL</td>
			<td>-</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>5 ng/mL</td>
			<td>5 ng/mL</td>
			<td>-</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>-</td>
			<td>200 ng/mL</td>
			<td>100 ng/mL</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPO</td>
			<td>-</td>
			<td>4 IU</td>
			<td>2 IU</td>
			<td>2 IU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>일리노이-6</td>
			<td>-</td>
			<td>20 ng/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-11</td>
			<td>-</td>
			<td>10 ng/mL</td>
			<td>5 ng/mL</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>-</td>
			<td>50 ng/mL</td>
			<td>25 ng/mL</td>
			<td>25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>30 ng/mL</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt-3 L</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 ng/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-3</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>30 ng/mL</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>쉬이 잇</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 µ g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Losartan 칼륨</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>100 Μ M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 일 3 SP34에 기초를 둔 미디어 - 8, 그는.

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Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.9K 조회수.  Washington University in St. Louis. 여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

비디오: Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro is essential for mechanistic studies of the endothelial-hematopoietic transition and hematopoietic specification. Here, we describe a method for the efficient induction of HE from human pluripotent stem cells (hPSCs) by way of overexpression of different sets of transcription factors. The combination of ETV2 and GATA1 or GATA2 TFs is used to induce HE with pan-myeloid potential, while a combination of GATA2 and TAL1 transcription factors allows for the production of HE with erythroid and megakaryocytic potential. The addition of LMO2 to GATA2 and TAL1 combination substantially accelerates differentiation and increases erythroid and megakaryocytic cells production. This method provides an efficient and rapid means of HE induction from hPSCs and allows for the observation of the endothelial-hematopoietic transition in a culture dish. The protocol includes hPSCs transduction procedures and post-transduction analysis of HE and blood progenitors.

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

연구

발생학

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

면역학 및 감염병학

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine induced differentiation of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineage cells. CD34+ cells are isolated from human umbilical cord blood and co-cultured with MS-5 stromal cells in the presence of cytokines. Immunophenotypic characterization of the stem and progenitor cells, and the differentiated myeloid lineage cells are described. Using this protocol, CD34+ cells may be incubated with small molecules or transduced with lentiviruses to express myeloid disease mutations to investigate their impact on myeloid differentiation.

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Here, we present a protocol for immunophenotypic characterization and cytokine induced differentiation of cord blood derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineages. The applications of this protocol include investigations on the effect of myeloid disease mutations or small molecules on myeloid differentiation of the CD34+ cells.

인간 코드 혈액 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 범골수성 분화

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

신경과학

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial cells, which line blood vessel lumens, from human pluripotent stem cells is crucial for a multitude of tissue engineering and regeneration applications. In vivo, primordial endothelial cells are derived from the mesodermal lineage and are specified toward specific subtypes, including arterial, venous, capillary, hemogenic, and lymphatic. Hemogenic endothelial cells are of particular interest because, during development, they give rise to hematopoietic stem and progenitor cells, which then generate all blood lineages throughout life. Thus, creating a system to generate hemogenic endothelial cells in vitro would provide an opportunity to study endothelial-to-hematopoietic transition, and may lead to ex vivo production of human blood products and reduced reliance on human donors. While several protocols exist for the derivation of progenitor and primordial endothelial cells, generation of well-characterized hemogenic endothelial cells from human stem cells has not been described. Here, a method for the derivation of hemogenic endothelial cells from human embryonic stem cells in approximately 1 week is presented: a differentiation protocol with primitive streak cells formed in response to GSK3&#946; inhibitor (CHIR99021), then mesoderm lineage induction mediated by bFGF, followed by primordial endothelial cell development promoted by BMP4 and VEGF-A, and finally hemogenic endothelial cell specification induced by retinoic acid. This protocol yields a well-defined population of hemogenic endothelial cells that can be used to further understand their molecular regulation and endothelial-to-hematopoietic transition, which has the potential to be applied to downstream therapeutic applications.

Presented here is a simple protocol for the directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells in approximately 1 week.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파골세포의 분화 및 특성화

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...