이 프로토콜은 인간 CD34 양성 조혈 줄기 및 전구 세포의 정상적인 골수성 분화 중에 발생하는 분자 및 세포 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 메가카요세포, 적혈구, 과립구 및 단핵구를 포함한 4개의 골수성 계보를 모두 따라 CD34 양성 세포의 분화를 허용한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 의사 인 Aditi Bapat이 될 것입니다.
인간 탯줄 혈액 샘플에서 단핵 세포 절연을 위해, 생물학적 안전 캐비닛 내에서 멸균 250 밀리리터 플라스틱 병으로 가방 내용을 전송하기 전에 70 %에탄올로 탯줄 혈액 의 가방의 외부 표면을 살균. 상온 행크의 완충식식용액을 동일한 부로 혈액을 희석하고, 멸균 50 밀리리터 원판 튜브 5개 각각에 15밀리리터의 단일핵 세포 분수 배지를 추가합니다. 부드러운 혼합 후, 각 튜브의 단일 핵 분별 매체에 희석 된 탯줄 혈액의 30 밀리리터를 조심스럽게 부어 50 밀리리터 튜브를 각도로 유지하여 층을 혼합하지 않도록 돕습니다.
밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리하고, 단일핵 세포 층 위의 플라즈마의 상위 15 ~20 밀리리터를 제거한다. 파이펫을 사용하여 노출된 단핵 세포 층을 새로운 50밀리리터 튜브로 조심스럽게 이송하고, 단일핵 세포를 2~3개의 튜브로 모으고, 각 튜브의 최종 부피를 최대 50밀리리터에 냉간 PBE 버퍼로 가져오십시오. 원심분리에 의한 단일핵세포 샘플을 펠렛하고, 중신자를 흡인한다.
각 튜브를 부드럽게 탭하여 세포 펠릿을 풀고, 얼음 차가운 PBE 버퍼의 5 밀리리터에 펠릿을 희석시하십시오. 3~4개의 튜브에서 50밀리리터 원뿔관으로 세포를 결합하고, 나머지 세포를 수집하기 위해 5밀리리터의 신선한 PBE 버퍼로 모든 튜브를 세척합니다. 계산 후, 신선한 얼음 차가운 PBE 버퍼와 50 밀리리터까지 튜브에 최종 볼륨을 가지고, 원심 분리에 의해 세포를 수집.
CD34 양성 단핵 세포를 분리하기 위해, 다른 원심분리로 세포를 수집하기 전에 신선한 PBE 버퍼의 50 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 상체를 폐기한 후, 펠릿을 느슨하게 하기 위해 부드럽게 탭하고, 얼음 냉간 PBE 완충농도의 300마이크로리터당 8개의 단일핵세포에 10회 10회다시 중단한다. Fc 수용체 차단 시약 100 마이크로리터로 비특이적 결합을 차단한 다음, 부드럽게 혼합한 다음 자기 활성화 된 세포 분류 인간 CD34 마이크로비드 키트에서 CD34 마이크로 비드 100 마이크로 리터를 1회 10 회당 부드러운 혼합으로 8 세포에 추가하고 4 섭씨에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오.
세포가 배양하는 동안 LS 컬럼과 사전 분리 필터를 MACS 분리기 자기장에 배치합니다. 두 밀리리터의 얼음 차가운 PBE 버퍼와 버퍼 1밀리리터의 사전 분리 필터로 컬럼을 상화합니다. 컬럼을 15밀리리터 원추형 튜브로 비우고 흐름을 폐기합니다.
인큐베이션이 끝나면, 신선한 얼음 차가운 PBE 버퍼와 원심분리에 의한 퇴적물을 가진 15밀리리터까지 단일핵세포 샘플의 최종 부피를 가져온다. 얼음 차가운 PBE 버퍼의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 기둥의 사전 분리 필터에 셀을 로드합니다. 신선한 얼음 차가운 PBE 버퍼의 세 밀리리터로 튜브를 헹굴하고 사전 분리 필터에 버퍼를 추가합니다.
필터없이 세척당 얼음 차가운 PBE 버퍼 3 밀리리터를 추가하여 열을 4번 세척하여 각 세척 사이에 컬럼이 완전히 배수할 수 있도록 합니다. 마지막 세척 후, 새로운 15 밀리리터 튜브로 컬럼을 이동하고, 튜브에 열을 통해 신선한 얼음 차가운 PBE의 다섯 밀리리터를 급락. 새로 고립된 CD34 양성 조혈 줄기 및 전구 세포에서 줄기 및 선조 집단의 분획을 결정하기 위해, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 플로우 세포 분석 완충제 농도의 50 마이크로리터 당 6개의 세포에 10배로 펠릿을 다시 중단한다.
다음으로, 실험적인 흐름 세포측정 염색 프로토콜에 따라 5밀리리터 형광 활성화 세포 분류 튜브당 50마이크로리터 알리쿼트에서 세포를 이송한다. 적절한 항체 칵테일과 세포에 라이브/데드 스테인링을 추가하여 총 100마이크로리터로 볼륨을 조절합니다. 빛으로부터 보호되는 어둠 속에서 20분 후, 튜브당 신선한 유동 세포측정 버퍼 1밀리리터로 세포를 세척하고 튜브당 신선한 유동 세포분석 버퍼 500 마이크로리터로 세포를 다시 중단합니다.
그런 다음 표준 흐름 세포 측정 프로토콜에 따라 유동 세포계에서 세포를 분석합니다. 미생물절단의 CD34 양성 줄기 및 전구세포를 골수성 계보 세포로 분화하기 위해, 먼저 실온에서 PBS에서 2시간 동안 PBS에서 재조합 인간 섬유네틴 용액의 웰 당 200 마이크로리터로 코팅되지 않은 48웰 플레이트의 웰을 코팅한다. 인큐베이션의 끝에서, 각 우물에서 fibronectin 용액을 버리고 2 %의 소 세럼 알부민의 200 마이크로 리터로 우물을 차단합니다.
실온에서 30분 후, 세척당 멸균 PBS 500 마이크로리터로 우물을 두 번 세척하십시오. 새로 절연된 CD34 양성 세포를 따뜻한 자극 중간 농도의 밀리리터 당 5개의 세포로 5배 10회 다시 중단한다. 다음으로, 파터넥틴 단편 코팅 플레이트의 각 웰에 세포의 200 마이크로리터를 종자 200 마이크로리터와 48시간 동안 세포 배양 배양배인에 플레이트를 배치한다.
인큐베이션이 끝나면 부드러운 파이펫팅으로 세포를 수집하고, 500 마이크로리터의 데운 덜벡코의 수정된 이글 배지로 우물을 세척하여 세포 현탁액으로 세척합니다. 계산 후, 골수성 분화 중간 농도의 1 밀리리터 당 4개의 세포에 2.5배 10배의 세포를 다시 중단한다. MS-5 기질 세포에서 잘 당 CD34 양성 세포의 200 마이크로리터를 층 48 잘 조직 배양 플레이트.
그런 다음 3~4일마다 100마이크로리터의 신선한 2X 골수성 분화 배지로 각각 100마이크로리터를 부드럽게 교체하여 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다. 21일, 다만 입증된 바와 같이, 유동 세포측정에 의한 골수성 계보 마커 발현의 분석을 위해 세포를 수확한다. 80~90%의 면역페노티픽 분석으로 미생물 분리에 의해 코드혈액으로부터 분리된 총 CD34 양성세포의 전형적인 백분율은 이러한 CD34 양성 세포가 전형적으로 약 20%의 계보 음수 CD34 양성 CD38 음성 치백 줄기 세포 집단과 72%의 계면음성 음성 CD34 양성 CD38 양성 CD38 양성 CD38 양성 CD38 양성 CD38 양성 CD38 양성 CD38 양성체로 구성된것으로 나타났다.
다중 강력한 전구 세포 집단 내에서, 세포의 약 25%는 일반적인 골수성 전구 마커를 표현하고, 대략 15%는 과립세포 단두구 전구 마커, 및 대략 56%의 메가카요시테 에리스로이드 전조 마커를 표현한다. 면역페노티핑은 또한 CD34 양성 세포의 비율이 21일에 25% 미만으로 격리에서 약 90%에서 감소한다는 것을 보여줍니다. CD34 음성 집단의 분석은 성숙한 골수성 계보 마커를 표현하는 세포의 백분율에 있는 수반되는 상승을 보여줍니다.
또한, 라이트-지름사 스테인드 세포는 1일과 21일에 뚜렷한 형태학적 특성을 나타내며, 크고 둥근 핵과 아주 작은 세포질및 모노세포, 과립구 및 에리스로블라아스트를 포함하는 계보 세포의 형태학적 특성을 나타내는 분화배양과 함께 1일과 21일에 뚜렷한 형태학적 특성을 나타낸다. 희석된 장혈을 층을 혼합하지 않고 단핵 세포 분획 배지에 붓고, 배지를 변경할 때 MS-5 및 CD34 양성 세포를 방해하지 않는다는 것을 기억한다. 이러한 분화 프로토콜에 따라, CD34 양성 세포 배양은 형태학적 변화, 세포 세포 효과, 세포 주기 패턴의 변화 및 분화 정도를 분석할 수 있다.
