Funding Sources: The University of Arizona, The Jim Himelic Foundation, and the Arizona Center for the Biology of Complex Diseases.

hiPSCs는 4mm 피부 펀치 생검에서 분리 센다이 바이러스 매개 재 프로그래밍 (11)를 통해 집에서 재 프로그래밍 인간 피부 섬유 아세포에서 유래되었다. 애리조나 임상 시험 심사위원회의 대학은 대상 모집 및 생검 수집을위한 모든 절차를 승인했다. IPSC 문화에 대한 세포 외 매트릭스 코팅 표면의 1. 준비 <ol><li> 어느 날 이전 iMEFs에 성장 hiPSC 문화의 합류로, 세포 외 기질 (마트 리겔) 코팅 된 플레이트를 준비합니다. </li><li> 천천히 해동는 세포 외 기질의 나누어지는 2 시간 동안 4 ° C에서 얼음 (종속 많이는 사양서에 지시 사항을 따르십시오). </li><li> 바이오 안전성 후드에서 차가운 피펫 팁을 사용하여 (DMEM / F12 / HEPES)이 많은 특정 희석 요인에 따라 감기 둘 베코의 변형 이글 중간 / 영양 혼합물 F-12 세포 외 기질의 1 분취 량을 추가 (-20 ° C에서 보관) . </li><li> 분배 ~ 600(81) 각각의 새로운 세포 배양을 잘 당 세포 외 기질의 L은 12 웰 플레이트가 필요로 처리 하였다. </li><li> 실온에서 수 시간 동안 플레이트를 인큐베이션. 여기서, 3 시간의 배양 시간을 사용합니다. 참고 : 접시는 즉시 사용 또는 최대 2 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 전파에 대한 세포 외 매트릭스에 IMEF 피더 세포에 성장 hiPSCs 2. 전송 <ol><li> 계대하는 날에, 4 ° C에서 매트릭스 도장 판을 제거하고, 플레이트는 조직 배양 후드에서 1 시간 동안 실온에 적응하도록 허용한다. </li><li> iMEFs에 성장 hiPSC 문화의 6 웰 플레이트의 1도에서 매체를 대기음 500 μL 콜라게나 해리 시약으로 대체 (1 밀리그램 / 기초 배지에서 ㎖). </li><li> IPSC 식민지의 가장자리가 약간 들어 올려 나타날 때까지 30 분 - 10 ~ 37 ° C에서 품어. 참고 : 배양 시간이 줄 의존과 다를 수 있습니다. 현미경 분리를 모니터링합니다. </li><li> 차efully 해리 시약을 기음과 인산염 완충 생리 식염수 (PBS, pH를 7.4)으로 가볍게 두 번 씻는다. </li><li> 잘 10 NG / ㎖의 Rho 관련 단백질 키나제 억제제 (Y-27632 ROCK 저해제) 실온 mTeSR1 전체 매체의 1 ML을 추가합니다. 참고 :이 초기 통과하는 동안 IMEF 에어컨 매체와 mTeSR1의 50:50 혼합물을 사용하여 제안하고,이 미디어 전환시 hiPSCs의 생존에 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 수동으로 점수 1 선택, 후드 내부에 부분적으로 배치 된 작은 위상차 현미경을 사용하여 - 2 hiPSC 식민지를 (~ 700 - 직경 1000 μm의) 주사기와 바늘 (25 G, 1.5에서)를 사용. P200 피펫 팁을 가진 매체로 식민지의 득점 조각을 밀어 넣습니다. </li><li> 대기음은 코팅을 방해하지 않도록주의, 새로운 판에서 매트릭스를 처리합니다. </li><li> 이전 잘 잘 코팅 된 새로운 행렬로 득점 iPSCs를 포함한에서 세포 현탁액의 양도 1 mL를. </li><li> 놀이터37 ° C의 배양기에서 플레이트 CE, 5 % CO 2. 여러 빠른, 전후에 판 바위, 그리고 좌우로 움직임이 고르게 세포를 확산한다. 24 시간 동안 접시를 방해하지 마십시오. </li><li> mTeSR1 완전 배지 (Y-27632 ROCK 억제제를 첨가 단계 2.5의 초기 도금 후 필요하지 않습니다)와 매일 전체 미디어 변경을 수행합니다. </li></ol> 매트릭스 코팅 된 플레이트에 hiPSCs 3. 작은 규모과 Passaging 주 : 일반적으로, 코팅 된 플레이트를 매트릭스 할 hiPSCs 초기 전송 한 후, 세포를 모두 iMEFs가 제거 된 세포는 조건없이 공급기하도록 보장하기 위하여 유사한 방식으로 한 번 계대한다. <ol><li> 섹션 1에서 설명한 바와 같이 이전 IPSC의 포화 상태에 어느 날 갓 매트릭스 판을 코팅 준비합니다. </li><li> 통로의 날에, 39 ° C의 항온에서 매트릭스 도장 판을 제거하고, 판 조직 막힌 1 시간 동안 실온에 적응하도록 허용진짜야 후드. </li><li> (원래 매트릭스 공급 장치에서 전환) hiPSCs의 6 웰 플레이트의 1도에서 매체를 대기음 500 μL 세포 분리 버퍼로 교체합니다. 주 : 여기에서 사용되는 상업용 세포 해리 완충액 (재료 표 참조)에 비해 콜라게나 mTeSR1 매체와 함께 사용하기에보다 적합하다. </li><li> IPSC 콜로니의 가장자리가 약간 들어 올려 나타날 때까지 7 분 - 3 시간 동안 실온에서 인큐베이션. 앞서 언급 한 바와 같이, 인큐베이션 타임 라인 종속 변수이다. 따라서, 최적의 시간을 결정하기 위해 현미경으로 세포 분해를 감시한다. </li><li> 조심스럽게 분리 버퍼를 대기음하고 PBS로 부드럽게하는 과정을 2 회 반복한다. </li><li> 잘 10 NG / mL의 Y-27632 ROCK 저해제 실온 mTeSR1 전체 매체의 500 μL를 추가합니다. </li><li> 대신, 단계 260에서와 같이 득점 콜로니하는 P200 팁을 사용하여 미디어에 콜로니의 수를 밀어 부드럽게 세포 현탁액을 2 회 AG를 씹다크기 200 μm의 - 우물의 한 구석에 ~ (50)의 덩어리로 hiPSC 식민지를 깰 ainst. 각 1 개의 새 우물에 전송하는 2 식민지 - 예를 들어, 12 웰 플레이트를 들어, 1을 선택합니다. 물론 12 웰 플레이트의 하나의 새로운 우물에 기존의 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 여러 빠른 전후에 판 암, 및 좌우 운동은 균일하게 세포를 확산하고, 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 24 시간 동안 접시 나머지하자. </li><li> mTeSR1 완전한 매체와 매일 전체 미디어 변경을 수행합니다. 앞서 언급 한 바와 같이, 초기 도금 후 Y-27632의 ROCK 억제제를 추가 할 필요가 없다. 참고 : 단계 3.7에서 사용되지 않는 IPSC 식민지가이 시점에서 쉽게 냉동 보관 할 수있다. </li></ol> 면역 세포 화학에 대한 hiPSCs의 시드 대한 상공 회의소 슬라이드 및 Coverslips는 4. 준비 참고 : 다음 프로토콜은 4 웰 플라스틱 챔버 슬라이드와 appropriat와 12mm 커버 글라스를 사용한다멀티 웰 미디어의 전자 볼륨은 비용 효과적인 면역 세포를 지원한다. 더 잘 커버 슬립 크기의 사용이 요구되는 경우, 매체 볼륨이 증가 될 수있다. <ol><li> 어느 날 hiPSC 합류하기 전에 충분히 매트릭스 솔루션 부 (1)에서 설명한 바와 같이 갓 세포 외 기질로 코팅 챔버 슬라이드를 준비 추가 (~ 300 - 4 잘 챔버 슬라이드의 잘 당 500 μL)의 우려없이 잘 완전히 코트 각 증발. 또한, 500 μL 각 24 웰 플레이트의 웰 코트에 세포 외 기질을 1 청소 및 소독 커버 슬립을 배치하고 coverslip에이 솔루션의 상단에 떠 있지 않은지 확인 후. </li><li> 통로의 날, 4 ° C에서 코팅 된 챔버 슬라이드 / 커버 슬립을 제거하고 조직 배양 후드에서 1 시간 동안 실온에 적응을 허용한다. </li><li> hiPSCs의 12 웰 플레이트의 한 우물에서 매체를 대기음 500 μL 해리 버퍼로 교체합니다. </li><li> 객실 템피에 품어~ 3 rature - 7 분은 IPSC 식민지의 가장자리가 약간 들어 올려 나타날 때까지. </li><li> 조심스럽게 분리 버퍼를 기음과 우물에 10 NG / mL의 Y-27632 ROCK 저해제 실온 mTeSR1 완전 배지 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 수동으로 4 웰 챔버 슬라이드 또는 1 새 coverslip에의 한 식민지 / 새로운 잘 선택, 조직 문화 후드 내부에 배치 작은 위상차 현미경을 사용하여 도금 될 (~ 1000 - 직경 1,500 μm의)를 추진하여 P200 피펫 팁을 사용하여 그것은 오프 매체에 플레이트 표면. </li><li> 코팅을 방해하지 않도록주의, 새로운 챔버 슬라이드 / 커버 슬립에서 행렬을 대기음. </li><li> 크기 200 μm의 - 부드럽게 ~ 50의 덩어리로 세포 현탁액에게 hiPSC 식민지를 깰 우물의 한 구석에 대하여 2 번 씹다. 잘 4 잘 챔버 슬라이드 / 커버 슬립의 새 우물에 이전에서 세포 현탁액 250 μL를 전송합니다. </li><li> 잘 mTeSR1의 계속 500 μL까지 새로운 각의 볼륨을 가져와10 NG / mL의 Y-27632 ROCK 억제제를 aining. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2의 인큐베이터에서 챔버 슬라이드 / 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 24 시간 후, mTeSR1 완전한 매체와 매일 전체 미디어 변경을 수행합니다. 앞서 언급 한 바와 같이 다시, Y-27632 ROCK 억제제의 첨가는 초기 도금 후 불필요하다. </li></ol> 면역 세포 화학에 대한 iPSCs 5. 준비 <ol><li> 합류 후, 미리 예열주의 4 % 파라 포름 알데히드를 우물에서 미디어를 제거하고 추가하여 고정을 통해 hiPSC 식민지를 유지 (~ 300 μL / 웰의 4 웰 챔버 슬라이드 / 커버 슬립). 실온에서 20 분 동안 인큐베이션. </li><li> 적절하게 기관 생물 및 화학 안전 지침에 따라 파라 포름 알데히드를 폐기하십시오. </li><li> PBS와 벤치 탑 진탕 기에서 5 분마다 세포를 3 회 반복한다. 참고 : 챔버 슬라이드에 세포 / 커버 슬립이 단계에서 무한정 4 ° C에서 충분한 PBS로 저장할 수 있습니다.대안 적으로, 그들은 즉시 ICC를 위해 사용될 수있다. </li></ol> 만능 마커와 hiPSCs 6. 면역 염색 참고 : 표준 만능의 항체 발현 사이의 hiPSCs. 예를 들어, 여기 세포 더블 스테인드 다음과 같이 항체가 하나의 1면과 순차적으로 1 세포 내 항원을 대상으로 다음과 같습니다과 안티 무대 특정 배아 항원-4 (SSEA4) 단백질 4 (옥트을 방지 옥타 결합 4) 및 안티 트라-1-60 반 SRY 관련 HMG 상자 유전자 2 (SOX2)와 () 항체 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. <ol><li> 우물에서 PBS를 기음과 트리톤 X-100없이 500 μL / 잘 차단 솔루션에 추가 할 수 있습니다. 실온에서 1 시간 동안 배양. </li><li> 트리톤 X-100 않고 차단 용액으로 희석하여 표면 항체, SSEA4 또는 트라-1-60 중 하나로서, 미리 결정된 농도를 준비 (200 여기서, 1을 사용). <ol><li> 챔버 슬라이드를 들어, 4 잘 챔버 슬라이드의 300 μL / 잘 준비위의 솔루션 및 안티 SSEA4 또는 트라-1-60 일차 항체의 1.5 μL를 차단의 298.5 μL를 혼합하여. </li><li> 된 커버를 들어, 솔루션 및 안티 SSEA4 또는 트라-1-60 일차 항체의 1 μL 차단의 199 μL를 혼합하여 40 μL / 커버 슬립을 준비합니다. </li></ol></li><li> 챔버 슬라이드에서 차단 솔루션을 기음하고 적절한 우물에 차 항체를 분배. 된 커버를 들어, 단단히 페트리 접시 안에 파라 필름의 조각을 놓고 방울로 위에 차 항체의 40 μL를 분배. 구부러진 주사기 바늘과 집게를 사용하여 조심스럽게 아니라 문화의 밖으로 커버 슬립을 들어 올려 파라 필름에 대한 항체의 드롭에 아래로 셀 측면을 배치합니다. 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> 챔버 슬라이드에서 항체를 제거하고 PBS에 추가하여 10 분마다, - 다음날 아침, 세포 3 번, 5 씻는다. 된 커버를 들어, 파라 필름 오프 각을 들어 올려 24 웰 플레이트, 세포면이 위로의 잘에 다시 배치합니다. 조심스럽게 P를 추가BS. </li><li> 1 적절한 보조 항체를 준비 : (500)를 차단 솔루션에. <ol><li> 챔버 슬라이드를 들어, 준비 300 μL / 웰 4 잘 챔버 슬라이드의 항 - 마우스 IgM의 알렉사 플 루어 염소의 항 - 마우스 IgG3 알렉사 플 루어 488 (SSEA4) 또는 1 μL 염소의 μL를 차단 솔루션의 499 μL를 혼합 1로 488 (트라-1-60)입니다. </li><li> 커버 슬립을 위해 솔루션을 차단의 499 μL를 혼합하여 40 μL / 커버 슬립을 준비하고 염소의 1 μL 항 - 마우스 IgG3 알렉사 플 루어 488 염소의 μL 항 - 마우스 IgM의 알렉사 플 루어 488 (SSEA4) 또는 1 (대한 트라-1-60 ). </li></ol></li><li> 챔버 슬라이드에서 PBS를 대기음하고 적절한 우물에 차 항체를 분배. 커버 슬립 들어, 스텝 6.2 다음, 실온에서 2 시간 동안 파라 필름 상에 배치 된 항체 용액 위에 커버 슬립을 반전. 참고 : 사용하는 형광 이차 항체를 태그하면, 세포가 빛으로부터 보호해야합니다. 어두운 ENV에 챔버 슬라이드와 커버 슬립을 배치배양 및 세척시 ironment. </li><li> 챔버 슬라이드에서 항체를 제거하고 PBS에 추가하여 10 분마다 - 5 세포를 3 회 반복한다. 된 커버를 들어, 파라 필름에서 조심스럽게 하나 하나를 들어 올려 24 웰 플레이트, 세포면이 위로의 잘 다시 배치합니다. 부드럽게 세척하는 동안 PBS를 추가합니다. </li><li> 제 항원 프로빙에 앞서, 세포 옥트 4이 경우 SOX2 실온에서 1 시간 동안 permeabilization 시약 (트리톤 X-100)로 이루어진 차단 용액으로 다시 배양한다. </li><li> 옥트 4 SOX2위한 발현 사이하려면 일차 및 이차 항체를 가하는 단계 6.1-6.6에서 설명 된 방법을 따른다. 1 (200) 및 이차 항체를 염소 항 - 토끼 IgG를 렉 형석 594 :이 프로토콜의 목적을 위해, 하나의 농도 옥트 4 SOX2를 사용하여 500. </li><li> 6&#39;-diamidino-2 &#39;PBS로 각각 10 분 및 4 Counterstain과 - 상기의 일차 및 이차 항체 치료 후 5 세포를 3 회 세척-phenylindole 핵 시각화가 요구되는 경우 표준 프로토콜에 따라 디 히드로 클로라이드 (DAPI). </li></ol> 보기 7. 준비 <ol><li> 챔버 슬라이드를 들어, 조심스럽게 제조업체의 지침에 따라, 슬라이드에서 상부 챔버를 제거합니다. 그런 다음, 증류수로 세척하고, 현미경을 사용하려면 매체와 커브 글라스를 장착 추가합니다. </li><li> 커버 슬립 들어, 중간 유리 현미경 슬라이드에 위치 장착 하락에 커버 슬립을 반전. </li><li> 표준 또는 공 초점 형광 현미경 이미지. </li></ol>

<ol>
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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li><li>Ruff, D., Lieu, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+stem+cells+using+quantitative+PCR+protein+assays.">Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays.</a> Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).</li><li>Pripuzova, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+protein+marker+panel+for+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+(hiPSCs)+using+global+quantitative+proteome+analysis.">Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis.</a> Stem cell res. 14, 323-338 (2015).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).</li><li>Bigdeli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+embryonic+stem+cells+to+feeder-free+and+matrix-free+culture+conditions+directly+on+plastic+surfaces.">Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces.</a> J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).</li><li>Stover, A. 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The authors have nothing to disclose.

여기에 제시된 프로토콜 체계 특히 면역 세포를 통해 효과적인 능성 분석을 지원하기위한 축소 된 배양 기술의 형태로 시간을 절약하고 비용 효율적인 방법을 제공한다. 다음과 같이 설명 된 방법의 주요 장점이다. 전통적 이상의 3~4 통로 12, 13을 표시 대량 분리 기술의 사용 후에 잔존 iMEFs을 제거하기 위해 전형적인 단층 형태를?...

유도 된 다 능성 줄기 세포로 인간 성인 체세포 재 프로그래밍 (iPSCs)는 병 (1, 2)를 연구하기 위해 환자의 특정 셀의 잠재적으로 무제한의 전원을 얻을 수있는 방법을 제공한다. 시험 관내에서 질병 표현형을 Recapitulating 것은 그럴듯한 질환과 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 조사 할 수 있도록하고, 신약 개발을 강화하고 약 3 개인 것입니다. 또한, 인간 iPSCs (hiPSCs)는 죽은 세포 또는 장애를 바꾼 여러 질환 (4)의 컨텍스트 (5)에 기능을 회복하기위한 고유 자원으로 이용 될 수있는 특정 유형의 세포를 유도 할 가능성을 제공한다. 위의 응용 프로그램에서 iPSCs를 사용하는 중요한 전제 조건은 다 능성 및 미분화 상태가 문화의 확장 동안 유지되는 것을 보장한다. 일반적으로, techniq세포 및 특수 장비를 대량으로 필요로 이러한 유세포, 웨스턴 블롯, 중합 효소 연쇄 반응 분석 및 기능 등의 단말은, IPSC의 능성 6, 7, 8, 9, 10의 상세한 분석을 위해 사용된다. 그러나, iPSCs &#39;미분화 상태의 일상적인 평가를 효과적으로 이렇게 감소 된 시간과 자원을 포함하는, 특히 면역 세포 (ICC) 이러한 세포의 제한된 전파를 통해 달성 될 수 있습니다. 최근 발전은 뮤린 섬유 아세포의 피더 레이어 혈청 함유 배지를 필요 종래 배양 시스템에 비해 상당히 개선 된 정의를 무 혈청 조건 iPSCs의 성장을 허용한다. 그러나, 현재의 문학 공급 장치에서 iPSCs를 전환하는 방법에 대해 설명 명확한 단계적 프로토콜을 포함하지 않는공급 장치가없는 시스템에 층. 이러한 맥락에서, 본 프로토콜은 체계적으로 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포 성장 hiPSCs는 (IMEF) 세포층 (1) 일 무 혈청 배지에서 전파하도록 적응, (2) 소규모 배양 특별히 강력한 지원하는 방법을 자세히 면역 세포 화학 분석. 전반적으로,이 방법은 면역 세포를 이용하여 정기적으로 자신의 분화능을 확인하기위한 무 혈청 조건에서 인간 iPSCs 전파하기위한 신속하고 비용 효과적인 방법을 나타낸다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM-F12/HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-Basic</td>
			<td>Cell Sciences</td>
			<td>CRF001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 ROCK Inhibitor</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Basal Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>05850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 5X Supplement</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>05850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Buffer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M PO4 Buffer</td>
			<td>In-House</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldeyde, prill</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phoshate Buffered Saline</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, 
			Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, 
			SSEA4 (MC813) Mouse mAb, 
			TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling 
			Cell Signaling 
			Cell Signaling 
			Cell Signaling</td>
			<td>2840 
			3579 
			4755 
			4746</td>
			<td>Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Cell Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>0720080/0720081</td>
			<td>Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12 565 21</td>
			<td>Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for growth</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12 545 82</td>
			<td>Available in 12, 15, 18, 22 and 25mm sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale propagation of human ipscs in serum-free conditions for routine immunocytochemical characterization

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.

이 프로토콜은 특별히 능성 유지를 확인하기위한 비용 효율적인 면역 세포를 활성화하는 제한된 방식 피더 확보 조건 세포층으로부터 전송하고,이어서 전달되는 방법 인간 iPSCs의 단계적인 설명을 제공한다. 도 1은이 프로토콜의 개략도를 도시한다. 도 2a는 6 웰 플레이트에 iMEFs에 성장 hiPSC 식민지를 보여줍니다. 이러한 식민지 정의 테두리와 조?...

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Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.

일상적인 면역 세포 화학 특성에 대한 혈청이없는 조건에서 인간 iPSCs의 소규모 전파

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K 조회수.  The University of Arizona. Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

소설 문화 모델은 인간 다 능성에 대한 태반 에어컨 미디어에서 젤라틴에 세포 전파 줄기

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during embryonic development that also commonly occurs in glioblastoma, the most frequent malignant brain tumor. EMT has also been observed in multiple carcinomas outside the brain including breast cancer, lung cancer, colon cancer, gastric cancer. EMT is centrally linked to malignancy by promoting migration, invasion and metastasis formation. The mechanisms of EMT induction are not fully understood. Here we describe an in vitro system for standardized isolation of cortical neural stem cells (NSCs) and subsequent EMT-induction. This system provides the flexibility to use either single cells or explant culture. In this system, rat or mouse embryonic forebrain NSCs are cultured in a defined medium, devoid of serum and enzymes. The NSCs expressed Olig2 and Sox10, two transcription factors observed in oligodendrocyte precursor cells (OPCs). Using this system, interactions between FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling involving Zeb1, Zeb2, and Twist2 were observed where TGF&#946;-activation significantly enhanced cell migration, suggesting a synergistic BMP-/TGF&#946;-interaction. The results point to a network of FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling to be involved in EMT induction and maintenance. This model system is relevant to investigate EMT in vitro. It is cost-efficient and shows high reproducibility. It also allows for the comparison of different compounds with respect to their migration responses (quantitative distance measurement), and high-throughput screening of compounds to inhibit or enhance EMT (qualitative measurement). The model is therefore well suited to test drug libraries for substances affecting EMT.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

Immunocytochemical 분석에 대 한 교양된 인간 태아 뇌 신경 줄기 세포의 Zika 바이러스 감염

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...