실험실에서 박사 Anjali Nandal에 박사 후 펠로 십 그랜트와 탐험 그랜트에 의해 지원 되었다 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 BT (TEDCO)에서.

1. 프로그래밍 프로토콜 <ol><li>기본 인간의 췌 장 세포에서 인간 iPSC의 세대 <ol><li>6-잘 1.5 mg/mL 차가운 콜라겐 접시 하 고 1 h. 위해 37 ° C에서 젤 코트</li>
		<li>접시 인간의 기본 췌 장 세포는 콜라겐에 Prigrow III 매체 (~ 1-1.5 × 10 5 셀)에 코팅 6 잘 플레이트에 하루 약 2.5 × 10 5 셀 또는 적어도 60%를 달성 하기 위해-2 초기 통로의 날에 잘 당 confluency 변환 (0 일)입니다. 첫 번째 연구를 위해 0에 원하는 confluency 하나 잘 얻을 적어도 2-3 웰 스 접시. 셀 하나 이상 잘 컨트롤 사용.</li>
		<li>변환 (0 일)의 날, 따뜻한 불리고 수를 각 잘 물 욕조에 Prigrow III 매체의 1 mL. 수확 10 %FBS 매체 1 mL의 트립 신/EDTA를 사용 하 여 5 분의 1 mL에 한 컨트롤에서 셀 또는 셀 셀 수 수행을 분리 하는. 10 %FBS 매체, 추가 DMEM, 10 %FBS, 1 %L-글루타민, 1% 나트륨 Pyruvate와 1% 비 본질적인 아미노산.</li>
		<li>수 셀 카운터를 사용 하 여 세포의 생존 능력을 확인 하 고 계산 셀 번호 및 바이러스 titer에 따라 목표에 도달 하는 데 필요한 각 바이러스의 볼륨. KOS의 감염 (MOI)의 다양성을 사용 하 여 = 5, hc-Myc = 5, hKlf4 = 췌 장 세포에 대 한 3.</li>
		<li>센다이의 해 동 한 세트 얼음-80 ° C 저장에서 튜브를 벡터와 신중 하 게 Prigrow III 매체의 1 mL를 각각 3 센다이 벡터 튜브의 계산 된 볼륨을 추가 37 미리 예 열 ° C. 피 펫 혼합 솔루션을 부드럽게. 6 잘 플레이트 한 잘 재설정된 세포 생성에 센다이 바이러스 성 벡터와 시험에 대 한 충분 하다.</li>
		<li>셀에서 Prigrow III 중간 발음 하 고 천천히 셀을 포함 하는 우물을 재활 바이러스 혼합물을 추가 합니다. 5% CO 2의 습도 분위기 37 ° C 배양 기에서 하룻밤 셀을 품 어.</li>
		<li>신중 하 게 세포에 바이러스 혼합물을 삭제 하 고 날, 변환 후 24 시간 신선한 Prigrow III 매체를 바꿉니다. 셀 d 5에 대 한 문화와 매체 대체 매일 변경.</li>
		<li>5 일에 0.1% 젤라틴 미리 코팅 10 cm 문화 요리 (1.3 x 10 6 셀/접시)에 MEFs을 준비. 하루 4까지 플라스 크 T175에서에서 MEFs를 성장 하 고 다음 날 5, 셀 13 또는 사용 상업 MEF 소스 뿌리기 전에 γ 방사선 소스에서 6000 래 드 셀 노출.</li>
		<li>6 일에를 사용 하 여 세포 분리 솔루션의 1 mL 10 분 transduced 세포를 분리, Prigrow III 매체에서 MEF 요리에 그들의 모든 바위 억제제 (5 m m 재고, 최종 10 µ M) 접시 습도 atmosphe와 37 ° C 배양 기에서 밤새 품 어 다시 5% CO 2.</li>
		<li>는 HESC 매체 다음날 Prigrow III 매체를 변경합니다. HESC 매체의 500 mL를 만들기 위한 추가 DMEM/F-12, 20% (v/v) 녹아웃 혈 청 교체 (KOSR), 5 ng/mL bFGF; 1 m m l-글루타민; 100 µ M 불필요 한 아미노산 그리고 100 µ M 2-mercaptoethanol. 지금 매일 부드럽게 매체 변경.</li>
		<li>재설정된 셀을 나타내는 세포 덩어리 또는 식민지의 출현에 대 한 정기적으로 번호판을 관찰합니다. 변환 된 셀 조약돌 형태학 및 큰 핵 nucleoli 클론 집계를 형성합니다. 표시는 가능한 &#39; iPSC &#39; 식민지 성장을 위해 그들을 정기적으로 확인 하 고.</li>
		<li>변환 후에 거의 4 주 식민지 따기 또는 전송에 대 한 준비가 단일 식민지의 전송에 대 한 이전과 1.3 x 10 6 셀/젤라틴 미리 코팅된 접시를 도금 하 여 24-잘 MEF 접시 준비.
		<li>분석 증명서에 희석 비율에 따라 aliquoting에 의해 (예를 들어, Matrigel) 준비 매트릭스 막 <ol>. 4 6 잘 플레이트 (1 mL/음) 하 고 사용 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 실 온 (RT)에서 품 어 코트 DMEM/F-12의 25 mL에 한 약 수를 추가 합니다. 수동으로 그들을 발음 하는 hESC 매체의 500 µ L에서 MEF 접시에 전송 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 12-24 식민지를 선택 하십시오.</li>
			<li>발음에 부드럽게 방해 또는 식민지를 분리 잘 미디어. 또한 매트릭스 코팅 막 24-잘 접시에 24-48 식민지를 선택 하십시오. 막 코팅 판에 대 한 24 시간에 대 한 mTeSR1 (10 µ M 바위 억제제 보충)를 사용 하 고 매일 변경. 식민지를 따기의 6-10 d, 내 클론 확장에 대 한 새로운 24-잘 / 12 잘 막 격판덮개 전송 준비가 되.</li>
		</ol></li> <li>필요한 경우, MEFs 1mg/mL 콜라를 사용 하 여 20 분 동안에 식민지를 분리, 세척 두 번 hESC/mTeSR1와 막에 코팅 12 또는 24 잘 접시. 성장 단계의 1.1.12 매트릭스 막에 충분 한 강력한 식민지 경우 동결 iPSC 냉동 제조 업체에 따라 미디어를 사용 하 여 MEFs에 식민지 &#39; s 지침.</li>
		<li>단계 1.1.12 20 분에 대 한 dispase의 500 µ L를 사용 하 여에서 막에 도금 강력한 식민지를 분리 하 고 접시 다시 매트릭스 막에 코팅 된 12-잘 접시. 수동으로 어떤 차별화 된 셀 이나 만능 클론 멤브레인에 대 한 풍부 하 게 오염 MEF 급지대 셀 다쳤어요.</li>
		<li>는 멤브레인에 성장 하 여 6-8 d dispase 솔루션으로 앞으로 해리 하 여 플레이트를 코팅 하 고 6 또는 12 잘 플레이트 코팅 도금 신선한 막에서 작은 셀 집계 후 클론을 확장 합니다. 변경 mTeSR1 매체 매일입니다. 얼룩, pluripotency 마커 (OCT3/4 및 분석용 NANOG), FACS 만능 표면 마커 및 차별화 분석 실험의 immunostaining 알칼리 성 인산 가수분해 효소에 의해 재설정된 클론을 특징. 성장 하 고 CRISPR 다른 코팅 솔루션은 구체적으로 언급 하지 않는 한 위에서 설명 편집을 비롯 한 모든 분석에 대 한 막 코팅 판에 클론 문화.</li>
	</ol></li> <li>인간의 특성 Ipsc <ol><li>알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 참고: 상업 키트는 여기에 사용 됩니다. 자료 테이블을 참조 하십시오.
		<ol><li>매일 미디어 변경 24-잘 접시에 4-5 d 문화 상 상속 인간의 Ipsc 접시.</li>
			<li>얼룩 프로토콜을 시작, 문화 매체를 발음 0.05 %1 x PBS의 1 mL로 세포 세척을 트윈 20 (PBST).</li>
			<li>키트 셀에 수정 솔루션의 0.5 mL을 추가 하 고 2 ~ 5 분 Aspirate 수정 솔루션에 대 한 RT에서 품 어 다음 PBST와 고정된 셀을 씻어. 건조 우물을 허용 하지 않습니다.</li>
			<li>솔루션 A, B 및 C. 품은 어둠 속에서 (호 일 또는 어두운 컨테이너에 포장) 5 ~ 15 분에 대 한 실 온에서 전지를 혼합 하 여 잘 당 갓된 AP 기판 솔루션의 0.5 mL을 추가 
			참고: 밀접 하 게 모니터 색상 변경 하 고 색상 일반적인 얼룩 피하기 위해 밝은 때 반응을 중지.</li>
			<li>AP 기판 솔루션 발음 및 1 x PBS의 2 mL로 두 번 우물을 세척 하 여 반응을 중지.</li>
			<li>현미경 식민지를 관찰 하 고 4 배 또는 10 배 확대 어떤 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 카메라에서 이미지를 캡처.</li>
		</ol></li> <li>Immunostaining <ol><li>매일 미디어 변경 24-잘 접시에 4-5 d 문화 인간의 Ipsc 접시.</li>
			<li>PBS와 PBS에서 4 %paraformaldehyde (PFA)와 20 분에 대 한 수정에 짧게 한 번 셀 세척.</li>
			<li>실시간에 PBS 가진 10 분 (3 x, 10 분)에 대 한 세 번 세척</li>
			<li>Saturate 일반적인 사이트 10% 일반 염소 또는 당나귀 혈 청 (NS, 동물 이차 항 체에 따라 발생에) PBS에서 실시간에서 40 분 세포내 epitopes만 포함 0.3 %PBS (TX/PBS) permeabilize 하에서 TX-100.</li>
			<li>워시 실시간에 PBS 가진 3 x 5 분</li>
			<li>5%의 신선한 솔루션에서 OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5와 SOX17 항 체 희석 PBS에서 NS 및 2 시간 또는 하룻밤 4 RT에서 품 어 ° c.</li>
			<li>실시간에 PBS 가진 5 분 동안 배를 씻어</li>
			<li>적절 한 보조 알 렉 사 Fluor 488 또는 5%에 568 항 체 희석 NS/PBS 및 실시간에서 1 시간에 대 한 셀을 품 어</li>
			<li>실시간에서 5 분 동안 배를 씻어</li>
			<li>1 PBS에 DAPI 함께 품 어0 분 및 세척 2 x 사진을 찍어 실시간 사용 형광 현미경에서 5 분.</li>
		</ol></li> <li>형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) <ol><li>식민지까지 문화와 6 잘 플레이트에 플레이트 인간의 Ipsc 될 80% 합칠 (적어도 10 5 셀 /sample) 매일 mTeSR1 중간 변화.</li>
			<li>실험 당일, 세포를 분리 하 고 프로토콜에 위에 설명 된 대로 단일 세포 현 탁 액에 해리. 10 %FBS 매체와 세척.</li>
			<li>0.5-1에서 resuspend 표면 표식에 대 한 10 %FBS 매체 및 계속 얼음의 mL</li>
			<li>세포내 표식에 대 한 4%의 1 mL에 resuspend PFA/PBS 및 실 온에서 10 분 동안 품 어. 10 %FBS 매체와 세척. 0.1%에서 resuspend TX/PBS와 얼음에 15 분 동안 품 어. 10 %FBS 매체와 다시 세척. 0.5-1에서 resuspend 10 %FBS 매체 및 계속 얼음의 mL</li>
			<li>10 %FBS 중간 포함의 50 µ L에 세포 현 탁 액의 추가 50 µ L TRA-1-60, TRA-1-81 또는 SSEA-4 항 체의 양을 권장 하 고 30 분 1 헤 알을 품고합니다</li>
			<li>10%로 두 번 씻어 FBS.</li>
			<li>Resuspend 10%의 100 µ L에서 FBS 매체 형광 이차 항 체를 포함 하 고 10 %FBS 적절 한 양의 10%에 resuspend로 두 번 30 분 세척에 대 한 품 어 FBS. 라이브 셀 propidium 요오드 화물 염료에 추가 하 여 죽은 세포에서 분화 될 수 있다 &#60; 세포 apoptosis 과정 추정 1 µ g/mL.</li>
		</ol></li> <li>트라이-혈통 차별화 <ol><li>10 6 Ipsc/10 µ M 바위 억제제와 mTeSR1 매체에 잘 x 1.5-2 2 6 잘 플레이트 씨앗.</li>
			<li>성장 mTeSR1 중간 변화 매일 2-3 d 우물은 80-90%까지 confluent 세포 허용.</li>
			<li>Ectoderm 유도 신경 유도 매체 (님)는 제조업체에 따라 추가 &#39; 6 잘 플레이트의 2-3 스에서 s 지시.</li>
			<li>RPMI 인슐린 마이너스 2 %B27 보충 및 12 µ M를 포함 하는 매체 변경 접시 14의 2-3 스에서 mesoderm 유도 대 한 CHIR99021. 다음 24 h. 추가 5 µ M에 대 한 인슐린 마이너스 2 %B27 보충을 포함 하는 추가 유일한 RPMI RPMI 보통 2 %B27 IWP4 다음 24 h에 대 한 인슐린을 뺀 보충. 72 h 후 바꿉니다 미디어 2-3 디 cardiomyocytes 박동의 생성으로 이어지는 2 %B27 보충 포함 된 RPMI</li>
			<li>Endoderm 유도 MCDB 131 1.5 g/L 나트륨 중 탄산염, Glutamax, 포도 당 10 m m, 0.5 %BSA, 100 ng/mL GDF8, 및 24 h. CHIR99021 없이 동일한 매체에 문화에 대 한 CHIR99021의 5µM x 1와 보완에 6 잘 플레이트의 우물에서 매체 변경 2-3 d 15.</li>
			<li>모든 3 개의 계보에 대 한 2 단계에서 immunostaining 프로토콜을 수행 하 고 관련 마커의 식 확인.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. 게놈 인간의 편집 iPSC 사용 하 여 CRISPR Cas9 <ol><li>준비의 Cas9 단백질 및 sgRNA <ol><li>메 마른 조건에서 microcentrifuge 튜브 Aliquot Cas9 단백질-80에서 튜브를 고정으로 aliquots를 저장 하 고 ° c.</li>
		<li>는 유전자 당 RNAs MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/)에서 소프트웨어 또는 다른 CRISPR 가이드 디자인 webtool 기반 가이드를 대상으로 두 개의 디자인. 녹아웃을 생성 하는 유전자 (열려있는 독서 프레임 기준)의 첫 번째 또는 두 번째 엑손 대상. 두 그렇게 그들은 가깝게 잘라 가이드 선택 (30 ~ 100 bp 간격) 우리가 쉽게 뇌관을 심사의 동일한 세트를 사용 하 여 삭제를 시각화 수 있습니다. 더 높은 품질 평가 점수 및 오프 대상 사이트의 낮은 수를 기반으로 소프트웨어 출력에서 가이드를 선택 하십시오. 상영 프로그램 뇌관 폭발 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 사용 하 여 뇌관 디자인. 100 이상 이어야 한다 뇌관 심사는 Cas9에서 bp 사이트 잘라내어 PCR 제품 크기 PCR에 의해 쉽게 확대를 위한 400-700 bp 사이 여야 선호.</li>
		<li>디자인 두 개의 상호 보완적인 sgRNA 올리고 사이트 양쪽 끝을 잘라 Bsa1로 DNAs (19-22 뉴클레오티드 길이에 따라 가이드 시퀀스). 올리고 DNAs 상업적으로 합성 및 이중 가닥 DNA를 단련 될 수 있습니다. 어 닐 링, 추가 1 µ L 각 100 µ M 가이드, 버퍼 (10 mM Tris, pH7.5 ~ 8.0, 50 m m NaCl, 1 mM EDTA) 어 닐 링의 25 µ L 및 물 23 µ L. Thermocycler 2 분 및 그 후에 점차적으로 25 ° C 이상 45 분을 냉각에 대 한 95 ° C에서 시작 하는 프로그램에서 품 어</li>
		<li>클론 Bsa1 제한 효소로 결과 조각의 2 µ L는 T4 DNA 리가 제조자에 의하여를 사용 하 여 Cas9 바인딩 사이트와 사내 T7 발기인 pCR2.1 벡터의 1 µ L를 소화 &#39; s 프로토콜.</li>
		<li>복제 된 DNA 파편을 연속 하 고 생체 외에서 T7 키트를 사용 하 여 단일 가이드 RNAs를 생성 하는 클론을 녹음 충실도 설정. 상업적인 키트 sgRNAs를 정화 하 고 RNase 무료 물에 elute. RNA 농도 확인 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>Transfection hiPSCs의 <ol><li>셀 40-50% 합칠 때까지 위에서 설명한 대로 hiPSCs mTeSR1 매체에 문화.</li>
		<li>2 시간 nucleofection, 전에 10 µ M 바위 억제제를 포함 하는 prewarmed mTeSR1 매체의 2 mL 매체 바꿉니다.</li>
		<li>1 시간 후, 준비 대상 웰 스 nucleofected 셀 발음 막, 위, 12-잘 접시에서 준비 하 고 10 µ M 바위 억제제와 mTeSR1 매체의 prewarmed 1 mL을 바꿉니다. 부 화에 대 한 37 ° C에서 유지.</li>
		<li>준비 nucleofection 마스터 믹스 (샘플에 따라 적절 하 게 스케일) P3 1 차 셀의 16.4 µ L 추가 하 여 각 샘플에 대 한 보충, 보충 1 nucleofector 키트, Cas9 단백질의 0.5 µ g의 3.6 µ L 및 각 sgRNA의 0.5 µ g 반응 양 당 22 µ L에서. pMAX GFP 벡터는 또한 제조자에 의하여 nucleofected &#39; 대략 iPSC transfection 효율 추정 하 셀에 s 권고.</li>
		<li>씻어 각 iPSC 우물에서 바위 억제제를 포함 하는 매체를 발음 후 RT PBS의 2 mL와 잘. 다음 발음 PBS, 세포 분리 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어</li>
		<li>는 MTeSR1 매체의 3 mL에 셀 resuspend 그리고 부드럽게 위아래로 단일 세포 현 탁 액을 생성 하기 위해 플라스틱. 15 mL 원심 분리기를 전송 해리 셀 튜브 포함 5 mL mTeSR1 매체.</li>
		<li>셀 셀 카운터 하 고 총 볼륨 0.5 x 10 6 셀/transfection에 필요한 계산. 원하는 양의 셀에 15 mL 원심 분리기 튜브, RT에 5 분 동안 200 x g에서 원심 하 고 상쾌한 발음.</li>
		<li>X 10 6 세포 transfection 마스터 믹스 4 단계에서 준비의 22 µ L에서 0.5의 각 단위를 resuspend. 신속 하 게 nucleocuvette 스트립의 한의 중앙 챔버로 셀을 전송. 프로그램 CB150를 사용 하 여 nucleofector 장치 및 nucleofect 세포로 스트립을 놓습니다.</li>
		<li>Nucleofection, 후 신속 하 게 nucleofected 셀의 각 음에 10 µ M 바위 억제제를 포함 하는 prewarmed mTESR1 매체의 80 µ L을 추가. 부드럽게 위아래로 pipetting 혼합.</li>
		<li>부드럽게 웰 스 판의 막 미리 코팅 12-잘 록 제 3 단계에서 준비 된 mTeSR1 매체를 포함 하는 스트립에서 셀 전송.</li>
		<li>후 1 d 록 억제제 없이 신선한 mTeSR1 매체를 변경 합니다. 수확 nucleofection 단일 셀 정렬 후 2-3 d 세포.</li>
	</ol></li> <li>타겟된 hiPSCs의 단일 셀 격리 <ol><li>정렬, 전에 1 일 시드 2 x 10 6 셀/젤라틴 코팅 접시 10 %FBS 매체에 의해 96 잘 MEF 접시를 준비. 클론의 약 70-80 %nucleofection 후 생존과 2-3 MEF 접시 각 편집 실험을 위해 준비 될 수 있다.</li>
		<li>100 보충 hESC 매체 (앞에서 설명한) 매체 변경 다음 하룻밤 인큐베이션 ng /mL bFGF, 1 x SMC4 (억제제 단일 세포 생존 능력을 향상 시키기 위해 미디어에 추가), 그리고 접착 홍보 5 mg/mL fibronectin.</li>
		<li>MTeSR1 매체 1 보충을 mTeSR1에서 12-잘 접시에 hiPSCs에 매체를 대체할 단일 셀 정렬 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 x SMC4.</li>
		<li>는 HiPSCs에서 매체를 발음 하 고 부드럽게 PBS로 세포를 씻어. 각 잘에서 세포 분리 솔루션의 500 µ L을 추가 하 고 PBS 발음 후 10 분 동안 37 ° C에서 품 어. 단일 세포 현 탁 액을 각 영역 (unsupplemented) mTeSR1의 1 mL을 추가 하 고 pipetting 아래로 부드럽게 여러 번 여 생성.</li>
		<li>세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브와 실시간 Aspirate 상쾌한에 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기에 고 resuspend mTeSR1의 1 mL에 셀.</li>
		<li>1 단계에서 준비 된 96 잘 접시의 한 셀에 개별 잘 살 균 조건 하에서 100 m m 노즐 셀 정렬을 사용 하 여 단일 셀에 셀 정렬.</li>
		<li>정렬 후 4 일 1 보충 하는 hESC 매체와 문화 매체를 대체이 시점에서 식민지 형성 명백한; 해야 x SMC4.</li>
		<li>정렬 후 8 일 hESC 매체와 2에 대 한 문화 매체를 대체 디</li>
		<li>1 mg/mL 콜라를 사용 하 여 20 분에 대 한 식민지를 분리 하 고 록 억제제와 mTeSR1에서 24-잘 막 코팅 접시에 그들을 전송. 단일 셀 클론 성장 하 고 복제 또는 그들을 확장 후 그들의 게놈 DNA를 추출 하자. 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 대상 DNA PCR에 의해 증폭.</li>
		<li>사용 조각 분석기 키트 젤/염료를 통해 그들을 실행 하 여 모든 클론의 PCR 증폭된 대상 게놈 지역의 초기 심사에 대 한 제조 업체에 따라 믹스 &#39; s 지시. 예제와 함께 실행 되는 적절 한 사다리 그것을 비교 하 여 소프트웨어 PROSize에서에서 결과 조각 크기를 예상 하고있다. 예상 순서 &#39; 편집 &#39; 복제 및 시퀀싱 데이터를 확인 하는 편집 또는 삭제 분석.</li>
		<li>Monoallelic 및 biallelic 클론 차별화에 대 한 증폭 PCR와 pJET1.2 벡터에 복제 편집된 시퀀스. 시퀀싱에 대 한 적어도 8-10 클론 보내고 하나 또는 둘 다 대립 유전자에서 편집 확인 순서를 확인 하십시오.</li>
		<li>성공적으로 타겟된 iPSC 클론 유전형을 통해 확인 되었습니다, 일단 검사는 그들이 하지 pluripotency 손실 또는 염색체 이상이 과정을 통해 얻은 것인지.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Sci. 85, 348-362 (2009).</li><li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci. Rep. 4, 3594 (2014).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).</li><li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes.">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 169, 559 (2017).</li><li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes.">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li><li>McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cell+culture.">Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).</li><li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+technology:+a+decade+of+progress.">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/HDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes.">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> BioTechniques. 59, (2015).</li><li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+CRISPR/Cas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA,+Cas9+nuclease,+and+donor+DNA.">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li></ol>

BT는 쳐도 생물 과학 주식 회사의 창립 멤버

Ipsc 인간의 체세포의 재프로그래밍 기본적인 생물학 연구, 맞춤된 의학, 질병, 약물 개발 모델링과 재생 의학16의 분야에 큰 향상을 제공 하고있다. 호스트 게놈으로 통합의 위험 바이러스의 사용을 필요로 하는 인간의 iPSC 세대의 많은 현재 및 널리 사용 되는 방법 또는 episomal 벡터와 낮은 효율을 프로그래밍. 여기, 우리는 Ipsc 공급기 무료 센다이 바이러스, ' 무료 '와 효율적인 ?...

요소를 프로그래밍의 overexpression에 의해 만능 상태로 인간 체세포의 재프로그래밍 질병 모델링, 재생 의료 및 약물 개발에 응용 프로그램과 함께 줄기 세포 연구를 혁명 있다. 여러 가지 비 바이러스 성 재활 방법을 프로그래밍 요소와 Ipsc, 생성의 배달을 위해 사용할 수 있지만 과정은 노동 집약 하 고 매우 효율적인1. 바이러스 성 방법 비록 효율적 바이러스 통합 및 tumorigenicity2,,34의 문제와 관련 된 있습니다. 이 원고에서 우리 제공 요소를 프로그래밍 하 고 그들의 유전자5에 어떤 바이러스 성 벡터 시퀀스의 통합 부족 발자국 무료 iPSC 라인 설정에 대 한 세포질 센다이 바이러스를 사용 하 여를 보고 합니다. 센다이 바이러스는 RNA 바이러스는 감염 후 세포 세포질 ~ 10 구절에서 희석 하 고 풍부 하 게, 신속 하 고 효율적인 프로그래밍6,7을 선도 재활 요소를 생성 합니다. 설립된 Ipsc 공급기 무료 중간 급지대 셀8로 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)의 사용을 피하기 위해 쉽게 전환 수 다음.
프로그래밍, 센다이 바이러스 중재 한 개요 뿐만 아니라이 책에서 우리 또한 원하는 유전자 수정 연구에 대 한 무제한 인간 세포를 공급 하는 Ipsc 편집에 대 한 향상 된 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 지금 노크 기능 및 녹아웃, 대규모 게놈 삭제, 유전자 검색, 유전자 공학에 대 한 심사는 풀링된 라이브러리를 포함 한 애플 리 케이 션의 광범위 한 사용 되는 Ipsc의 수정에 대 한 CRISPR/Cas9 기술 사용 수많은 모형 유기 체 및 유전자 치료9,,1011 이 기술은 포함 한다 연쇄 상 구 균 pyogenes의 단지의 형성-20-메 르 및 파생 Cas9 nuclease 가이드 RNAs 게놈 대상 시퀀스 3' 뉴클레오티드 protospacer 인접 한에 인접 한 자료 연결을 통해 대상 인식 하기 위해 모티브 (PAM) 시퀀스입니다. Cas9 nuclease 유도 이후에 주로 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 통로 선도 삽입 또는 열려있는 독서 프레임에서 삭제 하 여 복구 하 고 그로 인하여 기능 팸 사이트에서 이중 좌초 휴식 ~ 3 뉴클레오티드 12유전자 녹아웃
인간의 췌 장 세포의 문화에 대 한 세부 정보를 포함 하는 우리의 향상 된 프로토콜, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 프로그래밍, 피더 무료 문화 이후 적응의 높은 효율을 달성 하기 위해 비활성화 mitotically에 그들의 프로그래밍 Matrigel, 설립된 Ipsc의 특성에 CRISPR 가이드 RNA 설계 및 준비, RNP 단지, 단일 셀 정렬 편집된 Ipsc의 클론 라인 생성 하, 쉽게 심사 및 편집, 식별 및 특성으로 Ipsc에 배달 단일 셀 복제합니다. 게놈 삭제 했다 Cas9 단백질 및 두 배 좌초 틈 (DSBs) 유도 하 두 CRISPR sgRNA RNP 복합물의 도입으로 효율적으로이 연구에서 생성 되 고 삭제는 개입의 세그먼트. 이 메서드는 열려있는 독서 프레임에서 삭제를 생성 하기 위한 두 명의 가이드를 사용 하 여에 대문자로 바꿉니다, 그리고 고효율의 낮은 수 선도 NHEJ의 클론 자동된 모 세관에 의해 그 특성화 될 필요가 그리고 클론의 쉬운 예비 심사 전기 이동 법 단위, 조각 분석기입니다. 이러한 효과적인 게놈 인간 줄기 세포 기반 질병 모델을 생성 하는 방법을 편집 곧 모든 줄기 세포 실험실에서 표준 및 일상적인 접근을 될 것입니다. 마지막으로, 정확한 게놈 편집 그것은 줄기 세포 질병 모델링 넘어가 수 만들고 잠재적으로 촉매 세포 기반 치료를 도울 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A16517</td>
			<td>Thaw on ice; S No: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco Life Tech</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>0.05%, 100 ml; S No: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td>Use 10 &#956;M; S No: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>S No: 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum replacement (KSR)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>S No: 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11960069</td>
			<td>1X; S No: 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Aliquot; S No: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1/100; S No: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>1/100; S No: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM, 1/1,000; S No: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td>S No: 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.1% Gelatin Solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Incubate at 37&#186; C for 1 hour; S No: 12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA-4 antibody</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-21704</td>
			<td>1/100; S No: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-1-81 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4745S</td>
			<td>1/200; S No: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OCT4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5279</td>
			<td>1/1,000; S No: 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td>Keep cold; S No: 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202/A10042</td>
			<td>1/2,000; S No: 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028LS</td>
			<td>1X; S No: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>S No: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353078</td>
			<td>S No: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>S No: 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>S No: 23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picking hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-301</td>
			<td>S No: 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15&#160;ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>S No: 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>S No: 26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11360</td>
			<td>S No: 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>S No: 29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prigrow III medium</td>
			<td>ABM</td>
			<td>TM003</td>
			<td>S No: 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess&#8482; Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>S No: 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron X-ray system</td>
			<td>Faxitron</td>
			<td>CellRad</td>
			<td>S No: 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell Technologies</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>S No: 34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17104019</td>
			<td>1mg/ml stock; S No: 35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>S No: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC qualified matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td>Stock 10 ug/ml; S No: 38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>4% stock in PBS; S No: 39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-1-60</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-21705</td>
			<td>1/100; S No: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG</td>
			<td>ReproCELL</td>
			<td>RCAB0004P-F</td>
			<td>1/100; S No: 41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td>S No: 42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase kit</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>00-0055</td>
			<td>S No: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>CP01-50</td>
			<td>Thaw and aliquot; S No: 44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat or donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663/G9023</td>
			<td>S No: 45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>S No: 46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>S No: 47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9285-100ML</td>
			<td>S No: 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>S No: 49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td>S No: 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td>S No: 51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega Shortscript T7 kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM1354</td>
			<td>S No: 52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega Clear kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>S No: 53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMC4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354357</td>
			<td>S No: 54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7159</td>
			<td>S No: 55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneJET cloning kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1232</td>
			<td>S No: 56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzerTM</td>
			<td>Advanced Analytical</td>
			<td></td>
			<td>S No: 57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Warm to room temperature; S No: 58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium mFreSR&#8482;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5855</td>
			<td>S No: 59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium CryoStor&#174;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>S No: 60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEFs</td>
			<td>Globalstem</td>
			<td>GSC-6301G</td>
			<td>S No: 61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030081</td>
			<td>S No: 62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cells</td>
			<td>ABM</td>
			<td>T0159</td>
			<td>S No: 63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#8482; Neural Induction Medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td>S No: 64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>S No: 65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27-insulin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>S No: 66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td>S No: 67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72552</td>
			<td>S No: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>S No: 69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 131</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10372019</td>
			<td>S No: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8761-100ML</td>
			<td>S No: 71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>S No: 72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Proliant</td>
			<td>68700</td>
			<td>S No: 73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDF8</td>
			<td>Pepro-Tech</td>
			<td>120-00</td>
			<td>S No: 74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1 antibody</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>AB9354</td>
			<td>S No: 75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-14033</td>
			<td>S No: 76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17 antibody</td>
			<td>R &#38; D systems</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>S No: 77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>S No: 78</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa 4D-nucleofector&#8482;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002</td>
			<td>S No: 79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II (cell sorter)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>SORP UV</td>
			<td>S No: 80</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation and editing of feeder-free ipscs from human pancreatic cells using the crispr-cas9 system

배아와 유도 만능 줄기 세포는 자기 갱신 하 고 신체의 여러 세포 유형으로 차별화 수 있습니다. 만능 세포는 따라서 재생 의료에서 연구를 위한 탐 낼 고 현재 안과 질환, 당뇨병, 심장 질환 및 다른 질환에 대 한 임상 실험에서. 다양 한 응용 프로그램에 대 한 iPSC의 게놈을 조정 하기 위한 추가적인 기회를 제공 하는 편집 기술 CRISPR/Ca 시스템을 포함 하는 게놈의 최근 발전을 함께 하는 특수 세포 유형으로 차별화 하는 잠재력 모델링, 유전자 치료, 몇 가지 이름을 차별화의 경로 바이어 싱 하는 질병을 포함 하 여. 사용 가능한 편집 기술, 연쇄 상 구 균 pyogenes 에서 CRISPR/Cas9 진 핵 게놈의 사이트 편집에 대 한 선택의 도구로 떠오르고 있다. CRISPRs, 저렴, 쉽게 액세스할 수 있으며 대상된 편집 공학에서 매우 효율적인. Cas9 nuclease 및 가이드 시퀀스 (20-메 르)는 3 뉴클레오티드 "NGG" protospacer-인접-모티브 (PAM) 보편적인 Cas9 바인딩 추적 RNA (함께 원하는 genomic 소재 시에 Cas9을 타겟팅에 대 한 인접 게놈 대상에 특정 시스템 요구 함께 라는 단일 가이드 RNA 또는 sgRNA). 여기에 우리가 현재는 단계별 급지대 및 발자국 무료 iPSC의 효율적인 생성에 대 한 프로토콜 및 게놈 iPSC Cas9 ribonucleoprotein (RNP) 단지를 사용 하 여 편집에 대 한 방법론을 설명. 프로토콜 편집 게놈 효과적 이며 Cas9 단백질 및 동시에 전달 하는 셀에 하나 이상의 대상에 대 한 사전 complexing sgRNAs에 의해 쉽게 다중화 될 수 있다. 마지막으로, 우리는 식별 및 원하는 수정 Ipsc의 특성화에 대 한 간단한 접근 방법을 설명합니다. 함께 찍은, 개요 전략 생성 및 iPSC 매니폴드 응용 프로그램의 편집을 능률적으로 예상 된다.

이 책에서 우리 통합 또는 발자국 무료 센다이 바이러스 벡터를 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서 iPSC의 세대에 대 한 간단 하지만 효율적인 프로토콜을 따라 했습니다. 그림 1A 이 재활 프로토콜의 도식 적인 표현을 보여준다. Prigrow III 매체에 경작 하 고 센다이 바이러스 위에서 설명한 대로 불리고 인간의 췌 장 세포가 상업적으로, 구매 되었다. 췌 ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System at JoVE.com

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

efficient-generation-editing-feeder-free-ipscs-from-human-pancreatic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.0K 조회수.  University of Maryland. 이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

비디오: Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

표피 성장 인자를 사용하여 인간의 췌장 암 세포의 유전자 전달 및 Transfection은 다행 기반 엔지니어링된 Nanovectors를 수용체 타겟

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

연구

생체공학

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. The introduced genetic material may integrate into the embryonic genome and generate transgenic animals with foreign genetic information following transfer of the injected embryos to foster mothers. Following the success in mice, PN injection has been applied successfully in many other animal species. Recently, PN injection has been successfully employed to introduce reagents with gene-modifying activities, such as the CRISPR/Cas9 system, to achieve site-specific genetic modifications in several laboratory and farm animal species. In addition to mastering the special set of microinjection skills to produce genetically modified animals by PN injection, researchers must understand the reproduction physiology and behavior of the target species, because each species presents unique challenges. For example, golden Syrian hamster embryos have unique handling requirements in vitro such that PN injection techniques were not possible in this species until recent breakthroughs by our group. With our species-modified PN injection protocol, we have succeeded in producing several gene knockout (KO) and knockin (KI) hamsters, which have been used successfully to model human diseases. Here we describe the PN injection procedure for delivering the CRISPR/Cas9 complex to the zygotes of the hamster, the embryo handling conditions, embryo transfer procedures, and husbandry required to produce genetically modified hamsters.

Pronuclear (PN) injection of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) system is a highly efficient method for producing genetically engineered golden Syrian hamsters. Herein, we describe the detailed PN injection protocol for the production of gene knockout hamsters with the CRISPR/Cas9 system.

CRISPR/Cas9 복잡 한 Pronuclear를 주입 하 여 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터의 생산

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive properties of in vitro transcribed (IVT) mRNA. With the help of IVT mRNA, the de novo synthesis of a desired protein can be induced without changing the physiological state of the target cell. Moreover, protein biosynthesis can be precisely controlled due to the transient effect of IVT mRNA.
For the efficient transfection of cells, nanoliposomes (NLps) may represent a safe and efficient delivery vehicle for therapeutic mRNA. This study describes a protocol to generate safe and efficient cationic NLps consisting of DC-cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as a delivery vector for IVT mRNA. NLps having a defined size, a homogeneous distribution, and a high complexation capacity, and can be produced using the dry-film method. Moreover, we present different test systems to analyze their complexation and transfection efficacies using synthetic enhanced green fluorescent protein (eGFP) mRNA, as well as their effect on cell viability. Overall, the presented protocol provides an effective and safe approach for mRNA complexation, which may advance and improve the administration of therapeutic mRNA.

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Here we describe a protocol for the generation of cationic nanoliposomes, which is based on the dry-film method and can be used for the safe and efficient delivery of in vitro transcribed messenger RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can trigger cerebellar dysfunction. Most of the current knowledge about disease-related neuronal phenotypes is based on postmortem tissues, which makes understanding of disease progression and development difficult. Animal models and immortalized cell lines have also been used as models for neurodegenerative disorders. However, they do not fully recapitulate human disease. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have great potential for disease modeling and provide a valuable source for regenerative approaches. In recent years, the generation of cerebral organoids from patient-derived iPSCs improved the prospects for neurodegenerative disease modeling. However, protocols that produce large numbers of organoids and a high yield of mature neurons in 3D culture systems are lacking. The protocol presented is a new approach for reproducible and scalable generation of human iPSC-derived organoids under chemically-defined conditions using scalable single-use bioreactors, in which organoids acquire cerebellar identity. The generated organoids are characterized by the expression of specific markers at both mRNA and protein level. The analysis of specific groups of proteins allows the detection of different cerebellar cell populations, whose localization is important for the evaluation of organoid structure. Organoid cryosectioning and further immunostaining of organoid slices are used to evaluate the presence of specific cerebellar cell populations and their spatial organization.

This protocol describes a dynamic culture system to produce controlled size aggregates of human pluripotent stem cells and further stimulate differentiation in cerebellar organoids under chemically-defined and feeder-free conditions using a single-use bioreactor.

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

CRISPR/Cas9 게놈 편집을 위한 옥수수 Planthopper, Peregrinus maidis, 배아의 미세주입

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

시험관 내 췌장 혈통을 향한 인간 치과 펄프 줄기 세포의 유도

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...