We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.

젤라틴 단백질 혼합물에 성장 3D 카코 2 세포 배양 : 카코 2의 3D 문화 시스템에 소장 전송기 1. 연구 <ol><li> 해동 성장 인자는 8 시간 동안 얼음에 젤라틴 단백질 혼합물을 감소 (또는 O / N) 4 ℃에서. 일단 1 mL를하거나 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 사용하거나 보관 500 μL 씩을, 해동. </li><li> 문화의 날, 얼음에 문화 (RNA 및 단백질 추출을위한) 판 또는 (면역 염색 용) 챔버 슬라이드를 사전 냉각. 여덟 잘 챔버 유리 슬라이드 (또는 6 웰 플레이트의 웰 당 120 μL)의 각 웰에 젤라틴 단백질 혼합물의 30 μL를 추가하고 균일하게 확산. 과정에서 기포가 발생하지 않도록주의하십시오. </li><li> (15) 37 ℃에서 세포 배양 용 인큐베이터 안에서 슬라이드 / 플레이트 플레이스 - 30 분, 젤라틴 단백질 혼합물을 응고 할 수있다. </li><li> 젤라틴 단백질 혼합물이 응고하는 동안, 카코 -2 세포의 합류 플라스크를 Trypsinize. </li><li> 수를 계산세포의 5 분 탁상 원심 분리기 500 XG에서 그들을 스핀. 필요한 3D 카코이 배지에서 세포 펠렛을 다시 일시. </li><li> (플레이트 잘 당 20,000) 잘 4,000 세포에서 유리 챔버 슬라이드를 시드. 세포를 37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 성장 가습 할 수있다. 4 D - 매체 매 3을 변경합니다. </li></ol> 3D 카코이 세포의 상피 전송기 2. 면역 형광 염색법 : 1 일 <ol><li> 배지를 흡인하고 RT에서 30 분 동안 (NaOH로 8.5로 조정하여 pH PBS)에서 2 % 파라 포름 알데히드 400 μL (PFA)으로 세포를 고정한다. 주 : PFA 용액을 39 ° C에서 이상 1 주간 저장해서는 안되며 갓 만든 용액을 사용할 수있다. 주의 : PFA는 매우 독성 및 잠재적 인 발암 물질이다. 항상 화학 후드주의 및 개인 보호 장비를 사용하여 그것을 처리 할 수 ​​있습니다. </li><li> (1X PBS로 두 번 우물을 씻어 PBS에 4 ° C에서 슬라이드를 저장하는 400 μL /잘). 일단 고정, 최대 일주일 동안 4 ° C에 저장합니다. </li><li> RT로 챔버 슬라이드 (이는 젤라틴 단백질 혼합물 층을 경화하고, 세척 단계 동안에 흡하기 쉽게 만들) 가온. </li><li> 더 이상 15 분 동안 PBS에서 0.5 % 트리톤으로 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> PBS-글리신 완충액 (130 mM의 염화나트륨, 7 밀리미터 나 2 HPO 4, 3.5 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 100 mM의 글리신)을 준비합니다. RT에서 10 분마다 1X PBS-글리신과 함께 배를 씻어. </li><li> 면역 완충액 (IF)를 제조 하였다 : 130 mM의 염화나트륨을 7 밀리미터 나 2 HPO 4, 3.5 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 100mM의 글리신, 7.7 mM의 NaN이 3, 0.1 % BSA, 0.2 % 트리톤-100, 0.05 % 트윈 -20 . </li><li> IF의 워시 배 실온에서 10 분마다 버퍼. 5 %의 블록 IF 버퍼에 정상 염소 혈청 (NGS). IF + 1 % 염소 혈청 희석 차 항체, 200 μL에 품어 / 웰, 1 - 실온에서 2 시간. 10 분마다 IF 버퍼 3 배 씻으시오. </li><li> 이차 항에 품어본체 (1 : 200)을 실온에서 1 시간 동안, IF + 1 % NGS 200 μL / 웰의 희석. </li><li> 10 분마다 IF 버퍼로 3 회 씻는다. 이 단계에서 어둠 속에서 슬라이드를 유지합니다. 가장자리 연락처 우물의 가장자리까지 홀더를 통해 흰색 리프터 검은 색 홀더에 챔버 슬라이드를 배치하고 슬라이딩하여 유리 슬라이드에서 플라스틱 챔버를 들어 올립니다. 조심스럽게 챔버 (홀더 및 리프터는 문화 슬라이드와 함께합니다)를 잡아 당깁니다. </li><li> 느린 안티 - 페이드 매체를 탑재하고 실온에서 10 분간 건조 할 수 있습니다. </li><li> 완전히 건조되면, 매니큐어 및 공 초점 현미경과 이미지를 함께 슬라이드를 밀봉. 2 주 또는 몇 달 동안 -20 ° C에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장합니다. </li></ol> 3D 카코 -2 세포 3. RNA와 단백질 추출 <ol><li> 이러한 TGF-β1의 같은 시험 제제와 함께 14 일 (10 NG / ㎖, 1H) - (12) 젤라틴 단백질 혼합물에서 배양 세포를 처리한다. </li><li> 치료 후 1 셀을 씻어X PBS. 30 분은 젤라틴 단백질 혼합물을 액화하는 얼음에 세포를 유지합니다. </li><li> 냉장 PBS로 우물을 세척하고 각각의 원심 분리기 튜브에 세포를 수집합니다. 500 × g으로 10 분간 4 ℃에서 저속 원심 분리하여 세포를 수집한다. 표준 절차를 사용하여 RNA를 추출하고 실시간 RT-PCR을 사용합니다. </li><li> 단백질 추출을 위해, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (1X)로 보충 된 세포 용해 완충액을 사용하여 세포를 용균. 펠렛을 세포 용해 완충액을 첨가 한 후, 초음파 처리로 세포를 용균 및 7,500 × g으로 10 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 세포 파편을 제거한다. </li></ol> Ussing 챔버 활용 마우스 회장의 5-HT 통풍 관 4. 측정 : 창자 준비 및 Seromuscular 스트립 댄스 <ol><li> 안락사 후, 쥐를 해부하고 (위 후 맹장 전) 작은 창자를 제거합니다. 세 부분으로 소장을 나눈다. 중간 제를 폐기 근위 제를 사용공장으로, 그리고 회장 등 원위 세 번째를 사용합니다. 상피의 손상을 방지하기 위해 장간막 첨부 파일에서 장을 당겨하지 마십시오. 얼음처럼 차가운 크렙스 - 링거 중탄산 (KBR) 버퍼를 덮어 조직 섹션 감기를 유지합니다. </li><li> 세로로 가위를 사용하여 장을 엽니 다. KBR은 seromuscular를 제거하기 전에 10 분 동안 1 μM의 인도 메타 신 (indomethacin)를 포함하는 가스를 발산, 얼음처럼 차가운에서 갓 절제 장 섹션을 품어. </li><li> 7 % 아가 로스 또는 경화 된 실리콘 엘라스토머 (0.5 cm 두께)를 포함하는 플레이트에 아래 장내 부 (길이 1 ~ cm) 점막 측에 핀. </li><li> 바닥 조명 해부 실체 현미경 하에서 seromuscular 층을 제거. 깃털 메스 블레이드를 사용하여 seromuscular 층을 잘라. 소장의 길이 방향 축을 따라 층의 에지를 얻는 미세 집게를 사용한다. 참고 : 제거 절차 동안, 실체 현미경의 바닥 조명 파이어 판으로 영역을 파악하고 방지하는 데 도움이에스. </li><li> seromuscular 탈기 종료 후, 반 Ussing 챔버의 핀을 잘 점막 마운트. 전체 과정 동안, 찢어지지 않도록 가장자리에 의해 제거 점막 조직을 유지하도록주의하십시오. </li></ol> 5. 평형 및 조직 치료 <ol><li> Kreb의 용액 조제 : 115 mM의 염화나트륨, 25 mM의 NaHCO3을을 2.4 mM의 K 2 HPO 4, 1.2 mM의 CaCl2를 1.2 밀리미터의 MgCl 2, 95 % O 2 / 5 %로 가스실 pH가 7.4에서 0.4mm의 KH 2 PO 4, 37 ° C에서 CO 2. 삼투압 균형을 유지하기 위해 점막 화장실에 에너지 기판과 10 mM의 만니톨로 사용하기 위해 장막 욕조에 10 mM의 포도당을 추가합니다. 참고 Kreb의 용액을 세포 내 5-HT의 열화를 방지하기 위해 L 아스코르브 산 (100 μM) 및 질라 (100 μM, 모노 아민 옥시 다제 억제제)로 보충된다. </li><li> 꼭대기 (내강)시 모두 노출 챔버로 슬라이더를 삽입드와 Kreb의 솔루션에 대한 조직의 기저 (장막) 측. </li><li> 10 분의 평형 기간 후, J 밀리 초 (점막 - 투 - 장막 플럭스)의 정점 측에 30 분 동안 플루옥세틴 (10 μM)과 회장 조직을 전처리. </li><li> 기저 측에서 1 시간 동안 TGF-β1 (10 NG / mL)로 조직을 치료하고 근단 측에서 30 분 동안 3의 H] -5-HT (20 ㎚)와 함께 배양한다. </li></ol> 장막 플럭스 (J 밀리 초) 및 3의 H] 티슈에 -5-HT의 축적에 점막의 6 정량화 <ol><li> 액체 섬광 계수기의 방사능을 측정하고 점막 - 투 - 장막 (J 밀리 초) 유동 비율을 계산하기 위해 (총 5 ㎖의)에 장막 저수지에서 0.75 mL를 분취 액을 수집; 플루옥세틴에 민감한 플럭스는 3 [H] -5-HT 흡수를 SERT이 매개 나타냅니다. </li><li> 장막 측과 재에서 샘플을 채취, 플럭스 기간 동안 점막에서 수압 차이를 방지하려면목욕 매체의 동일한 볼륨에 배치합니다. 참고 : 플럭스 계산은 최종 샘플 (4.25 ㎖ / 5 ㎖ = 0.85)의 희석 수정합니다. </li><li> 3의 H] 조직에 축적 -5-HT의 정량화를 들어, 슬라이더에서 점막을 분리 얼음처럼 차가운 KRB 버퍼로 한번 씻어, 유리 문화 튜브에 넣습니다. </li><li> 밤새 37 ° C에서 10 % KOH 0.5 ㎖의 점막 부화. 액체 섬광 계수기를 사용하여 (삼중)에 용 해물을 150 μL 씩의 방사능을 측정한다. </li><li> 브래드 포드 (Bradford) 방법을 이용하여 단백질 농도를 측정 해물의 - (5 μL 3) 분취 량을 사용한다. 주 : 방사성 세로토닌을 함유하는 배양 배지 10 mL를 표준으로 사용된다. 5-HT는 pmol의 / mg protein / min으로 산출되는 조직에서 유지. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

장내 트랜스 10, 11, 12, 13, 14, 15 공부 상피 단층 편광으로 완전히 분화 카코 -2 세포 단층을 광범위하게 사용되어왔다. 그러나, 장 상피 세포의 생체 조직을 모방하는 3 차원의 카코 -2 문화의 발달에 상당한 관심이 있었다. 장 상피 세포에 대한 3 차원 ...

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Arivarasu N. Anabazhagan
to:
Arivarasu N. Anbazhagan

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Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

장 상피 세포는 루멘에 유체의 분비 및 이온 다양한 수송 단백질 (채널, -ATPase를, 공동 운송 및 기) 영양소, 전해질의 흡수에 이르기까지 다양한 기능을 수행하고, 마약을 갖추고있다. 수송 단백질이 방식의 vectorial 이온 또는 분자의 이동을 허용하는 전기 화학적 구배를 생성한다. 이것은 편광 상피 세포의 정단 및 기저 세포막 반송 시스템의 비대칭 분포에 의해 달성된다. 또한, 인접하는 상피 세포 밧줄 단단한 접합부는 꼭대기 및 기저 멤브레인 도메인 사이 intramembrane 성분의 확산에 대한 장벽으로서이 과정에서 중요한 역할을한다. 네이티브 소장의 이러한 특징적인 기능을 흉내 낸 적합한 모델 시스템 (즉, 극성, 분화, 꽉 접합 무결성)은 능의 연구에 중요한상피 교통 시스템의 된 스위치들. 모델에 관해서는, 장 상피 전송 연구에 현재 사용되는 전형적인 세포주는 카코이 완전히 분화의 모델이다 소장 상피 세포를 흡수; 및 T-84 세포 또는 HT-29 서브 클론, 토굴에서 파생 된 큰 장 상피 세포 하나의 모델. 통상적으로, 이러한 세포 라인은 플라스틱 표면에 단일 층 또는 코팅 된 트랜스 웰 인서트에서 재배된다. 어느 정도 트랜스 웰 세포 배양 인서트 편광 세포 basolaterally 공급할 수 있도록하여 생체 내 환경을 닮은. 그러나, 종래의 2 차원 배양 시스템에 제한은 세포가 인공 편평하고 단단한 표면에 적응하도록 강요된다는 것이다. 따라서, 원시 상피 생리 복잡성 정확하게 차원 시스템에 반영되지 않는다. 이 제한은 예컨대 젤라틴 단백질 mixtur 같은 특정 미세 차원에서 세포를 성장하는 방법에 의해 극복되었다즉, 세포 외 매트릭스 성분 (2, 3)의 종류를 포함. 그럼에도 불구하고, 체외 배양 여러 세포 유형과 장내 영역 특정 구조를 갖는 장 상피의 복잡성을 시뮬레이션 할 수있다. 따라서, 세포 배양 모델을 이용하여 연구를 기본 대장에 추가 검증을 요구한다. 체외 3D 세포 배양 및 마우스 장 점막을 사용하여, 우리는 장 세로토닌 수송 (SLC6A4, SERT)의 조절을 연구하기 위해 여기에 간단한 방법을 설명합니다. 의존적 과정 - SERT 수송이 급격히 나 + / CL을 통해 운반하여, 중요한 호르몬 및 신경 전달 물질 5- 하이드 록시 (5-HT)의 세포 외 가용성을 조절한다. SERT는 항우울제의 알려진 대상 최근 설사와 장의 염증과 같은 위장관 질환의 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다.방법은 장내 상피 세포에서 5-HT의 흡수가 이전에 기술 된 조사합니다. 예를 들어, 플라스틱 또는 투과성 지지체 인서트 성장 카코 -2 세포는 정단 및 기저 영역에서 모두 4 플루옥세틴 성 3 H-5-HT 흡수를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 인간 장기 기증자 소장으로부터 제조 된 절연 브러시 테두리 막 소포 (BBMVs)에 SERT 함수의 측정은 또한 우리 (5)에 의해 설명되었다. 인간 BBVMs 3 H-5-HT 흡수는 플루옥세틴 성 및 나트륨 + / CL 것으로 나타났다 - 의존성과는 300 K에서 5 nM의 m 포화 동력학을 나타내었다. 유사한 방법을 활용, 우리는 이전에 마우스 장 BBMVs 6 세 H-5-HT 흡수로 SERT 기능을 측정 하였다. 그러나, 순수한 세포막 소포의 제조 조직 점막 많은 양을 필요로한다. 예 radiog 같은 다른 방법3 H-5-HT 흡수 사이트의 raphic 시각화는 또한 기니 돼지와 쥐 소장 (7) 이전에 표시되었습니다. Ussing 챔버 여러 상피 조직에 걸쳐 이온, 영양분, 약물의 이동을 측정하는 이상의 생체 시스템을 제공한다. Ussing 챔버 기술의 주요 장점은 그대로 편광 장 상피의 전기 및 전송 파라미터의 정확한 측정을 가능하게한다는 것이다. 또한, 내장 신경 근육 시스템의 영향을 최소화하기 위해, 장 점막의 seromuscular 박리는 상피 8 수송의 조절을 조사하기 위해 수행 될 수있다. 우리는 젤라틴 단백질에 3D로 성장 카코이 세포는 별개의 혀끝과 기저 마커를 발현하는 중공 루멘을 형성하는 것을 보여줍니다. 이 세포들은 2D 카코이 세포에 비해 SERT의 높은 표현을 보여줍니다. 방법 3D 세포를 성장하고 퍼가기하기rform의 면역 염색 또는 RNA 및 단백질 추출 기술되어있다. 또한, 우리는 Ussing 챔버 기술을 이용하여, 소장 점막 TGF-β1하는다면 발현 성 시토 킨에 의해 SERT 및 규제 기능을 연구하는 방법을 설명한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; HTB&#173;37&#8482;</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microsope for confocal Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3[H]-5-HT&#160;</td>
			<td>LabtekII</td>
			<td>152453</td>
			<td>Culturing cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2- 5%Co2 cylinder</td>
			<td>KPL</td>
			<td>71-00-27</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (for Agar plates)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Acute toxicity, Ora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (for electrode)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126-1KG</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorPhalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Harmful if swallowed or if inhaled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCo2 Cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8806-5G</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis Buffer&#160;</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chabered slides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type-1Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Used as Extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoxetine</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Gentamicin</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>Cell culture Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter&#160;</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>70013--032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710 Meta</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>EM-CSYS-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>P2304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>VCC MC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>DM MC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Voltage/current Clamp</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>P2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>P2023-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>BP1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>P288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strp</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>10420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>MEDOX, Chicago, IL&#160;</td>
			<td>style G- 12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA easy Mini kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Electrode Input Module&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliders for snapwell Chambers</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>H9523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>F132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>T7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Perkin-Elmer,Waltham, MA</td>
			<td>NFT1167250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Packard Instruments, Downers Grove, IL</td>
			<td>B1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ussing Chamber (chamber only)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ussing Chamber Systems</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study epithelial transport protein function and expression in native intestine and caco-2 cells grown in 3d

장 상피 세포는 이물질에 대한 장벽을 제공하면서 신체의 정상적인 생리 기능에 중요한 역할을 중요 전송 및 장벽 기능이 있습니다. 손상된 상피 전송 (이온 영양 또는 약물)는 많은 질환과 관련되어 있으며, 상피 무결성 및 장내 마이크로 바이 영향으로 같은 컨베이어의 정상적인 생리 학적 기능을 넘어 연장 결과를 가져올 수있다. 기능 및 수송 단백질의 조절을 이해하는 것은 개선 된 치료 적 개입의 발전을 위해 중요하다. 상피 수송의 연구에서 가장 큰 문제는 네이티브 장 상피 세포의 중요한 기능 되풀이되었습니다 적합한 모델 시스템을 개발하고있다. 예컨대 카코-2, T-84, 및 HT-29 세포 Cl.19A 여러 시험 관내 세포 배양 모델은 일반적으로 상피 전송 연구에 사용된다. 이 세포주는 전자를 모델링에 환원 접근 방식을 나타냅니다pithelium 및 상피 미생물 작용들의 검사를 포함한 다양한 역학적 연구에서 사용되어왔다. 그러나, 세포 단일 층 정확하게 세포 - 세포 상호 작용과 생체 내 미세 환경을 반영하지 않습니다. 3D에서 자란 세포는 약물 투과 연구 모델 유망한 것으로 도시 하였다. 우리는 3 차원의 카코 -2 세포는 상피 수송을 연구하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 카코 2 세포 연구는 세포 특정 효과를 배제하고 계정에 기본 대장의 복잡성을 다른 모델로하고 있습니다 것이 중요하다. 여러 방법들이 이전에 이러한 절연 상피 세포 또는 절연 세포막 소포에 everted SAC와 같은 흡수 수송의 기능을 평가하기 위해 사용되었다. 모델에 대한 및 수송 기능의 측정을 고려하여 현장에서 문제를 가지고, 여기에서 3D 카코 -2 세포 성장과 같은 Ussing 챔버의 사용을 설명하기위한 프로토콜을 보여효과적인 접근법은 그대로 편광 장내 상피 같이 세로토닌 수송을 측정한다.

3D 카코 2 낭종의 면역 염색은 그림 1과 같다. 팔로이 딘의 굴지 염색 차원 낭종에 잘 경계가 루멘을 나타내는 XY 평면의 대표적인 이미지는도 1a에 도시되어있다. 루멘에 직면 측면은 혀끝의 측면이다. 강력한 상피 표현형의 3D 환경의 결과에서 배양 상피 세포. 액틴과 SERT 공동 염색 하루 12에 다른 카코 2 낭종은 그림 1B에 표시됩니다. XY...

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Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

우리는 3 차원으로 성장 카코 -2 세포를 시험관 내 세포 배양 모델 및 마우스 창자의 생체 모델을 이용하여 장내 세로토닌 운반체 (SERT) 기능과 발현의 조절을 연구하는 간단한 방법을 설명한다. 이러한 방법은 다른 상피 수송의 연구에 적용 할 수있다.

방법은 3D로 재배 원주민 소장과 카코 2 세포에서 상피 전송 단백질의 기능과 발현을 연구하는

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

methods-to-study-epithelial-transport-protein-function-expression

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K 조회수.  University of Illinois at Chicago.  우리는 3 차원으로 성장 카코 -2 세포를 시험관 내 세포 배양 모델 및 마우스 창자의 생체 모델을 이용하여 장내 세로토닌 운반체 (SERT) 기능과 발현의 조절을 연구하는 간단한 방법을 설명한다. 이러한 방법은 다른 상피 수송의 연구에 적용 할 수있다. 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Explants에서 들어라 기본 인간 기관지 상피 세포

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

정제 된 야생형과 돌연변이 체 CFTR 단백질의 기능의 재구성 및 채널 활동 측정

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

소장에 의해 지질 전송을 연구하기 위해 카코 2 셀을 사용하여

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...