장 장벽 무결성을 조사하기 위해 마우스 소장 오르간노이드의 장 장벽 무결성을 측정하는 방법을 개발했습니다. 대조적으로, 우리는 사용되는 단층 세포 배양을 참조, 우리의 분석은 3 차원 작은 장 오르가노이드를 기반으로합니다. 우리의 모델에 2 차원 분석체를 적응하는 것은 실용성에 필수적이었다.
분석체는 시험관내에서 배양된 오르가노이드를 기반으로 하며, 그 적용은 장 장벽 무결성의 유도제 및 억제제를 정의하는 데 도움이 될 것이다. 단단한 접합 단백질의 규정은 모든 상피 세포의 중요한 특징입니다. 우리의 분석은 상피 장벽 무결성의 기능과 분석을 가능하게합니다.
장 조직에서 분리된 오르가노이드의 장벽 무결성을 측정하기 위해, 먼저 모든 플라스틱 표면을 커버하기 위해 PBS에서 충분한 0.1%BSA를 사용하여 도금 과정에서 오르가노이드를 저장하는 데 사용되는 모든 원심분리 튜브를 미리 코팅합니다. 즉시 BSA 용액을 제거하고 얼음에 튜브를 배치합니다. 다음으로, 세포 매트릭스 용액 및 오르가노이드 배양 배지를 얼음에 해동하고 48웰 의 각 웰에서 배양 배지를 신중하게 제거한다.
세포 행렬을 용해하기 전에 차가운 PBS 1 밀리리터로 각각 잘 씻으세요. 비교적 균일한 세포 현탁액이 얻어지면, 원심분리에 의해 신선한 PBS로 오르가노이드를 두 번 세척하고 각 오르가노이드 배양을 차가운 매체의 40 마이크로리터로 재보종한다. 10 마이크로리터 파이펫 팁을 통해 대형 오르간구 구조를 5회 분리하여 40~60마이크로미터 크기의 구조물을 수집하고 각 오르가노이드 서스펜션을 갓 준비된 셀 매트릭스 솔루션 40마이크로리터와 혼합합니다.
각 오가노이드 세포 매트릭스 용액 서스펜션을 8개의 잘 챔버커버슬립의 개별 우물 중앙에 넣고 슬라이드를 아이스팩에 5분간 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 슬라이드를 섭씨 37도 및 5%의 이산화탄소를 20분 동안 배치하여 유기성 세포 매트릭스 구조의 중합화를 가능하게 한 후 세포 배양배기에서 24시간 배양하기 위해 각 웰에 150마이크로리터의 오가노이드 배양 배지를 첨가한다. 인큐베이션의 끝에서, 48 시간 동안 재조합 뮤린 인터페론 감마의 밀리리터 당 10 나노 그램으로 긍정적 인 제어 우물을 치료한다.
투과성 분석기를 수행하기 위해, 실내 커버슬립을 반전된 공초점 현미경의 37도 온난한 인큐베이션 챔버로 옮기고 챔버의 이산화탄소를 현미경 단계에 단단히 고정시키고 현미경의 이미징 설정을 조정하여 챔버의 한 우물에서 오르간로이드를 시각화한다. 그런 다음, 현미경 챔버에서 1 시간 배양을 위해 중간 크기의 150 마이크로 리터에서 1 50 마이크로 리터에 갓 준비 된 100 밀리머 루시퍼 옐로우의 3 개의 마이크로 리터를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 기준 오르간노이드의 루멘을 시각화하고 루시퍼 노란색 여기에 필요한 레이저 에너지와 악기의 각각의 검출 감도를 정의하여 사용 가능한 동적 범위의 30~40%에서 루시퍼 노란색 신호를 이미지화한다.
대안적으로, 신호 강도는 노출 시간을 변경하여 수정될 수 있다. 차동 간섭 대비 라이브 이미징에 의해 커버슬립 표면에 가까운 구형 구조를 가진 약 10개의 오르가노이드의 위치를 찾으려면, 비슷한 직경의 오르가노이드를 포착하고 루멘을 이미지화하기 위해 오르가노이드의 중앙 조각에 초점을 맞춘다. 각 유기체의 모양과 자동 형광을 문서화하기 위해 모든 위치의 차동 간섭 콘트라스트 및 루시퍼 노란색 형광을 기록합니다.
모든 오르가노이드가 이미지되었을 때 루시퍼 옐로우를 포함한 150마이크로리터의 미디엄을 루시퍼 옐로우 트리트먼트 웰에 추가하고 70분 동안 5분마다 모든 우물을 이미지화합니다. 이미징 세션이 끝나면 갓 준비된 EGTA 4마이크로리터를 100마이크로리터의 미디엄에 추가합니다. 희석된 EGTA를 적절한 우물에 추가합니다.
그런 다음, 30 분 동안 5 분마다 각 우물에 오르가노이드의 형광을 기록합니다. 세포 생존력과 무결성이 분석의 성공을 위한 전제 조건이기 때문에 취급 및 문화 또는 오르가노이드를 사전에 연습해야 합니다. 본 대표적인 실험에서, 루시퍼 옐로우 인트라루컬 루시퍼 옐로우 형광으로 70분간의 치료 후 인터페론 감마로 치료된 야생형 동물의 오르가노이드에서만 볼 수 있었다.
자극되지 않은 대조군도, 인터페론 감마 수용체-2 녹아웃 동물에서 유래된 오르가노이드는 치료 기간이 끝날 때 장루 루시퍼 황색 형광을 보였다. EGTA의 첨가는 단단한 접합 공동 인자를 격리하여 장 장벽 무결성의 특이한 붕괴를 일으켰으며, 그 결과 오리퍼 옐로우 테이크업및 발현은 원산지 또는 치료 조건에 관계없이 모든 오르가노이드에서 복용 및 발현을 초래했습니다. 장기성 루멘 내및 각 오르가노이드 의 외부 의 루시퍼 노란색 형광 수준에 대한 상대 강도 값도 정량화 될 수있다.
구성주위에 비슷한 크기의 오르가노이드를 선택하고 설정 축을 선택하여 오르가노이드의 중앙 루멘을 상상할 수 있어야 합니다. 장 장벽 분해를 유발하는 물질을 사용하는 것 외에도 장 장벽 파괴를 억제하기위한 전략을 조사 할 수도 있습니다. 이 방법론은 단일 동물의 1 차 세포를 기반으로하므로 많은 해석에 사용할 수 있으므로 각 실험에 필요한 동물의 수를 줄입니다.
