Name: induction of an inflammatory response in primary hepatocyte cultures from mice
Uploaded: 2017-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
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이 작품은 NIH (R01HL128714 CF에) 및 (KS에 F31DK10236101)와 미국 심장 협회 (CF와 AG)에 의해 지원되었다.

모든 동물 프로토콜과 실험 절차는 의학의 마이애미 밀러 학교의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 1. 준비 <ol><li> 데우고 간 관류 미디어 간 37 ℃에서 수욕 미디어 다이제스트. </li><li> 관류 펌프 (30 mL / 분)를 설정합니다. 조심스럽게 간 관류 미디어와 펌프의 배관 시스템을 미리 기입. 시스템의 모든 공기 방울을 피하고 정위 현미경을 준비합니다. </li><li> I 제조사의 프로토콜에 따라 콜라겐 타입을 사용 외투 세포 배양 접시. </li></ol> 2. 간 복구 <ol><li> 산소 / 흡입 이소 플루 란 (이소 플루 4 % / 2 L / min의 산소)를 이용하여 공여 마우스를 마취. <ol><li> 2-2.5 %의 이소 플루 란을 저하 또는 마취제를 주입하여 마취를 유지한다 (100 ㎎ / ㎏ 복강 신체 체중)과 자일 라진 (체중이 10 ㎎ / kg intraperitoneally). 연속 이소 플루 란 마취 케타민 혈압을 낮추고 간독성을 유발할 수 있기 때문에 바람직하다. </li></ol></li><li> 흡수 패드에 마취 마우스를 놓습니다. 접착 테이프로 마우스의 사지를 고정합니다. </li><li> 면도와 마우스의 복부를 소독하고 선명한 / 무딘 팁 수술 가위를 사용하여 간의 두개골 경계에 치골에서 복부 개복술을 수행합니다. 양측 복벽, 진동판의 꼬리를 절개. </li><li> 심하게 우측으로 부위를 이동하여 하대 정맥 (IVC)을 노출. 조심스럽게 멸균 솜 팁 면봉와 각도 팁 집게를 사용하여 IVC 주변의 지방 조직을 해부하다. </li><li> suprahepatic 다이어프램을 절개하고 선명한 / 날카로운 팁 미세 수술 가위를 사용하여 두 개의 횡 절개하여 흉강을 엽니 다. 흉부 IVC는 수술 실크 (5/0)를 사용하여 결찰. </li><li> 조심스럽게 바늘을 제거, 차폐 정맥 카테터를 사용하여 infrarenal IVC를 Cannulate관류 펌프를 연결하고 간을 관류 시작합니다. 제대로 수행 한 경우, 간은 즉시 희게하고 팽창하기 시작한다. </li><li> 미세 수술 가위를 사용하여 혈액 및 관류 미디어의 적절한 배수를 허용 정 맥 포털을 가로로 쪼개다. </li><li> 간 관류 매체의 약 30 ㎖로 간을 관류하고 용지 (30 ㎖)를 소화 간 전환. 관류 펌프를 끄고 관류가 완료되면 정맥을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 간의 중심 영역을 노출하고 간 로브를 연결하는 연결 조직을 찾습니다. 중앙 연결 섬유를 잡고 조심스럽게 자리에 간을 들고 모든 조직을 해부 살짝 간을 제거합니다. </li><li> 즉시 소화 매체 간 15ml를 함유하는 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원추형 튜브 간을 옮긴다. 참고 :이 단계에 대한 구체적인 타임 라인이 없습니다. 재관류 후, 간은 무균 세포 배양 후드에 전송을 위해 다이제스트 미디어에 남아 있습니다. 모든이야ubsequent 단계가 무균 환경에서 수행되어야한다. </li></ol> 세포의 3. 분리 및 치료 <ol><li> 세포 배양 후드 내 멸균 조직 배양 접시에 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원추형 튜브 함유 소화 매체 간을 옮긴다. </li><li> 멸균 포셉 사용하여 부드럽게 간의 네 로브 눈물. 제대로 수행 한 경우, 소화 매체 인해 간에서 간세포를 분리에 혼탁이 될 것이다. </li><li> 25 mL의 멸균 피펫 팁을 사용하여, 소화 조직 입자 및 세포 파편을 제거하기 위해 새로운 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 70 ㎛의 나일론 세포 여과기를 통해 혼탁 소화 매체 필터. </li><li> 반복 3.2 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 3.3 단계. 이는 간에서 잔류 간세포를 분리하여 지원한다. </li><li> 4 ℃에서 2 분 50 XG에 원심 분리기. 25 mL의 차가운 1X 세포를 다시 일시 중지 부드럽게 초과 세포 파편을 포함 뜨는을 기음과윌리엄스 &#39;중간 E. </li><li> 25 mL의 멸균 피펫 팁을 사용하여, 청소기 현탁액을 달성하기 위해 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 새로운 70 ㎛의 나일론 세포 여과기를 통하여 재 현탁액을 필터. </li><li> 반복 3.5 및 명확한 세포 현탁액을 얻기 위해 추운 윌리엄스 &#39;중간 E 1X를 사용하여 세 개의 추가 세척 3.6 단계를 반복합니다. </li><li> 최종 세척 단계 후, 흡 상등액 초과 균체 잔사를 제거했다. 다시 일시 중지하고 50 mL의 폴리 프로필렌 원뿔 관에 새로운 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 차 간세포 해동 및 도금 보충제를 포함 25 mL의 따뜻한 윌리엄스 &#39;미디어 E 1 배속에서 필터 세포. </li><li> 혈구를 사용하여 25 ㎖의 세포 현탁액 내의 셀 개수. 성인 간 당 2000 만 셀 - 평균적으로 15을 기대합니다. 트리 판 블루 염색을 사용하여 세포 생존을 결정합니다. </li><li> 콜라겐 코팅 6 잘 가전에 차 간세포 해동 및 도금 보충제를 포함 2 mL의 &#39;윌리엄스의 미디어 E 1 배속에서 플레이트 세포LL 문화 클러스터 (물론 당 9 × 10 5 세포). </li><li> 4 시간 후, 차 간세포 유지 보수 보충제를 포함 윌리엄스 &#39;미디어 E 1 배속 미디어를 변경합니다. </li><li> 24 시간 후, 혈청 둘 베코의 변형 이글 배지 (DMEM) 미디어 1 배 6 시간 동안 세포를 굶어. </li><li> 차량 FGF23 (25 NG / ㎖), LPS로 PBS로 세포를 처리 (100 μg의 / ㎖) 또는 무 혈청 배지에서 IL-6 (50 ng의 / ㎖) 및 24 시간 동안 배양한다. </li></ol> RNA 4. 분리 <ol><li> 제조업체의 지시에 따라 상용 스핀 컬럼 키트를 사용하여 RNA를 준비한다. </li></ol> 역전사에 의해 고립 된 RNA 5. 생성 된 cDNA <ol><li> PCR의 튜브에 고립 된 RNA 샘플의 200 NG를 추가합니다. </li><li> 단계 5.1에서 효소가없는 H 2 O PCR에 튜브 14 μL를 추가합니다. </li><li> 단계 5.1에서 PCR 튜브에 역전사 효소의 4 μL를 추가합니다. </li><li> 혼합물이 균일하게 부드럽게 내용을 다시 중단; 부드럽게 원심 분리기. </리&gt; <li> 열 순환기에 혼합물을 포함하는 PCR 튜브를 놓습니다. 실행 역전사에 대한 열 순환기 : 다음 25 ° C (5 분), 42 ° C (30 분)의 1주기, 85 ° C (5 분)와 4 ° C에서 개최합니다. 최종 제품은 원하는 cDNA를 할 것이다. </li></ol> 6. 정량적 실시간 PCR에 의한 세포의 분석 (qPCR에) <ol><li> 96 웰 플레이트를 준비합니다. <ol><li> 1 μL의 cDNA, 0.25 μM 정방향 프라이머, 0.25 μM 역방향 프라이머, 5 μL SYBR 녹색, 10 μL의 총 부피 3.5 μL PCR 등급 물 : 얼음에 qPCR에 반응의 모든 구성 요소를 배치합니다. SYBR 녹색을 사용하여, 세중의 모든 샘플을 실행하는 마스터 믹스를 준비합니다. </li><li> 마스터 믹스가 완료되면 소용돌이는 균질 확인합니다. 96 WLL 플레이트의 각 웰에 나누어지는 9 μL qPCR에의 마스터 믹스. 후 신중하게 잘 각각에 cDNA를 1 μL를 추가합니다. 총 반응 부피는 10 μL 될 것입니다. </li><li> 로딩이 완료된 후 광 96 웰 플레이트를 밀봉접착 필름 간단히 원심 분리기 96 웰 플레이트 (1 분 50 XG). </li></ol></li><li> 리얼 타임 PCR 기기에서 실행 샘플. 실시간-PCR 기기에 밀봉 된 96 웰 플레이트 및 장비 제조업체 권장 사항에 따라 실행 샘플을 놓습니다. 표준 및 빠른 사이클의 예는 아래에 포함되어 있습니다. <ol><li> 60 초 동안, 15 초 동안 다음, 120 초 동안 94 ° C에서 60 ° C를 94 ° C의 40주기를 초기 변성 한 다음 선택적으로 4 ° C에서 개최 : 표준 사이클 파라미터를 들어, 다음을 사용합니다. </li><li> 빠른 순환 매개 변수의 경우 : 5 초, 15 초 동안 58 ° C, 10 초 동안 다음 72 ° C에 대해 다음 30 초 동안 95 ° C의 40주기를 94 ° C에서 초기 변성 다음을 사용합니다. </li></ol></li><li> 데이터를 분석하는 방법에 대한 지침은 장비 설명서를 참조하십시오. </li></ol> ELISA에 의한 세포 상층 액 7. 분석 참고 : 제조사의 프로토콜에 따라 모든 단계를 수행합니다. </P&gt; <ol><li> 샘플 준비 <ol><li> 별도의 튜브에 희석제 398 μL를 분배. 398 μL 희석액 튜브에 세포 상층 액 샘플의 피펫 2 μL. 이것은 200의 희석 배를 제공 할 것입니다. </li><li> 각 샘플 단계를 반복 7.1.1 테스트 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 순서 <ol><li> 피펫 100 내지 200 배 희석 한 시료와 μL를 96 웰 플레이트의 웰에 표준. </li><li> 150 rpm에서 마이크로 플레이트 쉐이커상에서 45 분 동안 25 ° C에서 96 웰 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 우물을 1 배 세척 완충액으로 5 회 반복한다. 마지막으로 세탁이 완료되면, 흡수지 모든 잔여 세척액을 제거한다. </li><li> 각 웰에 HRP-복합 시약 500 μL를 추가합니다. </li><li> 7.2.3 - 반복 7.2.2 단계를 반복합니다. </li><li> 테트라 메틸 벤지딘의 피펫 100 μL (TMB) 96 웰 플레이트의 각 웰에 시약. </li><li> 부드럽게 마이크로 플레이트에서 20 분 동안 25 ° C에서 96 웰 플레이트 믹스150 rpm에서 진탕. 직접 각 웰에 정지 용액 100 μL를 첨가하여 반응을 정지하고 부드럽게 혼합한다. 정지 용액을 첨가 한 후에 색깔이 황색 회전한다. 이것은 정지 용액 정확하게 혼합되었음을 알린다. </li><li> 미세 적정 플레이트 판독기를 사용하여, 처음 5 분 이내에 450 nm에서의 광학 밀도를 결정한다. </li></ol></li><li> 결과의 계산 <ol><li> 각각의 샘플 및 각 표준에 대한 평균 흡광도 값 (A 450)의 표를 계산합니다. </li><li> NG에 표준 농도에 대한 각 기준의 450 평균 음모를 꾸미고하여 표준 곡선을 조립 / 선형 그래프 mL로. X 축이 농도 및 450의 값을 나타내는 Y 축를 대표 할 수있다. </li><li> (가) 각 희석 된 시료에서 450 의미 이용하여, 표준 곡선으로부터 NG / ㎖에서 목적 단백질의 농도를 결정한다. </li><li> 사실상 희석하여 샘플의 농도를 곱아르 자형. 이것은 세포 상등액 시료 중에 목적 단백질의 실제 농도를 결정하기 위해 허용 할 것이다. </li><li> 선 그래프로 샘플에서 구성된 테이블을 플롯. OD 450 값이 표준 곡선의 밖에있는 경우, 샘플을 적절하게 희석해야하고 다시 테스트. </li><li> 500,000 셀에 결과를 정상화. </li></ol></li></ol>

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저자는 선언하는 이익의 충돌이 없습니다.

마우스에서 차 간세포를 분리하면 염증 반응 생체를 연구하는 빠르고, 저렴하고 신뢰할 수있는 도구입니다. 정확하게 수행하면 결과가 쉽게 발생하고, 신속하고 비용 효율적인 방식으로 재생 될 수있다. 다음 사항을 신중 성공적인 차단을 보장하기 위해 평가되어야한다. 수술 절개와 IVC의 삽관은 전신 마취가 아닌 안락사 후 수행해야합니다. 젊은, 경험이 연구자는 쥐의 복부의 해부학 적 특징을 숙지하고 올바른 삽관을 수행하기 위해 처음에 더 많은 시간이 필요합니다. 기증자 동물이 살아 유지 관류 크게 분리 된 세포의 생존을 증가, 시작할 때까지. 그것은 상당히 고립 된 간세포의 수율을 증가하기 때문에 위에-간 IVC의 결찰이 수행되어야한다. 대안 적으로, 마이크로 수술 클램프는 IVC에 배치 될 수있다.그러나, 개흉술 다음, 동물은 몇 분 내에 사망하게 될 것이다. 따라서 모든 후속 단계는 간 관류 개시까지 충분한 혈액 흐름을 유지하도록 신속하게 수행되어야한다. 삽관를 들어, 개폐식 정맥 카테터의 사용은 매우 좋습니다. 하대 정맥을 cannulating 후 카테터 바늘 신중 혈관 천공의 위험을 최소화하는, 후퇴 할 수있다. 마지막 중요 단계는 카테터 관류 시스템에 연결된다. 카테터로부터 바늘을 제거한 후, 혈액 관류 펌프에 연결하기 전에 카테터의 단부로부터 배출한다. 이 단계는 양의 상당한 감소뿐만 아니라 고립 된 셀의 품질을 일으킬 수 공기 색전의 위험을 최소화한다. 관류 개시되면 간 즉시 균일 담황색 적색에서 색을 변경한다. 부품 남아있는 붉은 insuffic을 나타냅니다ient 관류 또는 공기 색전의 존재. 분리 된 세포의 세척 및 필터링 반복적으로 수행해야합니다. 이것은 과도한 세포 파편의 효율적인 제거를 보장한다. 건강한 고립 된 간세포 도금되는 최초의 4 시간 이내에 준수합니다. 따라서, 도금 매체는이 시점에서 유지 매체에 변경할 수있다. 밤새 배양 한 후, 세포는 저명한 핵으로 더 육각형 모양으로 나타납니다. 간세포는 양방향 핵 (그림 1A)를 할 수 있습니다. 과립 또는 세포에 blebbing은 가난한 분리를위한 지표이다. 간세포 연속적 올바르게 부착되지 또는 세포 생존을 낮게 유지하면, 관류에 사용되는 분해 매질의 양을 변경한다. 이 오버 피하거나 간 조직의 underdigestion한다. 세포의 높은 수율이 요구되는 경우, 문맥을 통해 관류 선행 성이 수행 될 수있다. Klaunig 등. 이 특별한 기술은 총 세포 수율을 증가시킬 수 있음을 보여 주었다. Alt 키ernatively의 IVC의 다음 포털 정맥 삽관 간헐적 물림쇠 적용 할 수있다. 이는 주기적으로 분리 된 세포의 수를 증가시킬 수 아마도 또한 관류시의 압력을 증가시킬 것이다. 관류 시간뿐만 아니라 혈류 속도는 14을 조정해야 할 수도 있습니다. 그러나 우리는 다른 관류 프로토콜을 수행하지 않았다. 제 성공적인 차단 후 (예 : 알부민) 간세포 특이 면역은 분리 (도 1B)의 순도를 보장하기 위해 수행되어야한다. 분리 후 24 시간은 간세포 혈청은 4 ~ 8 시간 동안 굶어 후 치료에 사용한다. 급성기 반응을 연구 할 때, 세포는 수신자 같은 수용체 4, NF-κB (15)를 통해 염증 반응을 유도하는 것으로 알려져 LPS로 처리 될 수있다. 이러한 IL-6과 같은 염증성 사이토 카인, 인터루킨 16 수용체를 통해 효과를 매개한다.또한, 우리는 최근에 FGF23가 FGFR4과 PLCγ / 칼시 뉴린 / NFAT 경로를 활성화하고 간 (7), (17)의 염증 반응을 유도 할 수 있음을 증명하고있다. 충분한 전사 및 표적 유전자의 번역을 보장하기 위해 세포는 24 시간 동안 치료를해야합니다. 세포 상등액의 ELISA와 함께 정량적 실시간 PCR을 사용하여 mRNA의 유전자 발현의 연속 분석을 분리하면 쉽게 반복 될 수 강력한 정보를 제공한다. 이 소설 염증성 매개체, 그 간 수용체 및 연속 다운 스트림 신호 메커니즘의 조사를 할 수 있습니다. 이러한 인 HepG2 세포로 Hep3B와 같은 일반 암 세포주에 비해, 특히 트랜스 제닉 동물로부터 분리 된 일차 전지는, 우수한 결과를 제공 할 것이다. 단순하기 때문에,이 방법은 또한 신규 한 약물의 효과를 조사하기 위하여 검사를 위해 사용될 수있다. 그럼에도 불구하고, 복잡한 약물 학적 또는 병리 - physiolo 공부학적 메커니즘은 주로 생체 설정에서 추가 확인 용 실험이 필요합니다. 격리 된 간세포가 며칠 내에 탈분화하는 경향이 있기 때문에 우리는 장기 연구를 수행하지 않았습니다. 등 (18)에 의해보고 그러나, 이것은 특별한 세포 배양 기술에 의해 극복 될 수있다. 이러한 콜라겐 이중 젤 구성, 간세포 구 상체, 내피 세포와 공동 배양 및 3T3-J2 섬유 아 세포와 미세 패턴 공동 문화를 포함한다. 함께 차 쥐의 성인 간세포의 분리는 대사 체학, 염증, 면역 및 약물과 독소에 간 반응에 관심이 과학자를위한 강력한 도구를 제공합니다. 그것은 단순한 가능성, 적당한 비용과 빠른 재현성을 특징으로한다.

만성 신장 질환 (CKD)는 급성 및 만성 염증 (1)의 상태로 정의 될 수있다. CKD 환자에서 phosphaturic 호르몬 섬유 아세포 성장 인자 23 (FGF23)의 혈중 농도가 점진적 혈청 인산염이 항상성을 유지하기 위해 증가. 증가 된 혈청 FGF23 수준은 독립적으로 혈액 투석 치료 3, 4를 시작하는 환자 중 심혈 관계 이환율과 사망률과 연관되어 있습니다. 또한, 여러 임상 연구 상승 FGF23 수준 및 C 반응성 단백질 (CRP), 인터루킨 6 (IL-6) 및 종양 괴사 인자 α (TNFα) (5), (6)의 혈청 레벨 사이의 강한 상관 관계를 보여 주었다. 또한, 실험 연구에서, 우리는 최근에 FGF23 직접 간세포를 대상으로하고 증가 CRP와 IL-6 페이지에 의한 염증 반응을 일으킬 수 있다는 것을 증명하고있다간 7 roduction. 따라서, FGF23는 CKD에 전신 염증에 기여하는 순환 요인으로 작용할 수 있습니다. 70 년대 초, 차 간세포는 고립되었다 처음으로 8 공부했다. 이후 일차 배양 된 간 세포는 광범위하게, 열 처리는 대사 호르몬 기능 약물 대사 및 독성뿐만 아니라 면역 및 염증 반응을 조사 구하는데 사용되어왔다. 이전 프로토콜은 주로 인간 간 조직 (11) (12)로부터 일차 간세포의 효소 격리 설명 하였다. 우수한 모델이지만,이 복합 간 시그널링 메커니즘뿐만 아니라 자극의 종류에 따라 기능적 결과에 미치는 영향을 연구하는 유전자 조작 능력을 남긴다. 이하에서, 우리는 기본 쥐 간세포의 단리를 설명. 특히, 예컨대 리포 폴리 사카 라이드 (LPS), IL-6와 같은 FGF23 간 급성 단계 반응의 여러 매개체의 효과는 쉽게 빠르고 재현성있는 방법 (13)에 분석 될 수있다. 여기서, 우리는 성체 생쥐에서 간세포의 효소 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 우리는 LPS 및 IL-6과 같은 FGF23 같은 신규 염증성 매개체로서 염증 확립 유도제는 직접 발현 및 분비를 자극 할 수 있음을 입증 이러한 배양 간세포 CRP 및 IL-6과 같은 염증성 사이토킨.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 &amp;mu;m Nylon cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Polypropylene Conical Tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>100 6-inch Cotton Tipped Applicators&amp;nbsp;</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6 well Cell Culture Cluster</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards)</td><td>LOOK</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 Perfusion Pump</td><td>Gilson</td><td>F155007</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer Kits, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-474</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer Cover Glasses, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-470</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissers - Sharp/Blunt</td><td>F.S.T.</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors-ToughCut Straight</td><td>F.S.T.</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS-45 Forceps</td><td>F.S.T.</td><td>11203-25</td><td></td></tr><tr><td>Student Tissue Forceps</td><td>F.S.T.</td><td>991121-12</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid solution, 2.0 N</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; A8976-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP 250 mL</td><td>Piramal Healthcare</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)</td><td>VEDCO</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 100 mg/mL</td><td>AnaSed Injection</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Willams&#039; Medium E (1x)</td><td>gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>Liver Perfusion Medium (1x)</td><td>gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td></td></tr><tr><td>Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements</td><td>Life Technologies</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Primary Hepatocyte Maintenance Supplements</td><td>Life Technologies</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>VWR</td><td>45000-717</td><td></td></tr></tbody></table>

induction of an inflammatory response in primary hepatocyte cultures from mice

간은 전신적인 염증 반응의 조절에 결정적인 역할을한다. 특히 만성 신장 질환, 간은 요독, 산화 스트레스, 내 독소 혈증 및 급성기 반응물의 대량 생산으로 염증성 사이토 카인 순환 감소 간격에 응답하여 반응한다. 염증 및 간세포의 기본 역할 실험 도구 연구는 만성 신장 질환으로 특히 복잡한 설정에서 규제와 간 사이토 카인의 기여 전신 급성 위상 응답 및 연장 염증성 시나리오를 이해하기 중요하다. 생체 내에서 염증의 복잡한 메커니즘을 연구하는 것은 도전 남아 있기 때문에, 리소스를 많이 사용하는 보통 및 형질 전환 동물의 사용을 필요로 차 격리 된 간세포는 간 급성 위상 응답으로 기계적인 통찰력을 얻을 수있는 강력한 도구를 제공합니다. 이 체외 기술은 적당한 비용을 갖추고 있기 때문에, 높은 재생산성 및 일반적인 기술 지식은 주 절연 간세포 쉽게 스크리닝 방법으로 사용될 수있다. 여기, 우리는 기본 쥐의 간세포를 분리하는 효소 기반의 방법을 설명하고, 우리는 ELISA 및 정량 실시간 PCR을 사용하여 이러한 세포에서 염증 반응의 평가에 대해 설명합니다.

조직학 기본 격리 및 배양 된 세포의 대표적인 광학 현미경 이미지는도 1a에 도시되어있다. 면역 조직 화학적 분석은 절연 간세포 높은 알부민 (적색)뿐만 아니라, 섬유 아세포 성장 인자 수용체 4 (FGFR4) (녹색)을 표현할 수 있음을 보여준다. 핵 4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) (파란색)로 염색된다. (그림 1B). 정량적 실시간 PCR 주 절연 간세포 FGF23 처리 (25 NG / ㎖) LPS 또는 IL-6, 24 시간 및 CRP 및 IL-6 mRNA의 수준 (50 NG / ㎖) 정량적 실시간 PCR에 의해 분석 하였다 (/ ㎖ 100 μg의) . FGF23, LPS 및 IL-6이 크게 CRP와 IL-6의 발현을 증가했다. (도 2a) 절연 일차 간세포의 세포 배양 상청액 CRP 수준에 대해 ELISA로 분석 하였다. PBS-처리 된 세포에 비해 우리의 정량적 실시간 PCR 분석, LPS와 라인에서, IL-6과 FGF23의 치료는 크게 세포 상층 액에서 CRP 수치를 증가했다. (그림 2B) <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55319/55319fig1.jpg" /> 그림 1 : 격리 된 쥐의 차 간세포의 (A) 위상 대비 현미경 이미지. 24시간 도금 후, 세포는 육각형 형상을 나타내고, 종종 이중 핵 나타난다. (= 100 μm의 스케일 바); (B) 면역 형광 현미경 분석은 분리 된 세포의 대부분 알부민 (적색), 간세포 특이 적 마커를 표현하는 것을 보여준다. 세포는 매우 FGFR4 (녹색)를 표현한다. DAPI는 핵을 얼룩. 원래 배율 (40)X. (스케일 바 = 50 μm의). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55319/55319fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55319/55319fig2.jpg" /> 그림 2 : 격리 된 쥐 차 간세포의 정량적 실시간 PCR 분석 CRP와 IL-6 발현을 결정합니다. PBS 처리 된 세포와 비교했을 때 (A) LPS는, IL-6, FGF23 치료 크게 CRP의 mRNA 수준을 증가시킨다. (값이 SEM ± 배의 변화로 표현; p &lt;0.01, N = 3 독립적 인 절연 부). PBS 치료에 비해 LPS로 처리 (B) 세포는 IL-6 또는 FGF23 또한 IL-6 mRNA 수준의 상당한 증가를 나타낸다. (값은 ± SEM 배 변화로 표현되고, p &lt;0.001, N = 3 독립 아이솔레이션) CRP 단백질 수준의 (C)에 정량효소 면역 분석법 (ELISA)에 의해 격리 된 쥐의 차 간세포에서 상층 액. PBS 치료에 비해 LPS, IL-6, CRP FGF23 크게 단백질의 수준을 증가시킨다. 값은 50 만 셀 당 밀리그램 / DL에서 CRP 농도를 나타냅니다. (p &lt;0.05, N = 3 독립 아이솔레이션). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55319/55319fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

여기서는 성인 마우스로부터 일차 간세포를 분리하는 효소 방법을 보여, 우리는 ELISA 및 실시간 PCR을 이용하여 염증 반응을 정량 설명한다.

마우스에서 차 간세포 문화에 염증 반응의 유도

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

induction-an-inflammatory-response-primary-hepatocyte-cultures-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K 조회수.  University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine.  여기서는 성인 마우스로부터 일차 간세포를 분리하는 효소 방법을 보여, 우리는 ELISA 및 실시간 PCR을 이용하여 염증 반응을 정량 설명한다. 

비디오: Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice

Autoimmune hepatitis is a rare but life threatening autoimmune disease of the liver of unknown etiology1,2. In the past many attempts have been made to generate an animal model that reflects the characteristics of the human disease 3-5. However, in various models the induction of disease was rather complex and often hepatitis was only transient3-5. Therefore, we have developed a straightforward mouse model that uses the major human autoantigen in type 2 autoimmune hepatitis (AIH-2), namely hCYP2D6, as a trigger6. Type 1 liver-kidney microsomal antibodies (LKM-1) antibodies recognizing hCYP2D6 are the hallmark of AIH-27,8. Delivery of hCYP2D6 into wildtype FVB or C57BL/6 mice was by an Adenovirus construct (Ad-2D6) that ensures a direct delivery of the triggering antigen to the liver. Thus, the ensuing local inflammation generates a fertile field9 for the subsequent development of autoimmunity. A combination of intravenous and intraperitoneal injection of Ad-2D6 is the most effective route to induce a long-lasting autoimmune damage to the liver (section 1). Here we provide a detailed protocol on how autoimmune liver disease is induced in the CYP2D6 model and how the different aspects of liver damage can be assessed. First, the serum levels of markers indicating hepatocyte destruction, such as aminotransferases, as well as the titers of hCYP2D6 antibodies are determined by sampling blood retroorbitaly (section 2). Second, the hCYP2D6-specific T cell response is characterized by collecting lymphocytes from the spleen and the liver. In order to obtain pure liver lymphocytes, the livers are perfused by PBS via the portal vein (section 3), digested in collagen and purified over a Percoll gradient (section 4). The frequency of hCYP2D6-specific T cells is analyzed by stimulation with hCYP2D6 peptides and identification of IFN&gamma;-producing cells by flow cytometry (section 5). Third, cellular infiltration and fibrosis is determined by immunohistochemistry of liver sections (section 6). Such analysis regimen has to be conducted at several times after initiation of the disease in order to prove the chronic nature of the model. The magnitude of the immune response characterized by the frequency and activity of hCYP2D6-specific T and/or B cells and the degree of the liver damage and fibrosis have to be assessed for a subsequent evaluation of possible treatments to prevent, delay or abrogate the autodestructive process of the liver.

Infection of mice with an Adenovirus expressing the major human autoantigen cytochrome P450 2D6 (hCYP2D6) recognized by sera of patients suffering from type 2 autoimmune hepatitis results in a persistent form of autoimmune-mediated liver disease characterized by extensive hepatitis, fibrosis and generation of a CYP2D6-specific immune response.

CYP2D6 동물 모델 : 마우스에 면역 간염을 유발하는 방법

Autoimmune hepatitis is a rare but life threatening autoimmune disease of the liver of unknown etiology1,2. In the past many attempts have been made to ...

연구

의학

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded elucidation of the underlying mechanisms and development of innovative immunotherapeutic strategies. To develop an ideal animal model recapitulating human HCC, immunocompetent male C57BL/6J mice first receive a carbon tetrachloride (CCl4) injection to induce liver fibrosis, then receive histologically-normal oncogenic hepatocytes from young male SV40 T antigen (TAg)-transgenic mice (MTD2) by intra-splenic (ISPL) inoculation. Androgen generated in recipient male mice at puberty initiates TAg expression under control of a liver-specific promoter. As a result, the transferred hepatocytes become cancer cells and form tumor masses in the setting of liver fibrosis/cirrhosis. This novel model mimics human HCC initiation and progression in the context of liver fibrosis/cirrhosis and reflects the most typical features of human HCC including immune dysfunction.

Here, we describe the development of a clinically relevant murine model of liver cancer recapitulating the typical immune features of hepatocellular cancer (HCC).

간 염증과 섬유증의 설정에서 발생하는 간세포암의 종양 성 간세포 유도 직교 마우스 모델

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

암 연구학

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well as to excrete bilirubin and other metabolic products. In the liver, the experimental obstruction of the extrahepatic biliary system initiates a complex cascade of pathological events that leads to cholestasis and inflammation resulting in a strong fibrotic reaction originating from the periportal fields. Therefore, surgical ligation of the common bile duct has become the most commonly used model to induce obstructive cholestatic injury in rodents and to study the molecular and cellular events that underlie these pathophysiological mechanisms induced by inappropriate bile flow. In recent years, different surgical techniques have been described that either allow reconnection or reanastomosis after bile duct ligation (BDL), e.g., partial BDL, or other microsurgical methods for specific research questions. However, the most frequently used model is the complete obstruction of the common bile duct that induces a strong fibrotic response after 21 to 28 days. The mortality rate can be high due to infectious complications or technical inaccuracies. Here we provide a detailed surgical procedure for the BDL model in mice that induce a highly reproducible fibrotic response in accordance to the 3R rule for animal welfare postulated by Russel and Burch in 1959.

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

마우스의 담관 결찰 : 폐쇄성 담즙에 의한 염증성 간 손상과 섬유화의 유도

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients with autoimmune hepatitis. The overwhelming majority of patients with DIH are women. The underlying mechanisms of these sex differences in prevalence are unclear because of the paucity of animal models that mimic human disease. Even so, underlying mechanisms are widely believed to be associated with human leukocyte antigen haplotypes and sex hormones. In contrast, using a DIH mouse model, we have uncovered that IL-4 initiated&#160;CD4+ T cells directed against an epitope of cytochrome P450 2E1 induces influx of neutrophils, macrophages and mast cells into the livers of female BALB/c mice. Using this model, we have also shown that IL-33-induced FoxP3+regulatory T cells confer protection against DIH in female and male mice. This DIH model is induced by immunizing mice with an epitope of CYP2E1 that has been covalently altered with a drug metabolite that has been associated with DIH. This epitope is recognized by patients with DIH. Our method induces robust and reproducible hepatitis and autoantibodies that can be utilized to study the pathogenesis of DIH. While in vivo studies can cause undue pain and distress in mice when done improperly, the advantage of an in vivo model is the ability to evaluate the pathogenesis of disease in a large number of mice. Additionally, biological effects of the altered liver proteins can be studied using invasive procedures. The addition of in vitro studies to the experimental design allows rapid repetition and mechanistic analysis at a cellular level. Thus, we will demonstrate our model protocol and how it can be utilized to study in vivo and in vitro mechanisms of DIH.

We describe an in vivo immunization, translational hepatitis model in BALB/c mice that can be utilized to study the pathogenesis of drug-induced autoimmune hepatitis including sex differences seen in this disease. We will describe how this model demonstrates reproducible analyses using in vivo and in vitro experimental techniques.

병원성 메커니즘 연구를위한 BALB / c 마우스에서 약물 유도,자가 면역 간염의 유도

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

면역학 및 감염병학

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, such as type 2 diabetes and nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Recent research has established that pro-inflammatory immune cells infiltrate obese hypertrophic adipose tissue and liver. Given the emerging importance of immune cells in the context of metabolic homeostasis, there is a critical need to quantify and characterize their modification during the development of type 2 diabetes and NASH. However, animal models that induce pathophysiological features typical of human NASH are sparse.
In this article, we provide a detailed protocol to identify immune cell subsets isolated from liver and adipose tissue in a reliable mouse model of NASH, established by housing high-fat diet (HFD) mice under non-specific pathogen-free (SPF) conditions without a barrier for at least seven weeks. We demonstrate the handling of mice in non-SPF conditions, digestion of the tissues and identification of macrophages, natural killer (NK) cells, dendritic cells, B and T cell subsets by flow cytometry. Representative flow cytometry plots from SPF HFD mice and non-SPF mice are provided. To obtain reliable and interpretable data, the use of antibodies, accurate and precise methods for tissue digestion and proper gating in flow cytometry experiments are critical elements.
The intervention to restore physiological antigen exposure in mice by housing them in non-SPF conditions and unspecific exposure to microbial antigens could provide a relevant tool for investigating the link between immunological alterations, diet-induced obesity and related long term complications.

A simple and reliable diet-induced rodent animal model for nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is described, achieved through non-SPF housing of the animals and administration of a specific high-fat diet. We describe identification of hepatic and adipose immune cell subsets to recapitulate human immunological conditions by exposing mice to environmental germs.

타입-2 당뇨병과 관련 하 여 무 알콜 수 막 염을 위한 진보 된 뮤 린 모형

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive fat accumulation leads to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), &#160;which is potentially reversible and may evolve into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and eventually cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The molecular mechanisms linking lipid accumulation in hepatocytes with the progression to NASH, irreversible liver damage, fibrosis, cirrhosis, and even HCC still remains unclear. To this end, several in vitro and in vivo models have been developed to elucidate the pathological processes that cause NAFLD. In the present study, we describe a cellular model for the induction of liver vesicular steatosis that consists of DMSO-differentiated human hepatic HepaRG cells treated with the fatty acid salt sodium oleate. Indeed, sodium oleate-treated HepaRG cells accumulate lipid droplets in the cytoplasm and show typical features of steatosis. This in vitro human model represents a valuable alternative to in vivo mice models as well as to the primary human hepatocytes. We also present a comparison of several methods for the quantification and evaluation of fat accumulation in HepaRG cells, including Oil Red O staining, cytofluorimetric Bodipy measurement, metabolic gene expression analysis by qPCR, and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. CARS imaging combines the chemical specificity of Raman spectroscopy, a chemical analysis technique well-known in materials science applications, with the benefits of high-speed, high-resolution non-linear optical microscopies to allow precise quantification of lipid accumulation and lipid droplet dynamics. The establishment of an efficient in vitro model for the induction of vesicular steatosis, alongside an accurate method for the quantification and characterization of lipid accumulation, could lead to the development of early stage diagnosis of NAFLD via the identification of molecular markers, and to the generation of new treatment strategies.

In this study, we describe a detailed protocol for inducing liver vesicular steatosis in differentiated HepaRG cells with the fatty acid salt sodium oleate and employ methods for detection and quantification of lipid accumulation, including coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, cytofluorimetric analysis, Oil red O staining, and qPCR.&#160;

분화된 HepaRG 세포에서 베아토시스 유도 및 특성화

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

뮤린 정밀 절단 간 슬라이스 간 생물학의 Ex Vivo 모델로

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

Murine 콜린 불충분 한, Ethionine 보충 (CDE) 다이어트 만성 간 상해의 모델

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

생물학

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or more hepatocytes contribute apical membranes to form a bile canalicular network through which bile is secreted. Hepatocyte polarization is essential for correct canalicular formation and depends on interactions between the hepatocyte cytoskeleton, cell-cell contacts, and the extracellular matrix. In vitro studies of hepatocyte cytoskeleton involvement in canaliculi formation and its response to pathological situations are handicapped by the lack of cell culture, which would closely resemble the canaliculi network structure in vivo. Described here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from the adult mouse liver using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the production of culture in a 3D collagen sandwich setting, which is used for immunolabeling of cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatments in vitro. It is shown that hepatocyte 3D collagen sandwich cultures respond to treatments with toxins (ethanol) or actin cytoskeleton altering drugs (e.g., blebbistatin) and serve as a valuable tool for in vitro studies of bile canaliculi formation and function.

Presented here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from adult mouse livers using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the long-term culture of hepatocytes in a 3D collagen sandwich setting as well as immunolabeling of the cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatment.

체외에서 담즙 관내 형성에서 세포골격의 역할을 연구하기 위해 1 차 마우스 간세포의 격리 및 3D 콜라겐 샌드위치 문화

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...