이 비디오는 간 조직 생물학의 실험적인 전 생체 모델로서 정밀 절단 간 슬라이스의 생산 및 적용을 보여줍니다. 정밀 절단 간 슬라이스는 생체 내 동물 연구와 체외 세포 배양 방법 사이에 존재하는 실험 틈새 시장을 차지합니다. 이 기술은 생체 내 동물 연구에서 몇 가지 주요 이점을 가지고, 같은 간에서 제어 및 치료 샘플을 사용하는 능력을 포함, 다른 기관 시스템에서 오프 타겟 효과를 제거하기 간 조직의 격리, 그리고 전체 살아있는 마우스에 적용하는 경우 부정적인 영향을 미칠 수있는 시약을 사용하는 능력, 예를 들어, 독성 경로 억제제.
기술은 실험실 조직 배양 뒤에 실행 가능한 간 조직의 초 박형, 간 조각을 삭감하기 위하여 측면 진동 블레이드를 사용하여 관련시킵니다. 블레이드의 진동은 전단 응력으로 인한 찢어짐을 방지합니다. 이 예에서, 우리는 실행 가능한 ex vivo 간 슬라이스의 준비를 위한 기술을 보여주고, 이 전 생체 조직이 담즙산으로 취급되는 예보기 실험에서 간 슬라이스 문화의 유용성을 보여 주며, 간 섬유신생의 기전을 평가하기 위하여 담정간 상해를 자극하기 위하여 담즙산으로 취급됩니다.
절단 팔에 블레이드를 삽입합니다. 블레이드와 절단 암을 70% 에탄올 용액으로 소독합니다. 항상 블레이드와의 접촉을 피하십시오.
버퍼 트레이를 70% 에탄올 용액으로 소독하고 멸균 조직으로 닦아냅니다. 완충 용지를 진동에 삽입하고 마운팅 나사를 조입니다. 절단 암을 사용 가능한 최대 높이로 설정합니다.
블레이드 각도를 확인합니다. 진동에, 우리는 수평에서 10도 각도를 사용, 블레이드 샘플쪽으로 아래로 경사진. 블레이드 각도가 단단히 고정되어 있는지 확인합니다.
70%에탄올 용액으로 시편 홀더를 다시 소독합니다. 완충 트레이 아래에 위치한 펠티에 열전 냉각기의 냉각수를 연결합니다. 일부 진동 모델은 얼음 욕조를 사용하여 냉각을 위해 대신 사용합니다.
물 아웃 튜브를 배수구에 고정하고 물을 켭니다. 쿨러를 섭씨 4도로 설정합니다. 버퍼 트레이에 얼음차가운 크렙스-헨셀레이트 버퍼를 넣습니다.
모든 수술 기구와 재료는 멸균되어야합니다. 마우스는 심히 마취되거나 안락사되어야 합니다. 마우스의 피부 표면은 70%에탄올 용액으로 습윤하여 소독하였다.
복강기의 기지에서 다이어프램에 이르기까지 피부에 중간 절개를 합니다. 깨끗한 집게와 가위를 사용하여 복강을 엽니다. 로브를 손상시키지 않고 간을 빠르게 제거하십시오.
간을 아래로 밀어 내고 간 상단의 결합 조직을 잘라냅니다. 간을 위로 밀어 넣습니다. 집게로 간 중앙 혈관 부위를 잡고 위로 당깁니다.
결합 조직 혈관을 잘라. 간 엽을 손상시키지 않도록주의하고, 또한 위장관으로 절단하지 않도록주의하십시오. 제거된 간을 얼음-차가운 크렙스-헨셀레이트 버퍼의 멸균 접시에 넣습니다.
간을 개별 로브로 분리합니다. 간 엽 하나를 선택하고 새로운 멸균 접시에 평평한 면을 내려 놓습니다. 크렙스 헨셀레이트 버퍼에 다른 로브를 얼음 위에 보관하십시오.
간 엽의 가장자리를 손질합니다. 트리밍은 특히 절단 블레이드에 먼저 접촉할 가장자리에서 중요한데, 절단 블레이드에 상대적으로 수직인 조직 가장자리가 얕은 각도에서 발생할 수 있는 조직 압축을 방지할 수 있기 때문에. 다른 세 개의 가장자리 주위에 조직을 절단조직 가장자리에 섬유 캡슐의 대부분을 제거, 일반적으로 조직 조각의 쉽게 제거 할 수 있습니다.
시편 홀더의 앞가장자리에 얇은 시아노아크라일트 접착제를 놓아, 잘린 간 엽보다 약간 더 큽립니다. 멸균 흡수성 물질을 사용하여 조직에서 버퍼의 잔류물을 제거합니다. 시아노아크라일트 접착제에 간 엽을 놓고 앞쪽을 향한 가장 큰 가장자리가 있습니다.
1~2분 동안 공기 중에서 치료할 수 있습니다. 시편 홀더에 부착된 조직을 진동에 넣습니다. 진동 속도를 설정합니다.
절단 블레이드가 간 엽 바로 위에 있을 때까지 낮춥습니다. 진동 절단 암을 샘플 위로 실행합니다. 이 기계의 블레이드 진동은 발 페달에 의해 활성화됩니다.
블레이드를 뒤로 돌려보고 블레이드 높이를 250 마이크로미터로 낮춥니까. 조직의 상단 층이 제거 될 때까지이 과정을 반복합니다. 처음 하나 또는 두 개의 조각을 폐기, 이들은 글리슨의 캡슐을 포함 할 것 이다, 따라서, 많은 기능간 조직을 포함 하지 않습니다.
간 슬라이스를 자르려면 진동 블레이드를 핸들을 돌려 조직으로 천천히 전진시다. 작은 페인트 브러시를 사용하여 절단 과정에서 조직을 부드럽게 안내하십시오. 페인트 브러시를 사용하여 절단 조직 섹션을 선택한 다음 조직 섹션을 보관을 위해 크렙스 헨셀레이트 버퍼가 들어 있는 멸균 튜브에 넣습니다.
사용하지 않을 때는 이 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 일부 시간, 조직은 절단 과정 동안 찢어 지 않습니다., 하지만 대부분의 목적을 위해, 조직은 여전히 사용할 수. 시아노아크라일트 접착제 근처까지 조직 조각을 잘라냅니다.
접착제로 자르지 마십시오. 필요한 수의 조직 조각을 얻을 때까지 얼음 위에 앉아있는 다른 간 엽과 반복하십시오. 시편 홀더를 청소하려면 블레이드를 사용하여 접착제 조직 혼합물을 긁어 내거나 아세톤 또는 디메틸 설플옥산화물과 같은 용매를 사용하여 혼합물을 부드럽게 할 수 있습니다.
조직 배양 후드에서, 10%의 태아 소 혈청과 항균제가 12웰 플레이트에 함유된 Williams'E 배지의 파이펫 1mL. 혼합물을 부드럽게 소용돌이치면 조직 조각을 제거하고 멸균 접시에 팁을 넣습니다. 조직을 대략 균일한 크기로 자른다.
이 예에서는 표면적 약 50밀리미터 정사각형의 조직 조각을 목표로 했습니다. 일관성을 위해 조직 조각을 검사하십시오. 어두운 조각은 조직 두께가 증가하고 폐기되어야한다는 것을 시사합니다.
가벼운 슬라이스는 경화 된 시아노아크라일트 접착제의 존재를 제안하고 폐기해야합니다. 조직의 조각을 1밀리리터의 미디어를 포함하는 12웰 플레이트로 옮기. 정상적인 조직 배양 조건하에서 간 조각을 배양합니다.
가능 하면, 조직 조각에 산소 가용성을 향상 하는 방법을 사용. 그 다음 날, 수동 파이펫을 사용하여 미디어를 변경하여 흡입에 의한 조직의 손실을 방지합니다. 정밀 절단 간 조각은 이제 실험용으로 사용할 준비가 되었습니다.
우리의 응용 프로그램을 위해, 우리는 2 일 동안 담즙산으로 간 조각을 처리하고, 메신저 RNA 추출 및 qPCR 분석을위한 용해 완충제에서 균질화했다. 시간이 지남에 따라 정밀 절단 간 슬라이스의 생존 가능성을 검사하기 위해, 우리는 세포 생존을위한 프록시로 ATP 수준을 사용했다. ATP 수준은 단백질로 정상화되었고, 격리 후 여러 시간 지점에서 측정되었다.
ATP 수준은 즉각적이고 1시간 샘플에서 감소되었지만, 이것은 3시간 동안 회복되었습니다. 이에 따라 ATP 수준은 5일 동안 유지되었지만 시간이 지남에 따라 하향 추세를 보였습니다. H&E 염색은 최대 5일 동안 배양에서 유지되었던 정밀절단 간 슬라이스를 검사하는 데 사용되었습니다.
조직 형태는 5 일째에 심각한 괴사가 일어나는 2 일째에 생기는 몇몇 괴사의 암시이었습니다. 2일과 5일 사이에 일어나는 괴사 때문에 이 기술의 실험용유틸리티는 약 3일로 제한되는 것이 좋습니다. 그러나, 이것은 조직 조각에 더 나은 산소 전달 기술을 사용 하 여 향상 될 수 있습니다.
정밀 절단 간 슬라이스는 또한 문화권에 있는 시간에 비해 콜라겐 섬유의 두껍게 하는 것처럼 보입니다. 이것은 발생하는 자발적인 섬유질 과정의 암시입니다. 실시예 실험에서, 정밀 절단 간 슬라이스는 간 담즙염을 모방하기 위해 2 일 동안 3 개의 분리 담즙산으로 처리되었다.
3개의 cholangiocyte 특이적 유전자의 mRNA 발현을 살펴보면, 두 개의 공액 담즙산, 글리코콜릭 및 타우로콜산, 사이토케라틴-19 및 코넥신-43의 발현이 크게 증가했습니다. 이것은 cholangiocyte 개발과 일치합니다. 이 비디오를 시청 한 후, 당신은 정밀 절단 간 조각을 만드는 방법에 대한 좋은 이해를가져야한다, 기본 조직 문화를 수행하는 방법.
정밀 절단 간 슬라이스는 RNA 발현, 단백질 발현, 후성 유전학, DNA 결합, 신진 대사, 감염 메커니즘, 암 침공, 약리학, 세포 생물학 및 분비 연구에 대한 실험 조사를 포함하여 매우 광범위한 응용 분야에 사용될 수 있습니다.
