Name: mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
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The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.

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AB와 EM이 원고 작성 당시 브리티쉬 아메리칸 토바코의 직원이었다. 이 논문에서 설명하는 작업은 브리티쉬 아메리칸 토바코에 의해 투자되었다,이 비디오 기사에 대한 출판 비용은 브리티쉬 아메리칸 토바코 지불했다.

현재, 많은 표준화 된 독성 시험 시스템은 정상적인 인간의 신진 대사 하나의 대표하지 않습니다 엔지니어링 세균, 세포 선, 또는 배아 세포를 사용합니다. 이것은 화학 물질 또는 약의 잠재적 인 독성 활동의 부정확 한 예측으로 이어질 수 있습니다. 이러한 칩 3D 세포 배양 및 장기 등의 생체 외 모델의 혁신적인 개선 인체 조직 21, 22, 23의 일반적인 형태 및 대사 활성을 복제하기위한 시도로 개발되고있다. 대사 능력 모델이 가장 독성 약물 평가 및 연구에 적합한 생물 전환 된 해독하는데 사용될 수있는 하나 개의 기준이다. 우리는이 논문에서 설명했다 프로토콜은 살아있는 세포를 사용하여 CYP 효소의 활동을 측정하도록 설계되었습니다. 그것은 유연하고 2D 또는 3D이 배양 다른 전지 시스템에 사용할 수 있습니다ES와 luminogenic 프로브 - 또는 질량 분석 기반 접근 방식을 사용 할 수있는 옵션을 제공합니다. 두 가지 방법은 재료의 나노 그램 수량을 감지하고 만 다공 형태로 성장하는 소수의 세포를 필요로 할만큼 민감하다. 또한 회전 타원체에 적용 할 수 또는 세포는 복잡한 매트릭스에서 재배. 프로브 기판의 선택은 분명 프로토콜의 중요한 요소이다. 상기 분석의 특이성은 선택적 CYP 억제제의 사용에 의해 얻어 질 수 CYP 효소 보증 다른 층의 선택적 인 프로브에 의존한다. 기판 및이 문서에 나와 억제제는 몇 가지 예에 불과하지만, 다른 사람은 문헌에서 찾을 수 있습니다. 이 효소는 낮은 수준으로 발현되는 것에 기인 할 수있는 네거티브 CYP 활성 결과로서 새로운 세포 유형으로 작동 할 때 복수의 배양 시간을 고려하는 것이 중요하다. 양성 대조군으로 사용할 수있는 세포 유형의 추가한다는 보장하는 것이 바람직부정적인 결과는 기술적 인 문제에 어떤 문제 해결에 도움이 연결되지 않습니다. 주 간 세포가 대사 능력이 서스펜션 예를 차 간세포를 들어, 대조군으로 사용 할 수있는 것은 매우 쉽게 쓸 수 있지만 그들의 생존은 시간에 제한됩니다. 간 세포 라인이 프로토콜에 설명 된대로 사용하는 것이 상대적으로 용이 가능한 대안이지만, 일부는 신진 대사 활동 (6), (21)의 측면에서 다른 사람보다 더 낫다. 분석은 총 단백질 정량되지 않는 비 파괴적이기 때문에, 종 공부 (20)에 시간 경과 CYP 활성을 수행 할 수있다. 일부 세포는 배양 시간이 지남에 따라 변수 CYP 활동을하고 있기 때문에 이것은 중요한 포인트입니다. 음의 결과는 시험관 내에서 분화 또는 탈분화로 포화 상태의 부족, 진행과 연관 될 수 있습니다. 이 경우, 접근 방식은 반 quantitati입니다데이터는 각각의 세포 배양 물에서 단백질의 총량에 의해 정규화되지 않으므로했습니다. TCDD의 경우와 같이 조직에 대한 독성 효과를 가질 수있는 프로브, 억제제 또는 유도 물질에 대한 노출로 CYP 활성을 측정 한 후, 조직을 재사용하는 것이 불가능하거나 바람직하지 않습니다. 같은 마이크로 솜 같은 셀 분수는 주어진 세포 유형의 CYP 활동을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 미크로 제제는, 그러나, 셀 재 적절한 보조 인자의 첨가 많이 필요하고, 효소 활성을 유지하도록 버퍼. 살아있는 세포를 사용하여 까다로운 마이크로 좀의 준비 단계를 제거하고 버퍼링 공동 인자가 가장 잘 작동하는 운동. 일반적인 추천 정보로서, 추가로이 효소 활성과 일치하는지 확인하는 세포 배양에서 CYPs의 발현 프로파일을 특성화하기위한 가장 좋은 방법이다. 검증이 추가 레벨은 신진 대사 프로브는 enti되지 않습니다 주어진 권장단일 CYP 특정 의존하며 측정 된 대사 활성은 해당 효소의 발현에 의해 일치 증가 된 신뢰도를 제공한다. CYPs 멤브레인 단백질이기 때문에 그러므로 그들은 정량적 RT-PCR이 효소 20 프로파일에 바람직한 접근왔다 웨스턴 블랏을 준비하기 위해 상대적으로 어렵다. 이 프로토콜은 단지 하나의 중요한이라도 대사 효소 패밀리 중 하나를 나타내는 분석 CYP 효소 활성에 대한 방법을 설명하는 것이 중요하다. 질량 분광 분석 방법의 유연성은 프로브 기판의 다른 대사 변환에 대한 취득 방법의 개발을 허용한다. 그러나, 그것들은 한번에 하나씩 개발되어야 할 현재 공지 적은 특정 프로브 및 다른 대사 효소 군에 대한 선택적 억제제가있다. 이 격차는 체외 세포 등산용의 신진 대사 능력의 종합적인 평가를 할 수 있도록 해결해야MS.

생체이 대사는 신체 외부 화학 물질들이 배출을 용이하게 한 친수성기와 복합체의 첨가에 의해 수정되는 과정이다. 일반적으로 생체 이물질의 대사 제가 하나 이상의 수산기 (1, 2)의 첨가와 함께 산화 주로 이루어지는 단계와 두 단계 프로세스이다. 예컨대 글루 쿠로 니드 또는 황산 부분 (1, 2)과 같은 친수성 복합체에 대한 수용체로서 단계 II에서, 수산기가 사용된다. 셉터 그룹이 이미 분자에 존재하는 경우, 접합 공정 독립적 I 상 대사 일어날 수있다. 각 화학 반응 기판 (3)의 특정 효소의 기, 예를 들어, 히드 록 실화를 촉매 CYPs (시토크롬 P450s) (도 1), 탈 알킬화에 의해 수행된다. ConjugatioN sulfotransferases에 의해 촉매되는, UDP-glucuronosyltransferases (도 1), 글루타티온 S 트랜스퍼 - 및 N- 아세틸 트랜스퍼 4. 각 조직 및 기관은 그 대부분의 단백질을 발현시키는 간암으로 특정 대사 효소의 발현 프로파일을 가질 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> 그림 1 : 단계 I와 쿠마린을위한 단계 II 대사의 예. CYP2A6은 / 쿠마린의 7 수산화을 촉진 CYP2A13. 7- 하이드 록시 쿠마린이 UGT1A6 및 UGT1A9 가장 높은 활성을 보여주는, 단계 II 효소에 의한 글루 쿠 UGTs 잔기에 접합된다. 생체 이물질의 신진 대사를 이해하는 것은 두 가지 이유에 대한 약물 안전성 평가 및 화학 위험 평가에 중요한 : 반응 속도론은 약물이나 화학 물질은 활성 또는 비활성 형태 B의 몸에 남아 시간을 결정합니다는 efore 배설; 및 모 화합물 대사 효소에 의해 더 반응성 불안정한 독성 종으로 변형 될 수있다. 또한 &quot;생리 활성&quot;로 알려진 이러한 반응은 대부분 내가뿐만 아니라 상 II 결합 (5)에 의해 희소 한 경우에 효소를 CYP 단계에 의해 구동된다. 이를 바탕으로 정확하게 약물이나 화학 물질과 관련된 위험을 예측하는 체외 모델의 능력은 전지 시스템의 신진 대사 능력에 크게 의존한다. 병든 조직 또는 정상 세포의 변형 유래 세포주에 종종 부분 아니라면 원점 (6)의 이들 조직의 대사 효소 프로필 대표 모두 잃는다. 정상 대사 효소 프로파일의 유지는 (적어도 단기간 배양)에서 일차 세포 배양 물에 잘 나타나 조직이 그것의 3 차원 구조 (1)를 유지할 수 있도록 매트릭스 배양 할 경우 더욱 향상된다. 따라서 문자체외 전지 시스템의 신진 대사 능력의 acterization 세포 모델은 화학 물질 안전성 평가를 수행 할 적절한에 관한 결정을 안내하는 중요한 예비 단계입니다. 본 연구에서 우리는 간 세포주 7 3D 차 폐암 세포 배양 8 애플리케이션의 예는 시험관 내에서의 활성 및 단계 I CYP 효소의 발현을 프로필에 대한 프로토콜을 제시한다. CYP 특정 기질 대사 억제제 제품 및 컨트롤 질량 spectrometry- 및 luminogenic 기반 정량 방법과 함께 설명한다. 일부 CYPs을 유도하고 다른 구성적인 때문에, 예는 그 두 가지 시나리오에 대해 구체적으로 살펴 보도록한다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent &amp;amp; Cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &amp;mu;m syringe filter</td><td>Whatman</td><td>UN203NPEORG</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>5-phenyl pentyne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CD5001437</td><td></td></tr><tr><td>6-hydroxybupropion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3167</td><td></td></tr><tr><td>6-hydroxychlorzoxazone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UC148</td><td></td></tr><tr><td>7-ethoxycoumarin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>195642</td><td></td></tr><tr><td>7-hydroxycoumarin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H24003</td><td></td></tr><tr><td>8-methoxypsoralen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3501</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A/0626/17</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-naphthoflavone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N5757</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>b-glucuronidase/arylsulfatase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0876</td><td></td></tr><tr><td>Bupropion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B102</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazepine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>chlorzoxasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4397</td><td></td></tr><tr><td>collagen</td><td>Cell Systems</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>coumarin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4261</td><td></td></tr><tr><td>disulfiram</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86720</td><td></td></tr><tr><td>fluvoxamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2802</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (Glutamine supplement)</td><td>Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG metabolism supplement</td><td>Merck</td><td>MMAD621</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG thaw media supplement</td><td>Merck</td><td>MMADD671</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG</td><td>Merck</td><td>MMHPR116</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin-CEE</td><td>Promega</td><td>V8751</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir airway cells</td><td>Epithelix</td><td>EP01</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir airway cells maintenance media</td><td>Epithelix</td><td>EP04MM</td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex 2.6 &amp;mu;m, PFP 100A</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4477-AN</td><td></td></tr><tr><td>TCDD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48599</td><td></td></tr><tr><td>thioTEPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6069</td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 &amp;micro;m 2.1 x 50 mm</td><td>Waters</td><td>86003538</td><td></td></tr><tr><td>Williams&amp;rsquo; E media</td><td>Fisher</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS</td><td>Sciex&amp;nbsp;</td><td>ABI Sciex 4000</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS software</td><td>Sciex&amp;nbsp;</td><td>Analyst 1.4.2</td><td></td></tr><tr><td>luminometer</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>spectrophotometer</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>cell counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>Vi-Cell XR</td><td></td></tr><tr><td>rotary evaporator</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf-5301</td><td></td></tr></tbody></table>

mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures

생체이 대사 효소는 용해도를 증가 및 배설을 촉진 작용기를 첨가하여 약제의 독성 물질 및 생물 전환에 중요한 기능을 담당한다. 어떤 경우에 그 구조 변경은 새로운 독성 제품의 형성으로 이어질. 동물 실험을 줄이기 위해, 화학적 위험은 대사 능력이 세포를 이용하여 평가 될 수있다. 대사 효소의 발현은, 그러나, 체외 차 문화 시스템에서 많은 시간 이상 안정되지 종종 세포 라인의 일부 또는 존재하지 않는다. 따라서, 생체 외 의약품, 첨가제, 환경 오염 물질 대사의 연구는 이상적으로 신진 대사 활동이 특징되었습니다 전지 시스템에서 수행되어야한다. 우리는 UPLC 질량 분석에 의한 정량적 화학 프로브 및 대사 제품을 사용하여 2D 세포주 및 기본 3D의 문화 대사 효소의 클래스의 활동 (인간 단계 I)를 측정하기 위해 여기에 방법을 설명하고luminometry. 방법 세포주 및 다양한 조직으로부터 유도 된 세포의 주 대사 활성을 테스트하도록 구현 될 수있다.

세 가지 공여체 (기도 M360, M370, M417) 및 간 세포주 HEP (선)에서기도 세포 배양 두 CYPs 쌍 (CYP1A1 / 1B1 및 CYP2A6 / 2A13) 측정 대사 활성의 예는도 6에 나타낸다 (20). CYP 활성 측정 luminometry 도 6a는 호흡기 세포에서 룩 - CEE (루시페린 6&#39;- 클로로 에틸 에테르) (3 도너)와 함께 및 TCDD 유도없이 간 세포의 CYP1A1 / 1B1 O-탈 알킬화 활동에 의해 생성 된 상대 발광을 나타낸다. CYP1A1 / 1B1 높게 유도 효소이며, 통상적으로 대부분의 조직의 구성 적 수준에서 발현되지 않는다. 세포가 유도되지 않는 경우도 6a에서 알 수있는 바와 같이, 더 luminogenic 신호가 검출되지 않는다. 두 세포 유형은 TCDD 강한 CYP1A1 / 1B1 유발제 마크로 사전 배양하면ED luminogenic 신호는 제어부 (도 6a)와 비교하여 검출된다. 이는 룩 - CEE 프로브 이후 정량화 루시페린 부분의 박리로 이어지는 대사되었음을 나타낸다. 전체적으로 TCDD 처리 간 세포주에서 활성 심지어 총 단백질 정규화 후에,기도 세포보다 낮다. 세포주는 일차 전지보다 대사 활성화하는 경향이 있기 때문에 이것은 드문 일이 아니다. α-naphthoflavone 첨가 CEE 상기 룩 - 대사 CYP 의존성을 확인 모든 세포 유형에서 CYP1A1 / 1B1 활성에 명확한 억제 효과를 갖는다. UPLC-MS를 사용 CYP450 대사 산물의 정량 도 6b는 INHI의 존재와 부재 및 쿠마린과 배양 후 3 도너 (기도 M343, M345, M347) 및 간 세포 (간염 라인)에서기도 세포 CYP2A6 / 2A13 활성의 정량화를 도시BITOR 8 methoxypsoralen. 데이터는 전체 단백질 정규화된다. 0 분 쿠마린 배양 컨트롤 어떠한 하이드 록시 쿠마린 (7)는 (도 6b) 검출되지 않는다. CYP2A6 / 2A13 특정 조직에서 구성 적으로 발현되는 7 하이드 록시 쿠마린의 형성 쿠마린 따라서 후 16 시간 배양에도 유도하지 않고, 테스트를 다른 유형의 세포에서 발견된다. 8-methoxypsoralen 때 CYP2A 억제제 (도 6B)는, 7 하이드 록시 쿠마린의 형성이 상당히 감소된다 첨가한다. 억제가 거의 완료되는 다른 CYPs 또한 기판을 인식하지만, 훨씬 덜 효율적으로 처리 할 수 ​​있습니다 이후 CYP 억제제의 존재, 여전히 잔존 활동을 감지하는 것이 정상입니다 주목해야한다. 또한 그것이기도 세포 CYP2A6 볼 같이 일차 전지를 사용하는 경우, 기록 대사 활성은 공여체와 상이 할 수 있음을 관찰 할 수있다(도 6b). 이것은 CYP 활동이 각 기증자의 유전자형과 유전자 다형성에 대한 책임이로 예상된다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> 도 6 : 활성 분석법은 CYP1A1에 대한 결과 / 1B1 활성 (A) 및 간 세포주 세기도 세포 기증자 (M360, M370, M417)에 CYP2A6 / 2A13 활성 (B). (A) - 루크 CEE 탈 알킬화 활성와 TCDD 의한 CYP1A1 / 1B1의 유발없이 나타낸다. α-naphthoflavone은 CYP1A1 / 1B1 억제제로서 사용 하였다. 활성 분 (최소)으로 배양 시간에 의해 정규화 된 상대 발광 단위 (RLU) 총 단백질 (㎎)으로 표현된다. 들은 항시 적으로 발현 될 때 (B) CYP2A6 / 2A13 유도를 필요로하지 않는다. pmol의 / 분 / mg의 단백질의 쿠마린 -7- 히드 록 실화 활성 억제제와 8 methoxypsor없이 다양한 시점에서 도시ALEN. 모든 결과는 평균의 표준 편차와 3 개 개의 독립적 인 측정의 평균 값으로 표시하고 있습니다. 이 수치는 박스터 (20)에서 수정되었습니다. 보충 표 1 : UPLC 및 질량 분석기 설정. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

체외 시스템의 신진 대사 능력은 약물 및 독성 물질의 생체 내 변화 및 처분을위한 핵심 요구 사항입니다. 이러한 프로토콜에서는, I는 세포 배양 대사 위상을 평가하기위한 기준 대사 프로브의 적용을 설명한다.

질량 분석 및 Luminogenic 기반의 접근 방법은 단계 I 대사 역량의의 특성을<em&gt; 체외</em&gt; 세포 배양

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

9.7K 조회수.  British American Tobacco.  체외 시스템의 신진 대사 능력은 약물 및 독성 물질의 생체 내 변화 및 처분을위한 핵심 요구 사항입니다. 이러한 프로토콜에서는, I는 세포 배양 대사 위상을 평가하기위한 기준 대사 프로브의 적용을 설명한다. 

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Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

하여 세균없는 마우스 프로 그레시브 콜로니 동안 간장 신진 대사 변경 사항 평가 1 H NMR 분광학

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

연구

면역학 및 감염병학

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but also to identify biomarkers for early-stage cancer detection and prediction of chemotherapy response in cancer patients. Preparation of uniform samples for metabolomic analysis is a critical issue that remains to be addressed. Here, we present an easy and reliable protocol for extracting aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis using capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). Aqueous metabolites from cultured cells are analyzed by culturing and washing cells, treating cells with methanol, extracting metabolites, and removing proteins and macromolecules with spin columns for CE-MS analysis. Representative results using lung cancer cell lines treated with diamide, an oxidative reagent, illustrate the clearly observable metabolic shift of cells under oxidative stress. This article would be especially valuable to students and investigators involved in metabolomics research, who are new to harvesting metabolites from cell lines for analysis by CE-MS.

The purpose of this article is to describe a protocol for extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis, particularly, capillary electrophoresis-mass spectrometry.

모 세관 전기 영동-질량 분 광 법에의 한 대사체학 분석을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물의 추출

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

암 연구학

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

생체공학

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is going to move beyond the laboratory and become a widespread and standard just in time manufacturing technology, we must understand the performance limits of these systems. Toward this question, we developed a robust protocol to quantify 40 compounds involved in glycolysis, the pentose phosphate pathway, the tricarboxylic acid cycle, energy metabolism and cofactor regeneration in CFPS reactions. The method uses internal standards tagged with 13C-aniline, while compounds in the sample are derivatized with 12C-aniline. The internal standards and sample were mixed and analyzed by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS). The co-elution of compounds eliminated ion suppression, allowing the accurate quantification of metabolite concentrations over 2-3 orders of magnitude where the average correlation coefficient was 0.988. Five of the forty compounds were untagged with aniline, however, they were still detected in the CFPS sample and quantified with a standard curve method. The chromatographic run takes approximately 10 min to complete. Taken together, we developed a fast, robust method to separate and accurately quantify 40 compounds involved in CFPS in a single LC/MS run. The method is a comprehensive and accurate approach to characterize cell-free metabolism, so that ultimately, we can understand and improve the yield, productivity and energy efficiency of cell-free systems.

Here, we present a robust protocol to quantify 40 compounds involved in central carbon and energy metabolism in cell-free protein synthesis reactions. The cell-free synthesis mixture is derivatized with aniline for effective separation using reversed-phase liquid chromatography and then quantified by mass spectrometry using isotopically labelled internal standards.

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

생화학

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. The single-probe, a microscale sampling and ionization device, can be coupled with a mass spectrometer for on-line, rapid SCMS analysis of cellular constituents under ambient conditions. Previously, the single-probe SCMS technique was primarily used to measure cells immobilized onto a substrate, limiting the types of cells for studies. In the current study, the single-probe SCMS technology has been integrated with a cell manipulation system, typically used for in vitro fertilization. This integrated cell manipulation and analysis platform uses a cell-selection probe to capture identified individual floating cells and transfer the cells to the single-probe tip for microscale lysis, followed by immediate mass spectrometry analysis. This capture and transfer process removes the cells from the surrounding solution prior to analysis, minimizing the introduction of matrix molecules in the mass spectrometry analysis. This integrated setup is capable of SCMS analysis of targeted patient-isolated cells present in body fluids samples (e.g., urine, blood, saliva, etc.), allowing for potential applications of SCMS analysis to human medicine and disease biology.

An integrated cell manipulation platform is developed for use in conjunction with a single-probe mass spectrometry setup for the on-line analysis of individual suspension cells under ambient conditions.

단일 현탁액 세포에서 약물 및 대사 산물의 질량 분석 분석을 위한 단일 프로브와 결합된 통합 셀 조작 플랫폼

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

화학

DHODH 및 SDH 활성을 측정하기 위한 안정 동위원소 추적 및 LC-MS 분석

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

저자 스포트라이트: 포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 독립적 분석  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the cell&#39;s survival requirements. Alternatively, carrying out DBTL cycles in cell-free environments can accelerate this process and alleviate concerns with host compatibility. A promising approach to cell-free metabolic engineering (CFME) leverages metabolically active crude cell extracts as platforms for biomanufacturing and for rapidly discovering and prototyping modified proteins and pathways. Realizing these capabilities and optimizing CFME performance requires methods to characterize the metabolome of lysate-based cell-free platforms. That is, analytical tools are necessary for monitoring improvements in targeted metabolite conversions and in elucidating alterations to metabolite flux when manipulating lysate metabolism. Here, metabolite analyses using high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with either optical or mass spectrometric detection were applied to characterize metabolite production and flux in E. coli S30 lysates. Specifically, this report describes the preparation of samples from CFME lysates for HPLC analyses using refractive index detection (RID) to quantify the generation of central metabolic intermediates and by-products in the conversion of low-cost substrates (i.e., glucose) to various high-value products. The analysis of metabolite conversion in CFME reactions fed with 13C-labeled glucose through reversed-phase liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (MS/MS), a powerful tool for characterizing specific metabolite yields and lysate metabolic flux from starting materials, is also presented. Altogether, applying these analytical methods to CFME lysate metabolism enables the advancement of these systems as alternative platforms for executing faster or novel metabolic engineering tasks.

The protocols describe high-performance liquid chromatography methods coupled to refractive index or mass spectrometric detection for studying metabolic reactions in complex lysate-based cell-free systems.

리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

질량 분석 및 Luminogenic 기반의 접근 방법은 단계 I 대사 역량의의 특성을

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하여 세균없는 마우스 프로 그레시브 콜로니 동안 간장 신진 대사 변경 사항 평가¹ H NMR 분광학

모 세관 전기 영동-질량 분 광 법에의 한 대사체학 분석을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물의 추출

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역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

단일 현탁액 세포에서 약물 및 대사 산물의 질량 분석 분석을 위한 단일 프로브와 결합된 통합 셀 조작 플랫폼

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

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