MT Holley는 Louisiana Board of Regents의 Graduate Fellows 프로그램에서 지원하고 C. Danielson은 Howard Hughes Medical Institute 교수 프로그램의 지원을받습니다. 이 연구는 NSF 보조금 번호 : 1530884에 의해 지원됩니다.

여기에 설명 된 모든 절차는 승인 된 프로토콜을 사용하여 수행되었으며 Notre Dame 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 규정에 따라 수행되었습니다. 1. 세포 배양 및 배양 <ol><li> 시작하기 전에 10 % 태아 소 혈청 (FBS)과 1 % 페니실린 항생제 (DMEM 완결)가 첨가 된 작은 깔때기, 피펫 및 따뜻한 Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)을 준비하십시오. </li><li> 기능화 된 장치 (생물 학적 액추에이터 또는 biorobot)와 함께 T - 25 플라스크를 가져 가라. 세포 배양에 앞서 장치 준비, 기능화 및 보관에 대한 자세한 내용은이 두 부분으로 된 원고의 1 부 4 절을 참조하십시오. </li><li> 작고 정사각형 인 플라스틱 시트를 굴려서 깔때기를 준비하십시오. T-25 플라스크 안의 생물학적 액츄에이터 또는 바이오 오봇 위에 놓습니다. 넓은 장치의 직경을 장치 전체에 맞게 조정하십시오.플라스크의 상단이 단단히 조여 질 때 높이가 맞아야합니다. <ol><li> biorobots 들어, 자장 과정을 통해 플라스크의 바닥에 장치를 개최 자석을 사용합니다. 참고 : 여기에는 하나의 네오디뮴 디스크 자석 (직경 1.26 &quot;)이 사용되었지만 비슷한 크기와 강도를 지닌 임의의 자석도 자기 니켈 -PDMS 복합베이스로 비오봇 로봇을 고정시키는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 적어도 30 분 전에 플라스틱 시트를 자외선 살균하십시오. </li></ol></li><li> 깔대기 바닥과 플라스크 사이에 큰 간격이 없는지 확인하십시오. </li><li> 1.6 x 10 7 세포 / ML의 밀도로 완료 DMEM의 cardiomyocytes를 Resuspend하고 천천히 깔때기를 통해 장치에 정지의 400 μL를 드롭하십시오. hemocytometer 또는 다른 세포 카운터를 사용하여 얻은 세포의 수를 결정합니다. </li><li> 장치와 깔때기를 방해하지 않고 천천히 시스템을 인큐베이터로 다시 이동하십시오.hin. 37 ° C에서 24 시간 동안 배양. </li><li> 잠복기 후, 천천히 깔때기를 제거하고, PBS로 시료를 부드럽게 씻어 내고 플라스크를 10 mL의 신선한 DMEM으로 채우십시오. 참고 : biorobots의 경우, 장치가 해상되도록 자석을 제거하십시오. </li></ol> 2. 생화학 적 특성 <ol><li> 칼슘 플럭스 분석 참고 : 칼슘 플럭스 분석은 세포 상호 연결성을 평가하기 위해 수행됩니다. 형광, 칼슘 이온 특정 염료로 세포를로드하는 절차는 이전에 설립 프로토콜 11 에 설명 된 프로세스를 수행합니다. <ol><li> 먼저 필요한 물질, 칼슘 fluo-4-acetomethyl (AM) 에스테르, 비이 온성 계면 활성제 폴리올 ( 표 참조) 및 Tyrode 의 소금 용액을 준비하십시오. </li><li> 긴 핀셋을 사용하여 장치를 배양 플라스크에서 Tyrode &#39;s salt solu 2 mL가 들어있는 35 mm 페트리 접시로 부드럽게 옮깁니다<html> . </li><li> 별도의 원심 분리 튜브에서 따뜻한 Tyrode 용액 (37 ℃로 가온) 1 mL를 취하고 칼슘 fluo-4 AM 염료 (작동 농도 : 3-5 μM)와 비이 온성 계면 활성제 폴리올 (작업 농도 : 0.2 %). 샘플 용액을 칼슘 지시약 염료, fluo-4 및 0.2 % 비이 온성 계면 활성제가 보충 된 따뜻한 Tyrode 용액으로 교체하십시오. 37 ° C에서 25 - 30 분 동안 품어 라. </li><li> 염료 솔루션을 제거하고 부드럽게 신선한 Tyrode의 솔루션으로 샘플을 씻으십시오. 이미징 이전에 37 ° C에서 또 다른 30 분 동안 완료 신선한 DMEM 2 ML에 샘플을 다시 품다. 참고 : 이 분석 및 관련 비디오의 결과는 이전에 출판 된 연구 7 에서 제공됩니다. </li></ol></li><li> 면역 형광법 주 : 모든 샘플의 이중 면역 염색은 이전에 확립 된 프로토콜&gt; 12. <ol><li> PBS, 일차 항체 (안티 (안티) 의 0.1 % 세포 lyse 세제 (자료 표 참조) diH 2 O, 인산염 - 버퍼 식염수 (PBS), 4 % paraformaldehyde (PFA)에 10 % 염소 세럼 (GS) - 마우스 단일 클론 항체 심장 트로포 닌 -1 및 항 - 토끼 모노클로 날 항체 connexins-43), 2 차 항체 (Alexa 594 접합체 및 염소 항 마우스 IgG (H + L) Alexa 488 접합체) 및 DAPI. 주의 : 파라 포름 알데히드는 발암 성입니다. </li><li> 플라스크에서 관심의 샘플을 제거하고 부드럽게 PBS로 두 번 씻으십시오. 표본 준비 및 기능화에 대한 자세한 내용은이 2 편 원고의 1 부 4 절을 참조하십시오. </li><li> 작은 coverslip (직경 : 12mm 또는 15mm)에 PBS의 방울을 추가합니다. 부드럽게 핀셋으로 장치의베이스를 잡고 끝에서 가위를 사용하여 얇은 PDMS 암 (캔틸레버, 그림 1 )을 절단하여베이스 상단에 연결합니다이자형. 셀 부착면을 위로 향하게하여 캔틸레버 암을 액적 위로 옮깁니다. PBS 방울은 세포가 건조되는 것을 방지합니다. </li><li> 이전에 설명한대로 4 % PFA로 샘플을 고정하고 샘플의 이중 면역 염색을 수행하십시오 12 . </li><li> immunostaining 후, 안티 페이드 장착 시약을 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드에 샘플을 탑재하고 24 시간 동안 어둠 속에서, 방해받지 않고 옆으로 설정합니다. </li><li> 모든 샘플에 대해 절차를 반복하십시오. 참고 : 이 분석 및 관련 이미지의 결과는 이전에 출판 된 연구 7 에서 심도있게 논의됩니다. </li></ol></li></ol> 3. 이미징 <ol><li> 이산화탄소 배양기에서 T - 25 플라스크를 똑바로 세우고 인큐베이터 내부의 이미징 시스템을 준비하십시오. 줌 렌즈 ( Table of Materials 참조)를 사용하여 카메라 ( 재료 표 참조)를 사용하여 장치를 기록하십시오. 광원의 경우,LED 표시등을 사용하십시오. 참고 : 여기에 백색광 LED 스트립이 사용되었지만 일반 LED는 작동합니다. </li><li> 카메라를 운영 체제에 연결하고 카메라 별 소프트웨어를 엽니 다 ( 재료 표 참조). 상단 패널의 &quot;파일&quot;탭 아래에있는 카메라 이미지를 클릭하여 모든 카메라 옵션을 열고 올바른 카메라를 선택하십시오. </li><li> 소프트웨어 내의 상단 패널에있는 탭 목록에서 &quot;live&quot;를 선택하십시오. </li><li> 렌즈 다이얼을 조정하여 수동으로 초점을 맞 춥니 다. 상단 패널에서 &quot;ROI (region of interest)로 자르기&quot;를 선택하십시오. 그런 다음 생물학적 액추에이터 장치와 캔틸레버 암을 둘러싸고 ROI를 표시하기 위해 비디오 프레임에 수동으로 사각형을 그립니다. 참고 : 적절한 ROI를 선택하면 이미지 파일의 크기가 최소화됩니다. <ol><li> biorobots의 경우, 장치의 수영 동작을 기록하기 위해 전체 화면을 캡처하십시오. 참고 : biorobots에 대한 ROI를 작성할 필요가 없습니다. </li></ol></li><li> 녹화를 시작하기 전에 화면의 상단 패널에있는 탭 중 하나에서 &quot;카메라 설정&quot;을 선택하십시오. 막대를 각각 밀어서 또는 수동으로 값을 입력하여 라이브 이미지의 노출과 픽셀 비율을 조정하여 프레임 속도를 설정하십시오. 프레임 속도를 약 30 ± 2fps로 설정하십시오. 참고 : 노출 및 픽셀 비율을 변경하면 라이브 이미지의 밝기와 대비가 변경됩니다. </li><li> 소프트웨어의 상단 패널에서 &quot;기록&quot;버튼을 클릭하면 1,000 x 1,000 픽셀 해상도의 액추에이터 비디오를 정확히 30 초 동안 레코딩 할 수 있습니다. 모든 샘플에 대해이 과정을 반복하십시오. </li></ol> 4. 고정 받침대에있는 생물학적 액츄에이터의 이미지 분석 <ol><li> 사용자 정의 스크립트를 실행하는 프로그래밍 소프트웨어 ( 예 : Matlab)를 사용하여 이미지를 분석하십시오. 재료 표 보기 </st자세한 내용은 rong&gt; 및 Supplemental File 을 참조하십시오. 참고 : 스크립트는 기록 된 비디오의 각 프레임을 표시하고 이미지에 캔틸레버의 포인트 조정을 기록하는 사용자의 마우스 입력을 수신하고 최소 사각 피팅을 통해 입력 포인트를 통과하는 원의 직경과 중심을 계산하고 입력 및 계산 된 모든 데이터를 나중에 사용하기 위해 내보내십시오. <ol><li> 아이콘을 클릭하여 프로그래밍 소프트웨어를 엽니 다. 상단의 메뉴 막대에서 &quot;파일&quot;-&gt; &quot;열기&quot;를 클릭하고 이미지 분석을위한 .m 스크립트 파일을 선택하십시오. 기록 된 TIFF 이미지가 .m 파일과 동일한 폴더에 있는지 확인하십시오. &quot;실행&quot;을 클릭하여 스크립트를 실행하십시오. 참고 : 대화 형 디스플레이가 변경을 위해 팝업됩니다. </li><li> 실제 프로그램을 시작하려면 &quot;재생&quot;을 누르십시오. &quot;open&quot;버튼을 클릭하고 분석 할 TIFF 파일을 찾습니다. </li><li> &quot;기본 및 #34; 버튼을 클릭 한 다음 캔틸레버가 상단의베이스에 부착되는 지점을 클릭하십시오. Enter를 누르십시오. 그러면 캔틸레버베이스의 위치를 ​​나타 내기 위해 각 프레임의 이미지에 사각형 마커가 배치됩니다. </li><li> &quot;크기 조정&quot;버튼을 클릭 한 다음 유리 비드의 한쪽 가장자리를 수동으로 클릭하십시오. 마우스 포인터를 유리 구슬의 반대쪽으로 가져간 다음 &quot;Enter&quot;키를 누릅니다. 참고 : 이것은 유리 구슬의 직경을 측정하는 선을 그려야합니다. 유리 비드는 직경이 3mm이므로 표시된 픽셀과 3mm가 관련됩니다. </li><li> &quot;분석&quot;버튼을 클릭하십시오. 캔틸레버베이스를 나타내는 첫 번째 정사각형 마커에서 짧은 거리에있는 캔틸레버를 클릭하십시오. </li><li> &quot;분석&quot;버튼을 클릭하십시오. 그런 다음 캔틸레버베이스를 나타내는 첫 번째 사각형 표식에서 짧은 거리에있는 캔틸레버를 클릭하십시오. 팁을 포함하여 캔틸레버를 계속 클릭하고 Enter 키를 누릅니다.끝난. 그러면 캔틸레버에서 클릭 한 각 점에 &quot;x&quot;가 표시됩니다. 참고 : 사각 마커의 좌표와 x 표식에 따라 원의 중심과 지름은 최소 사각 피팅 기능을 사용하여 계산됩니다 (사용 된 스크립트에 대한 첨부 파일 참조). x 표식과 정사각형을 통과하는 원이 이미지 위에 자동으로 겹쳐 표시됩니다. </li><li> 중첩 된 원이 캔틸레버 프로파일을 올바르게 추적하는지 확인하십시오. 참고 : 캔틸레버가 매우 평평한 경우 캔틸레버 프로파일이 올바르게 추적되는지 판단하기 어렵습니다. 그림 3을 참조하십시오. </li><li> &quot;다음 프레임&quot;버튼을 클릭하십시오. 그러면 TIFF 파일의 다음 프레임으로 전환됩니다. 기준과 눈금은 이전 단계에서 이미 설정되었습니다. </li><li> TIFF 파일의 모든 프레임이 완료 될 때까지 4.1.5 ~ 4.1.7 단계를 반복합니다. 일단 모든 프레임이 처리되면ssed, &quot;내보내기&quot;버튼을 클릭하십시오. 참고 : 이것은 분석 된 캔틸레버의 TIFF 파일 이름을 가진 스프레드 시트 파일을 만듭니다. 파일 이름을 편집하여 캔틸레버의 측면 (왼쪽 또는 오른쪽)을 분석합니다. </li></ol></li><li> 스프레드 시트의 스트레스 계산. <ol><li> 다음 방정식을 사용하여 캔틸레버의 표면 응력 &quot;σ&quot;을 계산합니다. <img alt="방정식 1" src="/files/ftp_upload/55643/55643eq1.jpg" /> 여기서 E, R, v 및 h는 각각 영률, 곡률 반경, 포아송 비 및 캔틸레버 두께입니다. 참고 : 캔틸레버의 두께는 감도를 변경하기 위해 변경할 수 있습니다. 이 연구에서 E = 750 kPa, v = 0.49, h = 25 μm 13,14의 값 을 얻었다. </li><li> 단계 4.2.1의 방정식을 사용하여 표면 응력을 계산합니다. 를 엽니 다.xls 스프레드 시트 파일. 출력에는 먼저 기본 및 원의 x 및 y 좌표와 곡률 반경이 표시된 여러 열이 있습니다. 이것을 토대로 클릭 된 각 포인트의 x와 y 좌표를 계산하십시오. 참고 : 시간 경과 이미지 프레임에 응력을 플롯하면 시간이 지남에 따라 캔틸레버에 작용하는 힘의 변화가 표시됩니다. 골은 심근 세포가 이완되는 동안 외팔보에 가해지는 응력 또는 세포 견인력으로 인해 외팔보에 작용하는 정적 응력을 보여줍니다. 피크는 심근 세포의 박동에 의해 작용 된 캔틸레버의 동적 응력을 보여줍니다. 이 값은 cardiomyocytes의 수축에 의해 생성 된 힘의 최대 금액에 해당합니다. </li></ol></li></ol> 5. 수영 바이오 오봇의 분석 <ol><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 biorobot의 위치를 ​​기록하십시오. 참고 : th에서 사용되는 소프트웨어에 대한 자료 목록을 참조하십시오.섹션입니다. <ol><li> 이미지 분석 소프트웨어 ( 예 : ImageJ)를 엽니 다. &quot;파일&quot;과 &quot;열기&quot;를 누르고 수영 biorobot 비디오 파일을 선택하십시오. &quot;확인&quot;을 클릭하고 프로그램이 파일을로드하게하십시오. 스프레드 시트 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 로드 된 바이오 오빗 비디오에서 알려진 치수 ( 예 : 생물학적 액추에이터에 포함 된 직경 3mm의 유리 비드)에 대한 참조를 찾습니다. 참고 : 치수가 알려진 모든 객체가 작동합니다. 이렇게하면 각 비디오의 픽셀 길이 비율이 결정됩니다. </li><li> &quot;직선&quot;도구를 사용하여 유리 비드에 선을 그립니다. &#39;분석&#39;을 클릭하고 &#39;배율 설정&#39;을 선택하십시오. &quot;알려진 거리&quot;필드를 &quot;3,000 μm&quot;로 설정하고 &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. 참고 : 이것은 x와 y 좌표를 마이크로 미터로 설정합니다. </li><li> 장치에서 마커 역할을하는 프레임 사이에서 흔들리지 않는 지점을 선택하십시오. 노트 :받침대의 모서리를 선택하는 것이 좋습니다. </li><li> 첫 번째 프레임의 5.1.4에서 선택한 지점을 가리 킵니다. 스프레드 시트에 x 및 y 좌표를 기록하십시오. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어 창으로 다시 전환하고 오른쪽 화살표 키를 눌러 다음 프레임으로 변경하십시오. 마커를 다시 가리키고 (5.1.4 단계) 스프레드 시트에 x 및 y 좌표를 기록하십시오. </li><li> 모든 프레임에 대해 5.1.6 단계를 반복하십시오. </li></ol></li><li> 좌표계 7 스프레드 시트를 사용하여 biorobot의 수영 매개 변수를 계산하십시오. <ol><li> 각 비디오의 알려진 프레임 속도에서 프레임 사이의 기간을 계산하십시오. </li><li> 총 거리를 포함하여 이동 된 거리를 찾기 위해 프레임 간의 x 및 y 좌표의 변화를 계산합니다. </li><li> y 축을 따라 최대 변화로부터 수축의 진폭을 계산하십시오. 두 수축 사이의 기간의 역으로부터 각 비 오로봇에 대한 고동 주파수를 결정합니다. </li><li> 기음x 방향으로 이동 한 총 시간과 거리에서 각 장치의 수영 속도를 계산합니다. </li><li> 분석 된 각 biorobot 비디오에 대해 5.2 단계를 반복하십시오. </li><li> 측정 된 각 매개 변수를 표준화하십시오. 참고 : 모든 값을 표준화하여 차이를 더 잘 시각화하십시오. 이 프로토콜은 저주파수 수축 (수평 LF) ( 그림 4 ) 7 수평 모드 biorobot에 관한 표준화를 보여줍니다. </li></ol></li></ol> 6. 단백질 발현 분석 참고 : 2.2.4 및 2.2.5 단계에서 준비된 탑재 샘플을 공 촛점 현미경을 사용하여 이미지화했습니다. 이미지는 3 개의 채널에서 동시에 20X, 40X 및 60X 배율로 획득되었습니다 (460nm, 488nm 및 594nm). 각 샘플에 대해 서로 다른 위치에서 40 배의 배율로 5 개의 이미지 세트가 캡처되었으며 각 채널은 개별 .TIFF로 저장되었습니다.파일. 노출 설정은 사용 된 대물 렌즈의 배율에 의해 결정되었으며 해당 배율에서 모든 캡처에 대해 일정하게 설정되었습니다. <ol><li> 이미지 분석 소프트웨어를 열고 &quot;File&quot;-&gt; &quot;Open&quot;을 선택하여 이미지를로드하십시오. </li><li> ROI를 표시하기 위해 이미지 프레임에 직사각형 다각형을 그립니다. &quot;Analyze&quot;-&gt; &quot;Measure&quot;를 선택하여 평균 형광 강도를 측정하십시오. </li><li> 모든 샘플에서 강도 측정을 수집하고 각 조건에 대한 각각의 평균 강도를 계산하려면 6.2 단계를 반복하십시오. 참고 : 여기에서 다른 조건은 1 일, 2 일 및 6 일과 같이 서로 다른 시점을 나타냅니다. </li><li> 추가 통계 분석 및 데이터 플롯 생성을 위해 스프레드 시트로 결과를 내 보냅니다. </li></ol>

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 설명 된 절차는 PDMS 기반 액추에이터 및 biorobots에 대한 성공적인 시딩 방법을 설명하며, 이는 심근 세포의 부착을 용이하게합니다. 또한, 세포의 행동과 장치의 성능을 특징 짓는 이미지 수집 및 후속 분석 프로세스가 설명되었습니다. 우리는 24 시간 후 cantilever arms에서 세포의 자발적 수축을 관찰했다. 수축의 강도는 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가하여 6 일째에 최?...

바이오 오봇 (Biorobots)은 일반적으로 PDMS 나 하이드로 겔 (hydrogels)과 같은 부드럽고 신축성있는 물질로 구성된 기계적 백본에 통합 된 살아있는 세포를 기반으로 한 장치입니다. 세포는 자발적으로 또는 자극에 반응하여 리듬 수축을 겪고, 따라서 액츄에이터로서 기능한다. 세포 수축으로부터 생성 된 힘은 다양한 바이오 오봇 (biorobot)을 유도합니다. 포유 동물의 심장 세포 (cardiomyocytes)와 골격 근육 세포는 수축 특성으로 인해 비오 로봇의 작동에 종종 사용됩니다. 심근 세포와 골격근 세포 외에 곤충 근육 조직 2 와 외과 근육 조직 3 과 같은 다른 세포 유형이 사용되었습니다. 곤충 근육 조직은 실온에서 생물학적 액추에이터의 작동을 가능하게합니다. biorobot의 기능과 성능은 주로 생물학적 액추에이터의 강도와 일관성에 의해 결정됩니다 ( 즉,. 근육 세포), 기계적 백본 구조는 주로 운동, 안정성 및 힘의 메커니즘을 결정합니다. 이러한 장치는 전지에서 발생하는 힘에 의해서만 구동되기 때문에 화학적 오염 물질이나 작동 소음이 없습니다. 따라서 다른 기존 로봇에 비해 에너지 효율적인 대안을 형성합니다. 다양한 문헌에서 살아있는 세포와 조직을 생체 로봇 1 , 4 , 5에 통합하는 다양한 방법에 대해 논의 해 왔습니다. 미세 제작 및 조직 공학 기술의 진보로 도보, 그립, 수영 또는 펌프 작동이 가능한 비 오보봇 (biorobot)을 개발할 수있었습니다. 일반적으로, 세포는 합류 세포 시트로서 기계적 (중합체) 백본 상에 직접 배양되거나, 링 및 스트립과 같은 비계 내의 3 차원 액츄 에이션 구조로 몰딩된다. 대부분의 경우, 비오 로봇은이들 세포는 외부 자극없이 자발적 수축을 나타내는 본래의 능력을 가지기 때문에, 심근 세포 시트 ( 6 , 7 )를 사용하여 제조된다. 한편, 골격 근육 세포 시트에 대한 보고서는 막 탈분극을 시작하기 위해 체외 에서 수축을 시작하는 자극이 필요하기 때문에 제한됩니다 8 . 이 프로토콜은 먼저 얇은 PDMS 외팔보로 만들어진 기능화 된 생물 학적 액츄에이터에 cardiomyocytes를 심는 방법을 설명합니다. 그런 다음 수영 프로필의 파종과 분석에 대해 자세히 설명합니다. 캔틸레버는 피브로넥틴과 같은 세포 접착 성 단백질로 관능 화되고 심근 세포와 합류하여 시딩된다. 세포가 장치 계약서에 뿌리면 캔틸레버가 구부러져 작동기 역할을합니다. 시간이 지남에 따라 세포가 성숙함에 따라 세포의 표면 스트레스 변화를 추적합니다.캔틸레버 벤딩. 여기에서 개발 된 생물학적 액추에이터는 섬유 아세포 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포와 같은 모든 세포 유형의 수축 특성을 분화를 결정할 때 측정하는 데 사용할 수 있습니다. biorobot에 대한 이전 연구의 대부분은 생물학적 액추에이터 개발에 초점을 두었지만 biorobot 아키텍처 및 기능 기능의 최적화는 대부분 무시되었습니다. 최근에는 자연에서 영감을 얻은 바이오 오봇 (biorobots)에서 수영 모드를 구현 한 몇 가지 연구가 있습니다. 예를 들어, 편모충을 기반으로 한 운동 6 , 해파리 추진 9 , 바이오 하이브리드 광선 4 를 이용한 수영 biorobots가 설계되었습니다. 다른 문학 작품 들과는 달리, 여기서 우리는 자기 안정화 구조를 만들기 위해 기계적 백본의 성질을 변화 시키는데 중점을 둔다. 이 연구에서 개발 된 바이오 오봇 (biiorobot)은 일정한 피치, 롤, 그리고 메신저를 유지할 수있다.그것이 수영 할 때의 수심. 이 매개 변수는 각 기본 합성물의 두께를 변경하여 수정할 수 있습니다. PDMS 액추에이터, submergible biorobot 및 장치의 기능화 개발과 관련된 제작 단계는이 두 편의 기사의 Part 1과 최근 작업 7 에서 자세히 설명합니다. 여기에서 개발 된 기술은 화물 운송과 같은 다양한 어플리케이션을위한 고효율의 비 오로봇 (biorobot)을 개발할 수 있습니다. 이 연구에서 수행 된 격리 과정은 초기 연구 10 과 최근 출판 된 연구 7 에서 설명한 과정과 유사합니다. PDMS 액추에이터 및 바이오 오로봇 장치를 제작하는 데 사용되는 미세 제작 방법은이 두 편의 원고 파트 1에 자세히 설명되어 있습니다. 이 원고의 프로토콜 섹션은 조작 된 PDMS에 심근 세포를 파종하는 단계를 설명합니다.ctuator 및 biorobot을 세포 접착 단백질로 기능화시킨 후

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocytes (primary cardiac cells)</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>NA</td>
			<td>Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle&#8217;s media (DMEM)</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>16750-074</td>
			<td>with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetalclone III serum</td>
			<td>Hyclone industries, GE</td>
			<td>16777-240</td>
			<td>Fetal bovin serum (FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td>Solution (1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Fluo-4, AM</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F14217</td>
			<td>calcium indicator dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrodes salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2397</td>
			<td>buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Parafomaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710</td>
			<td>Caution: Irritant and combustible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100 100 mL</td>
			<td>cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong gold antifade reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P10144</td>
			<td>Mounting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin filament marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pha</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-connexin 43 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11370</td>
			<td>Gap junction marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cardiac troponin I antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10231</td>
			<td>Contractile protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% EM grade paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>100503-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Elsevier</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>DCC1545M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light strip</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any white LED without spectrum emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikkon C2</td>
			<td>NA</td>
			<td>Confocal microscope with three filter set.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zooming lens</td>
			<td>Infinity</td>
			<td>Model# 252120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used in Section 4) for biological actuator analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>NA</td>
			<td>Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. 
			Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thor Cam</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera operating software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cardiac muscle cell-based actuator and self-stabilizing biorobot - part 2

최근에는 합성 기계적 백본과 통합 된 살아있는 세포 또는 조직 구성 요소로 구성된 하이브리드 장치가 개발되었습니다. 비 오로봇 (biorobots)이라고 불리는이 장치는 살아있는 구성 요소의 수축 활동에서 생성 된 힘에 의해서만 구동되며, 많은 고유 한 이점으로 인해 기존의 완전 인공 로봇의 대안이 될 수 있습니다. 여기서는이 두 부분으로 구성된 기사의 첫 번째 부분에서 설계, 제작 및 기능화 된 생물학적 액추에이터와 바이오 오봇을 시드하고 특성화하는 방법을 설명합니다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 염기 및 박막 캔틸레버로 구성된 조작 된 생물학적 액추에이터 및 바이오 오봇 장치를 피브로넥틴으로 세포 부착을 위해 작용 화시켰다. 기능화 후에, 신생아 쥐의 심근 세포를 고밀도로 PDMS 캔틸레버 팔에 파종하여 합류 세포 시트를 얻었다. 장치는 매일 이미지화되었고 캔티 (canti)의 움직임레버 암이 분석되었다. 파종 후 2 일째에, 우리는 자발적 수축 중에 세포에 의해 가해지는 힘으로 인한 외팔보의 굽힘을 관찰했다. 캔틸레버 벤딩 (cantilever bending)의 정량 분석에서, 세포가 시간에 따라 성숙함에 따라 표면 스트레스가 점진적으로 증가하는 것이 관찰되었다. 마찬가지로, 우리는 지느러미 역할을하는 PDMS 외팔보 암 (cantilever arm)의 작동으로 인해 생체 로봇의 움직임을 관찰했다. 장치의 수영 프로파일을 정량화함에 따라, 핀의 정지 각도에 의해 영향을받는 다양한 추진 모드가 관찰되었다. 운동 방향과 고동 주파수는 지느러미의 정지 각도에 의해서도 결정되었고, 142μm / s의 최대 수영 속도가 관찰되었다. 이 원고에서 우리는 조작 된 장치를 심근 세포로 채우는 과정과 생물학적 액추에이터 및 바이오로봇 활동을 평가하는 절차를 설명합니다.

얇은 PDMS 캔틸레버 (두께 25 μm)와 심근 세포로 만들어진 생물학적 액추에이터는 그림 1 의 장치의 개략도와 스크린 샷에서 볼 수 있듯이 수영 biorobot의 핵심을 구성합니다. 세포는 배양에서 24 시간 후에 수축을 나타 내기 시작하고, 외팔보의 굽힘은 날 2에 의해 관찰되었다. 장치의 측면 프로필은 매일 기록되었고, 표면 스트레스는 칸틸 레버 암을 사용하여 캔?...

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Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

이 연구에서는 기능화 된 엘라스토머 캔틸레버 암을 갖춘 생물학적 액추에이터와 자체 안정화 수영 biorobot에 심근 세포를 뿌리고 배양하여 시간에 따른 생화학 및 생체 역학 특성을 분석했습니다.

심장 근육 세포 기반 액츄에이터 및 자체 안정화 바이오 오봇 - 제 2 부

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

cardiac-muscle-cell-based-actuator-self-stabilizing-biorobot-part

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.7K 조회수.  University of Notre Dame.  이 연구에서는 기능화 된 엘라스토머 캔틸레버 암을 갖춘 생물학적 액추에이터와 자체 안정화 수영 biorobot에 심근 세포를 뿌리고 배양하여 시간에 따른 생화학 및 생체 역학 특성을 분석했습니다. 

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Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to target cells or tissue without any subsequent damage. Therefore, in vitro experiments are of increasing interest. Various methods of applying shock waves onto cell cultures have been described. In general, all existing models focus on how to best apply shock waves onto cells.
However, this question remains: What happens to the waves after passing the cell culture? The difference of the acoustic impedance of the cell culture medium and the ambient air is that high, that more than 99% of shock waves get reflected! We therefore developed a model that mainly consists of a Plexiglas built container that allows the waves to propagate in water after passing the cell culture. This avoids cavitation effects as well as reflection of the waves that would otherwise disturb upcoming ones. With this model we are able to mimic in vivo conditions and thereby gain more and more knowledge about how the physical stimulus of shock waves gets translated into a biological cell signal (&#8220;mechanotransduction&#34;).

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Therefore in vitro experiments are of increasing interest. We therefore developed a model for in vitro shock wave trials (IVSWT) that enables us to mimic in vivo conditions thereby avoiding distracting physical effects.

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Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

연구

생체공학

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

엔지니어링 혈관을 근육 플랩

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living components. Due to their inherent advantages, biorobots are gaining interest as alternatives to traditional fully artificial robots. Various studies have focused on harnessing the power of biological actuators, but only recently studies have quantitatively characterized the performance of biorobots and studied their geometry to enhance functionality and efficiency. Here, we demonstrate the development of a self-stabilizing swimming biorobot that can maintain its pitch, depth, and roll without external intervention. The design and fabrication of the PDMS scaffold for the biological actuator and biorobot followed by the functionalization with fibronectin is described in this first part. In the second part of this two-part article, we detail the incorporation of cardiomyocytes and characterize the biological actuator and biorobot function. Both incorporate a base and tail (cantilever) which produce fin-based propulsion. The tail is constructed with soft lithography techniques using PDMS and laser engraving. After incorporating the tail with the device base, it is functionalized with a cell adhesive protein and seeded confluently with cardiomyocytes. The base of the biological actuator consists of a solid PDMS block with a central glass bead (acts as a weight). The base of the biorobot consists of two composite PDMS materials, Ni-PDMS and microballoon-PDMS (MB-PDMS). The nickel powder (in Ni-PDMS) allows magnetic control of the biorobot during cells seeding and stability during locomotion. Microballoons (in MB-PDMS) decrease the density of MB-PDMS, and enable the biorobot to float and swim steadily. The use of these two materials with different mass densities, enabled precise control over the weight distribution to ensure a positive restoration force at any angle of the biorobot. This technique produces a magnetically controlled self-stabilizing swimming biorobot.

In this two-part study, a biological actuator was developed using highly flexible polydimethylsiloxane (PDMS) cantilevers and living muscle cells (cardiomyocytes), and characterized. The biological actuator was incorporated with a base made of modified PDMS materials to build a self-stabilizing, swimming biorobot.

심장 근육 세포 기반 액츄에이터 및 자체 안정화 비 오로봇 - 1 부

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. Human-induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), human cardiac fibroblasts (HCFs), and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) are isolated and used to generate a cell suspension with 70% iPSC-CMs, 15% HCFs, and 15% HUVECs. They are co-cultured in an ultra-low attachment "hanging drop" system, which contains micropores for condensing hundreds of spheroids at one time. The cells aggregate and spontaneously form beating spheroids after 3 days of co-culture. The spheroids are harvested, seeded into a novel mold cavity, and cultured on a shaker in the incubator. The spheroids become a mature functional tissue approximately 7 days after seeding. The resultant multilayered tissues consist of fused spheroids with satisfactory structural integrity and synchronous beating behavior. This new method has promising potential as a reproducible and cost-effective method to create engineered tissues for the treatment of heart failure in the future.

This protocol describes a net mold-based method to create three-dimensional scaffold-free cardiac tissues with satisfactory structural integrity and synchronous beating behavior.

비 계-무료 3 차원 심장 조직 창조의 그물 형 기반 방법

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to nanomolar ranges, several orders of magnitude less than many physiological ligand concentrations. Optical nanostructures called zero mode waveguides (ZMWs), which are 100&#8722;200 nm in diameter apertures fabricated in a thin conducting metal such as aluminum or gold, allow imaging of individual molecules at micromolar concentrations of fluorophores by confining visible light excitation to zeptoliter effective volumes. However, the need for expensive and specialized nanofabrication equipment has precluded the widespread use of ZMWs. Typically, nanostructures such as ZMWs are obtained by direct writing using electron beam lithography, which is sequential and slow. Here, colloidal, or nanosphere, lithography is used as an alternative strategy to create nanometer-scale masks for waveguide fabrication. This report describes the approach in detail, with practical considerations for each phase. The method allows thousands of aluminum or gold ZMWs to be made in parallel, with final waveguide diameters and depths of 100&#8722;200 nm. Only common lab equipment and a thermal evaporator for metal deposition are required. By making ZMWs more accessible to the biochemical community, this method can facilitate the study of molecular processes at cellular concentrations and rates.

Described here is a nanosphere lithography method for parallel fabrication of zero mode waveguides, which are arrays of nanoapertures in a metal-clad glass microscopy coverslip for single molecule imaging at nano- to micromolar concentrations of fluorophores. The method takes advantage of colloidal crystal self-assembly to create a waveguide template.

고농도 단일 분자 현미경 검사용 제로 모드 파도가이드 제조

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...