이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (31530045 및 31371500, YAZ, 31401245, QCY), 중국 과학 기술부 (2014CB964800), 중국 과학원 (XDB19000000 - YAZ), 중국 세포 생물학 학회 (Early Career Fellowship to QCY).

실험 절차는 승인 된 프로토콜 SIBCB-NAF-15-002-S335-003에 따라 중국 과학원 상하이 생화학 및 세포 생물학 연구소 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 1. 마우스 유선으로부터의 VESCs의 분리 <ol><li> 유선 선 수확 및 조직 소화. <ol><li> 조직 기증자로 무게가 20에서 25 g 사이 인 8 주 된 액틴 -GFP 성숙한 처녀 기자 마우스를 사용하십시오. 참고 : 기증자로부터 유래 한 세포는 GFP 발현에 의해 쉽게 추적 될 수 있습니다. </li><li> RPMI1640에 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 펜 / strep 및 25 MM HEPES로 구성된 조직 소화 기본 매체를 준비합니다. 0.22 μm의 필터를 통해 혼합물을 여과하고 물로 37 ° C로 예열하고 사전 예열하십시오. </li><li> CO 2 챔버에서 생쥐를 희생. 첫 번째 수직 피부를 만들어서 사타구니 유선의 네 번째 쌍을 해부합니다.(또는 외과 용 가위)를 사용하여 하 복부 중간 선에서 정중선 검사. 부드럽게 한쪽으로 포 using를 사용하여 사타구니의 유선을 노출 피부를 껍질. 양쪽에서 사타구니의 제 4 유방 땀샘을 얻고 가위로 6cm 페트리 접시에 잘게 자릅니다. <ol><li> 다진 조직의 총 무게를 측정하고 50 ML 튜브에 놓으십시오. 참고 : 결과 조직 뭉치가 각 조각에 대해 1mm 3 보다 작은 지 확인하십시오. 전형적인 수확량은 동물 당 약 5,000 VESC입니다. </li></ol></li><li> 조직 말단 1g 당 10mL의 양으로 50mL 뚜껑이 달린 원심 분리 튜브에서 소화 기질을 준비한다. 소화 완충액을 구성하는 소화 기질 10 mL 당 300 단위의 농도로 콜라게나 제 제 3 형을 첨가하십시오. 균등하게 섞어서 티슈 말에 첨가합니다. </li><li> 수평으로 50-mL 원심 분리 튜브를 흔들 플랫폼에 놓고 속도를 100 rpm으로 설정하고 온도를 37 ° C로 설정합니다. 흔들다유방 조직 2 시간. 적절한 소화가 이루어 지도록 튜브를 20 분마다 점검하고 수동으로 흔들어주십시오. 참고 : FACS 이전의 조직 소화의 목적은 고체 조직으로부터 단일 세포 용액을 준비하는 것입니다. 따라서 소화가 끝날 때까지는 내용물이 눈에 보이는 조직 조각이없는 두꺼운 용액이어야합니다. </li></ol></li><li> 단일 셀 솔루션 준비. <ol><li> 소화 후 미리 데워진 멸균 된 PBS로 50 mL 원심 분리 튜브를 충전하고 균등하게 혼합되도록 튜브를 뒤집습니다. 튜브를 200 xg에서 5 분간 원심 분리하여 세포 펠렛을 얻습니다. </li><li> 상등액을 제거하고 세포 펠렛을 풀어 튜브의 바닥을 가볍게 치십시오. 적혈구를 용해시키는 완충액 3 mL (재료 표 참조)를 첨가하고 실온 (RT)에서 조직 배양 후드에서 5 분 동안 적혈구를 제거합니다. </li><li> 멸균 PBS 10 ML을 추가하고 균등하게 섞어 튜브 반전. 5 분 200 XG에서 원판 내용물을 원심 분리기 및 디스크상징액을 얻는다. 미리 데워진 0.05 % 트립신 3 mL를 넣고 5 분 동안 37 ℃에서 튜브를 보관하여 나머지 조직을 추가로 소화시킵니다. </li><li> 예열 된 IMDM 3 ML을 추가하고 100 μl의 DNase I 용액을 첨가하십시오 (PBS 1 mL에 희석 한 DNase I 0.25 mg). 튜브를 37 ° C에 보관하여 DNA 필라멘트를 분해하십시오. 세포 솔루션을 얻기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 조직 혼합물을 전달하십시오. 효소 소화를 중화하기 위해 PBS + 5 % FBS 2 ML로 스트레이너를 두 번 씻어. </li><li> 세포를 펠렛으로 만들기 위해 5 분 동안 200xg에서 세포 혼합물을 원심 분리하십시오. 뜨는을 삭제하고 항체 얼룩에 대한 PBS + 5 % FBS의 1 ML에 세포 펠렛을 resuspend. </li></ol></li><li> FACS 기반 Procr + VESC 격리. <ol><li> 기증자 유방 조직에서 얻은 세포 혼합물을 발표 된 일상적인 프로토콜 8 항체 염색법을 실시하십시오. 참고 : 다음 항체가 사용되었습니다 : 항 마우스혈액 계통 -FITC, 항 마우스 CD31 (PECAM1) -PECY7, 항 마우스 CD105-APC (모두 1㎍ / mL의 농도로 사용), 항 마우스 CD201 (Procr) - 비오틴 (농도 2.5 μg / mL) 및 streptavidin-v450 (0.5 μg / mL의 농도로 사용함). <ol><li> 항체 염색 후 PBS + 5 % FBS로 세포를 충전하고 5 분 동안 200g에서 원심 분리합니다. 뜨는을 버리고 PBS + 5 % FBS 1 ML와 세포를 resuspend. 40 μm 셀 스트레이너로 걸러냅니다. FACS 정렬까지 얼음에 놓습니다. </li></ol></li><li> Procr + VESC를 분리하기 위해 FACS 기반 정렬을 수행하십시오. <ol><li> 염색되지 않은 샘플과 각 단색 컨트롤을 분석하여 각 색상의 전압을 결정하십시오. 자동 형광 또는 배경 염색을 피하기 위해 보정 매개 변수를 계산하십시오. 원하는 세포 집단에 대한 적절한 게이팅 및 정렬을위한 템플리트를 설정하십시오. </li><li> FACS 정렬의 계층 구조를 설정하려면 먼저 파편을 제거합니다.모든 이벤트를 수행 한 다음 폭으로 트리거하여 이중선 또는 접착 성 세포 클러스터를 버립니다. 혈통 계통을 차단 한 다음 CD31 + 및 CD105 +를 사용하여 내피 세포 수를 정의합니다. 참고 : Procr + 세포는 FMO 대조군과 비교하여 CD31 + CD105 + EC로부터 분리되었다. 대표적인 FACS 분석 플롯이 그림 1에 나와 있습니다. FACS로 분리 된 VESC 모집단은 IMDM + 50 % FBS에 현탁시키고 추후 가공 할 때까지 얼음에 보관해야한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 유방 팻 패드를 사용 하여 생체 내 VESC 혈관 형성 분석 <ol><li> 이식을위한 주 EC를 준비하십시오. <ol><li> 10 % PBS + 5 % FBS로 FACS 정렬 세포를 탑 - 업하고 5 분 동안 200 xg에서 원심 분리하여 세포를 바닥에 내려 놓습니다. </li><li> 액체를 조심스럽게 흡인하고, hemocytometer를 사용하여 셀 번호를 계산하고, 세포막 펠렛을 기저막 매트릭스 혼합물 (consi100 ng / mL rmVEGF 및 60 U / mL 헤파린이 보충 된 50 % 기저막 매트릭스 및 20 % FBS가 함유 된 PBS)에 15,000 세포 / 15 μL의 작업 농도에 도달하도록 하였다. 참고 : 기저막 매트릭스 혼합물은 항상 얼음 위에 보관해야합니다. </li><li> 정렬 된 세포와 계수 된 세포를 연속적으로 희석하여 1.5mL 마이크로 튜브에 필요한 입력 농도에 도달 시키십시오. 최종 주입량이 총 15μL을 초과하지 않도록하십시오. 이식시 더 나은 내용 시각화를 위해 각 튜브에 0.1 % Trypan blue를 추가하십시오. 믹스하기 위해 철저히 피펫. 사용하기 전까지 얼음에 튜브를 보관하십시오. 참고 : 성공적인 선박 생성은 최소 100 VESC로 달성 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 주 EC를 유방 지방 패드에 이식하십시오. <ol><li> 수술 도구와 벤치 탑을 소독하십시오. 여러 동물에서 동일한 도구를 사용하는 경우에는 비드 살균기를 사용하여 소독 할 수 있습니다. </li><li> 3 주된 BALB / C 누드 마이크 마취귀하의 기관의 수의사와 IACUC에서 권장하는 마취 프로토콜을 사용하십시오. 수술 테이블에 등을 대고 각 마우스를 앙와위 자세로 눕습니다. 접착 테이프를 사용하여 팔다리를 고정시킵니다. </li><li> 면봉을 요오드 계 살균 용액에 담급니다. 수술 전 피부 표면을 살균하기 위해 마우스의 복부 전체를 닦으십시오. </li><li> 마우스의 복부 피부를 잡고 포셉으로 들어 올립니다. 외과 용 메스를 사용하여 1cm 길이의 작은 절개를 만듭니다. 뒷다리를 향해 길이가 약 0.5 - 1 cm 인 두 번 자르고, 뒤집힌 Y 자형 절개를하십시오. <ol><li> 집게와 면봉을 사용하여 복부에서 피부를 부드럽게 분리하고 피부를 옆으로 핀으로 쥐의 유방을 노출시킵니다. 입체경 아래에 마우스를 놓고 배율을 2.0X로 설정합니다. 유방 지방 패드를 명확하게보고 조작 할 수 있도록 초점을 조정하십시오. </li></ol></li><li> 장소 27G 1 / 2 &quot;needl얼음에 담아서 미리 차게하십시오. 바늘 부착 부위에 갇힌 기포를 제거하기 위해 기저막 매트릭스 혼합물이 들어있는 1 mL 주사기를 미리 준비하십시오. microcentrifuge 튜브의 뚜껑에 혼합 솔루션 15 μL를 피펫 다음 뇌관 주사기로 전체 볼륨을 대기음. </li><li> 사타구니 림프절 앞에서 유방 지방 패드를 고정 핀셋을 사용하여 잡고 약간 쉽게 들어 올리십시오. 뚱뚱한 패드에 주사기 바늘의 약 1/4을 부드럽게 삽입하십시오. <ol><li> 일시 중지 패드에서 핀셋을 놓아 주사기 바늘을 잡고 안정시킵니다. 액체가 누출되지 않도록 천천히 용액을 주입하십시오. 바늘을 꺼낼 때 누출을 최소화하기 위해 셀 혼합물이 고형화되었는지 확인하기 위해 몇 초 동안 기다리십시오. </li></ol></li><li> 흡수성 봉합사로 피부 플랩을 닫습니다. 크기 5-0 비 반응성 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 피부 플랩을 봉합하고 외과 의사 스타일의 매듭으로 각 상을 닫습니다.ately 0.3 cm 떨어져있다. 또는 상처 스테이플로 피부를 닫으십시오. </li><li> 회복을 위해 별도의 케이지에 운영 마우스를 배치합니다. 마취 된 마우스가 저체온증을 앓지 않도록 케이지 위에 가열 램프를 놓습니다. 케이지 바닥에 부드러운 종이와면을 놓아 쥐가 수술 후 따뜻한 상태를 유지하게하십시오. <ol><li> 모든 수령자가 완전히 깨어날 때까지 조심스럽게 마우스를 관찰하십시오. 다음 며칠 동안, 모든 동물에게 선제 적으로 수술 후 진통제를 투여하거나 시설 수의사의 지시에 따라 투여하십시오. 상처 감염이 발생하면 승인 된 동물 프로토콜에 따라 항생제를 바릅니다. 수술 상처가 상처 스테이플로 닫혀 있다면 상처가 완전히 닫힌 수술 10 일 후에 상처 클립을 제거하십시오. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 현미경 관찰을위한 전체 마운트 조직 준비 <ol><li> 조직 수확 <ol><li> 이식 후 2 - 4 주에 수혜자 BALB / c를 마취시킨다.단계 2.2.2에서와 같이, 체중 20g 당 0.12mL의 투여 량으로 2.5 % 마취제를 복강 내 주사하여 누드 마우스에게 투여 하였다. 참고 : 양성 혈관 성장은 세포 이식 후 2 - 4 주에 감지 할 수 있습니다. </li><li> 무균 PBS 50 μL에 resuspended 체중의 50 μg / 25 g의 복용량에 isolectin - 647 염료의 꼬리 정맥 주사와 수신 시스템의 순환을 라벨. 5 ~ 10 분의 쉬는 시간을 두십시오. CO 2를 사용하여 마우스를 희생한다. </li><li> 단계 2.2.4에 따라 세포가 처음 주입 된 유방 조직의 영역을 해부합니다. 외과 용 가위를 사용하십시오. 수술 블레이드를 사용하여 6cm 페트리 접시에 대략 3 ~ 4mm 3 큐브로 조직을 자릅니다. </li></ol></li><li> 조직 소화 및 항체 염색을위한 준비. <ol><li> 콜라게나 제 III가 보충 된 미리 데우는 소화 기질 (단계 1.1.2)의 10 ML로 채워진 15 ML 원심 분리기 튜브에있는 조직 조각을 소화(10 mL 당 300 U). </li><li> 100 rpm으로 설정 한 속도와 37 ° C로 설정된 흔들어 대는 플랫폼에 수평으로 15 mL 원심 분리 튜브를 놓고 약 1 시간 동안 조직 구조를 풀고 과도한 지방 세포 조직을 제거합니다. 참고 : 지방 세포는자가 형광을 생성하여 시끄러운 형광 배경을 만들 수 있습니다. 소화가 끝나면 조직 조각은 부드럽고 흐린 모양을 가져야합니다. 최적의 소화 기간은 잘게 썬 조직 조각의 크기에 따라 다르므로 최적의 결과를 얻으려면 적절하게 조정해야합니다. 조직 vasculature는 이미 형광 태그 Isolectin로 라벨이 붙어 있기 때문에, 모든 다음 절차는 빛으로부터 보호 수행해야합니다. </li><li> 10 분 동안 실온에서 PBS로 조직 조각을 씻으십시오. 형광을 보존하기 위해 4cm PFA (pH 7.2 - 7.4)로 반쯤 채워진 6cm 페트리 접시에 조심스럽게 조각을 놓아서 전체 장착 조직을 고정시킵니다. 페트리 접시 놓기락킹 플랫폼에 놓고 RT에서 30 분 동안 조직을 부드럽게 교반한다. 주 : PFA는 발암 물질이므로주의해서 취급해야합니다. </li><li> 나머지 PFA를 제거하고 각 세척 사이에 10 분 간격으로 전체 고정 세척 버퍼 (PBS에 0.1 % 트윈)로 고정 된 조직을 세 번 씻으십시오. </li></ol></li><li> 전체 - 마운트 조직 항체 얼룩. <ol><li> 2 ML 원심 튜브에 항체 얼룩 버퍼에 기본 항체를 희석. 4에서 밤새 일차 항체와 조직을 품어 ° C. 주 : 항체로서 래트 항 -CD31 (농도 : 10㎍ / ㎖) 또는 래트 항 -VE- 카데 렐 (CD144 / Cdh5; 농도 : 2.5㎍ / ㎖)을 사용 하였다. CD31과 VE-Cadherin은 내피를 인식하는 데 사용되는 세포 표면 마커입니다. 5x 항체 염색 완충액을 500 mM 말레 산, pH 7.5로 제조하고; 750 mM NaCl; 및 0.5 % (v / v) 트윈은 PBS에 용해된다. 신선한 1x 작업 용액을 준비 할 때만 적절한 혈청 용적 (5 %)을 첨가하십시오9 . </li><li> 항체 염색 버퍼를 제거하고 10 분 간격으로 세척 버퍼로 전체 마운트 조직 세 번 씻으십시오. 락커트 플랫폼에서 4 시간 동안 또는 4 ° C에서 밤새 2 차 항체 ( 재료 표 참조) 플러스 RT에서 DAPI와 조직을 품어. 참고 : 핵을 시각화하기 위해 5 μg / mL의 최종 농도로 DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하십시오. </li><li> 10 분 동안 각각 3 번 세척 버퍼로 전체 마운트 조직을 씻으십시오. 80 % 글리세롤 또는 80 % 자당에서 조직 조각을 밤새 품어 더 나은 보존을 위해 조직을 탈수하십시오. </li><li> 유리 슬라이드에 개별 조직 조각을 놓고 과도한 탈수 버퍼를 제거하십시오. 장착 매체와 조직을 덮고, coverslip을 배치하고 부드럽게 그것을 설정하는 조직을 쥐어 짜십시오. </li><li> 공 촛점 현미경 이미지 수집을 수행하십시오. 전체 장착 유방 땀샘의 경우, NA = 1.3 오일 목표를 가진 40X를 사용하여 이미지를 획득하십시오ve. 1,024 x 1,024의 광학 섹션 해상도와 1.0 - 1.2 μm의 레이어 분리로 Z 스택의 타일 스캔을 획득합니다. 참고 : 올바른 형광 신호를 포착하려면 필터 빔 스플리터를 PMT Gain 600-800의 게인 설정으로 트리플 다이크로 익 (TD) 488/553/638로 설정해야합니다. 다음의 여기 / 방출 원을 사용해야한다 : 488/509 nm의 여기 / 방출 최대 값을 갖는 mGFP; 532/588 nm의 여기 / 방출 최대 값을 갖는 mTomato; Alexa-647, 여기 / 방출 최대 값은 594/665; 및 DAPI (350 / 470의 여기 / 방출 최대 값). </li></ol></li></ol> 4. 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 계통 추적 <ol><li> 마우스 모델을 사용하여 Procr + VESC를 탐지합니다. <ol><li> Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + ( Procr CreERT2 라고 함) 노크 인 마우스를 사용하십시오. 참고 :이 마우스 모델에서는 CreERT2-IRES-tdTomato 카세트 <sProcr 11 의 첫 번째 ATG 코돈 다음에 10이 삽입됩니다. <ol><li> (R26 mTmG이라 함) Rosa26 mTtomatomGFP 리포터 균주 크로스 Procr CreERT2 마우스 생체 내에서 내인성 Procr 11 +되는 EC의 운명을 추적한다. GFP 발현을 사용하여 모든 내인성 Procr + EC 및 그 자손을 확인하십시오. </li></ol></li><li> 사춘기 단계 (5 주) 동안 체중 4 mg / 25 g의 용량으로 타목시펜 용액 11 (10 mg / mL의 저장 용액을 만들기 위해 땅콩 기름 + 10 % 에탄올에 용해 된 타목시펜 10 mg을 복강 내 투여) 이전) Procr + EC의 발달 과정을 추적 할 수 있습니다. </li><li> 3 단계에서 설명한 준비 단계에 따라 Whole-mount immunostaining으로 표지 된 세포의 클론 형성 효율을 분석합니다. 단기 (2 일) 및 연장 된 기간 (최대 10 개월). 그림 3을 참조하십시오. </li></ol></li></ol>

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저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

혈관 신생 분석은 혈관 역학을 연구하기위한 훌륭한 실험적 접근 방법입니다. 출생 개발 마우스 망막 혈관은 혈관 신생 (12)을 연구하는 매력적인 모델로 입증되었습니다. 비교적 접근하기 쉽지만 망막 혈관 내에서의 실제 조작은 다소 어렵습니다. 지금까지 가장 잘 설명 된 생체 내 이식은 수혈 마우스의 옆구리 부위에 피하로 주사하거나 주입하는 피하 시험입니다. 이러...

개발과 항상성 동안, 혈관 성장과 개조는 신실하게 기관 성장과 수리에 따라 일어납니다. 혈관 신생은 선재 혈관으로부터의 새로운 혈관 생성을 설명하며, 이러한 동적 인 혈관 변화를 중재하는 주요한 힘으로 간주된다. 각 혈관은 내피 세포 (inner cells, ECs)의 층으로 안쪽에 늘어서 있으며 혈관 건축의 기초로 보인다. 오랜 시간 동안 항상성 (homeostasis) 동안 EC pool이 보충되는 메카니즘은 여전히 ​​명확하지 않았으며, 혈관 회전율이 성숙한 EC 증식의 결과인지 혈관 줄기 / 전구 세포 활동의 기여인지에 대한 주장이 제기되었다. 직접적인 생리 학적 증거가 없기 때문에 혈관 내피 줄기 세포 (Vascular endothelial stem cell, VESCs)의 존재와 세포 신원은 논란의 여지가있다. 줄기 세포 행동을 확인하는 데 사용되는 가장 일반적인 접근법 중 하나는 transplan추정 줄기 세포를 수령 마우스에 투여 이 방법 은 생체 내 후보 줄기 세포의 줄기 가능성을 측정합니다 . 이식은 먼저 조혈 시스템 2 의 계층 적 특징의 수립에 기여한 골수 줄기 세포 1 의 연구에 적용되었습니다. 내피 분야에서, 측면 피부 아래 피하에 삽입 된 기저막 매트릭스 ( 예 : matrigel) 플러그는 이식 된 EC의 혈관 형성 능력을 설명하기 위해 사용 된 생체 내 혈관 신생 분석 표준이었다. 3D 배양 시스템과 이식에서의 콜로니 형성을 포함한 여러 실험 방법은 잠재적 인 EC progenitor / VESC 집단을 3 , 4 , 5 , 6으로 제안했다. 그러나, 기저막 매트릭스에 내장 된 EC는 상대적으로 분리되어 있기 때문에주변 조직은 이식 된 세포의 혈관 신생 가능성을 완전히 탐색하는 데 필요한 최적의 틈새 환경을 제공하지 않습니다. 결과적으로, 매트릭스 플러그 내에 형성된 혈관은 주로 모세 혈관 유사하며 기능적으로 측정 불가능합니다. 유선은 출생 후 사춘기 및 임신 기간 동안 가장 강력한 성장을 보이며 발달합니다. 사춘기 단계에서 유방 상피는 주위의 혈관 구조물을 효과적으로 개장하는 동시에 유방 지방 패드 전체를 차지하도록 급속히 팽창합니다. 따라서 유선은 혈관 신생 연구에 훌륭한 모델입니다. 그것은 성장하는 유방 상피로부터 공간, 매트릭스 및 풍부한 혈관 신생 자극을 제공하며, 따라서 외인성 세포의 혈관 신생 가능성을 평가하기위한 이상적인 이식 부위이다. 또한 유방 지방 패드는 형성된 외인성 혈관이 숙주 순환 시스템과 통합되도록하여 functional 평가 및 피하 이식에 대한 이점을 나타냅니다. 시험 관내 배양 및 이식 시험은 세포 집단의 재생 특성을 조사하는 효과적인 방법이기는하지만, 세포가 원래의 서식처에서 제거됨에 따라 가소성을 자극 할 수 있으며 세포가 분리되면 변화가 유발 될 수 있음이 알려져있다 그들의 생리적 환경 7 . 그러므로 세포 내 운명의 직접적인 생체 내 증거를 얻는 것이 내피 개체군의 행동에 대한 현재의 이해를 발전시키는 핵심 접근법이다. 생체 내에서 줄기 세포의 생체 내 행동을 밝힐 수 있기 때문에 VESC의 확인과 신체 시스템의 특성 조사에 유전 학적 운명 매핑 ( 즉, 생체 내 혈통 추적)이 반드시 필요합니다. 평가했다. 계보 traci후보 VESC의 장기 지속성 ( 즉, 자가 갱신)과 기원 조직 ( 즉, 분화 효능)을위한 세포 유형을 생산할 수있는 능력에 대한 직접적인 증거를 제공한다. 이 프로토콜은 VESC의 혈관 생성 능력을 관찰하기위한 새로운 유방 지방 패드 이식 기술과 혈통 추적 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 현재 이용 가능한 분석법의 단점을 극복하고 VESC의 줄기 세포 특성을 최적으로 평가하는 새로운 방법을 제공합니다. 이러한 접근법은 병적 인 환경에서 혈관 세포 효능의 변화를 결정할뿐만 아니라 내피 집단의 행동 및 혈관 형성 특성을 평가하는 데 사용할 수있는 효율적인 도구입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1265">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:407px;">0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X)</td>
			<td style="width:263px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:208px;">25300-062</td>
			<td style="width:387px;">0.05% Trypsin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#181;m Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore Ltd.</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Methylbutanol-2, ReagentPlus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>24, 048-6</td>
			<td>Tert Amyl Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">222, Tribromethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T48402-25g</td>
			<td>222, Tribromethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>BD FAL</td>
			<td>352350</td>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>188105</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse CD105 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1051-82, clone MJ7/18</td>
			<td>for FACS analusis use at 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse CD201 Biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-2012-82</td>
			<td>for FACS analusis use at 2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0311-82, clone 390</td>
			<td>for FACS analusis use at 1 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD FACSJazz Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655489</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100190332</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase type 3</td>
			<td>Worthington-Biochem</td>
			<td>#LS004183</td>
			<td>Collagenase III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>sp8</td>
			<td>Confocal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2463-5VL</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey anti-Rat Cy3</td>
			<td>Jackson ImmunResearch</td>
			<td>712-165-150</td>
			<td>Secondary antibody, use at 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500342</td>
			<td>Froceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips</td>
			<td>FST</td>
			<td>11253-20</td>
			<td style="width:387px;">Forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>78022</td>
			<td>Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 &#181;l per test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279</td>
			<td>Glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscov&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>IMDM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora&#160; 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z32450</td>
			<td>Isolectin-647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel&#160; Matrix (growth factor reduced)</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse strain (Actin-GFP)</td>
			<td>Jax Laboratories</td>
			<td>3773</td>
			<td>Actin-GFP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse strain (C57BL/6)</td>
			<td>SLAC</td>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>C57BL/6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse strain&#160; (BALB/c nude)</td>
			<td>SLAC</td>
			<td>BALB/c nude</td>
			<td>Nude mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>5140-122</td>
			<td>Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>c20012500BT</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PRIM1640</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>c11875500CP</td>
			<td>PRIM1640</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti CD144</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550548</td>
			<td>for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti CD31-biotin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553371</td>
			<td>for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767-100ML</td>
			<td>Red blood cell lysing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Straight/Sharp-Blunt/10cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14028-10</td>
			<td>Fine Scissors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin eFluor 450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4317-82</td>
			<td>for FACS analysis use at 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>101551374</td>
			<td>TAM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>TritonX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle)</td>
			<td>COVIDIEN</td>
			<td>S1173</td>
			<td>Suture&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Disposable Scaplels</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>#10</td>
			<td>Scalpel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Betadine</td>
			<td>Yifeng Medical</td>
			<td align="right">20160101</td>
			<td>Antiseptic solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel mammary fat pad transplantation technique to visualize the vessel generation of vascular endothelial stem cells

내피 세포 (EC)는 혈관 건축의 기본 구성 요소이며 혈관 성장과 개조를 매개하여 적절한 혈관 개발과 항상성을 보장합니다. 그러나 내피 계통의 계층 구조에 대한 연구 는 생체 내에서 의 행동을 직접적으로 평가할 수있을뿐 아니라 액세스를 얻기위한 도구가 없기 때문에 여전히 어려움을 겪고 있습니다. 이 결점을 해결하기 위해, 유방 지방 패드를 사용하여 혈관 신생을 연구하는 새로운 조직 모델이 개발되었습니다. 유선은 사춘기 및 임신을 포함하여 출생 후의 단계에서 주로 발생하며, 그 동안 견고한 상피 증식이 광범위한 혈관 재 형성을 동반합니다. 유방 지방 패드는 성장하는 유방 상피로부터 공간, 매트릭스 및 풍부한 혈관 신생 자극을 제공합니다. 또한 유방 지방 패드는 복강 외에도 위치하여 외인성 세포의 혈관 신생 가능성을 평가할 수있는 쉽게 접근 할 수있는 접목 사이트가됩니다. 이 작품은 또한 효율성in vivo에서 혈관 내피 줄기 세포 (VESCs)의 표적 집단을 특이 적으로 표지하기 위해 형광 리포터 마우스를 사용하는 nt 추적 접근법. 이 계통 추적 방법은 후속 조직 전체 장착 현미경과 결합하여 표적화 된 세포와 그 자손을 직접 시각화 할 수 있으며이를 통해 증식 능력을 정량화 할 수 있고 분화 약속을 운명 매핑 할 수 있습니다. 이러한 방법을 사용하여 VESCs를 발현하는 양성 단백질 C 수용체 (Procr)의 개체군이 최근 여러 혈관계에서 확인되었다. Procr + VESCs는 새로운 EC와 혈관 주위 세포 모두를 일으키며, 발달, 항상성 및 상해 복구 중 혈관 신생에 적극적으로 기여합니다. 전체적으로이 원고는 VESC의 줄기 세포 특성을 평가하는 데 사용할 수있는 새로운 유방 지방 패드 이식과 생체 내 혈통 추적 기술을 설명합니다.

유방 VESC 격리 : 결과 이식 분석을위한 내피 개체군을 분리하기 위해, 성숙한 (8 주령) 처녀 마우스 유선을 공여체 재료로서 수확했다. 내피 세포는 항체 - 기질 세포 분류 기술을 사용하여 분리 하였다. 8 주령의 C57BL / 6 유방 선되는 EC의 VESC 인구의 FACS 분석의 대표적인 플롯 (허가 유 등. (8)로부터 <strong cl...

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A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

이 연구는 현미경 관찰을위한 whole-mount tissue preparation에 이어 유방 지방 패드 이식을 통한 혈관 내피 줄기 세포 (VESCs)의 증식, 분화 및 혈관 형성 가능성을 평가하는 새로운 접근법을 보여줍니다. 생체 내에서 VESC의 행동을 조사하기위한 혈통 추적 전략도 제시된다.

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.2K 조회수.  Chinese Academy of Sciences.  이 연구는 현미경 관찰을위한 whole-mount tissue preparation에 이어 유방 지방 패드 이식을 통한 혈관 내피 줄기 세포 (VESCs)의 증식, 분화 및 혈관 형성 가능성을 평가하는 새로운 접근법을 보여줍니다. 생체 내에서 VESC의 행동을 조사하기위한 혈통 추적 전략도 제시된다. 

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Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

연구

발생학

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

효율적인 방법은 탈분화 지방 세포를 얻는 방법

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. Consequently, these two cell populations play unique roles in cardiac diseases. Current studies involving isolated endothelial cells investigate cell populations consisting of both EECs and CECs. This protocol outlines a method to independently isolate these two cell populations for cell-specific characterization. Following the collection of the left and right ventricular free wall, endothelial cells from the outer surface and inner surface are separately liberated using a digestion buffer solution. The sequential digestion of the outer surface and the inner endocardial layer retained separation of the two endothelial cell populations. The separate isolation of EECs and CECs is further verified through the identification of markers specific to each population. Based on previously published single cell RNA profiling in the mouse heart, the Npr3, Hapln1, and Cdh11 gene expression is unique to EECs; while Fabp4, Mgll, and Cd36 gene expression is unique to CECs. qPCR data revealed enriched expression of these characteristic markers in their respective samples, indicating successful EEC and CEC isolation, as well as maintenance of cell phenotype, enabling further cell-specific functional analysis.

We present a protocol for the isolation of endocardial and coronary endothelial cells from rat hearts through sequential tissue digestion in a digestion buffer, cell collection from recurrent centrifuge cycles, and cell purification using anti-rat CD31 microbeads.

쥐 심장의 심실 무료 벽에서 내심 내피 및 관상 내피 세포의 격리

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...