1. 이식 상피의 준비 신선 또는 냉동 기증자 상피 조직은 해제 지방 패드로 이식하지만, 냉동 기증자 상피의 사전 준비 이식 효율에 최소한의 감소 (&gt; 85 % 효율)가 더 편리합니다 수 있습니다. 다음과 같이 냉동 기증 상피의 준비를 위해 프로토콜은 다음과 같습니다 : 기증자 이식 상피를 준비하기 전에, cryovials에 1ml에 대한 상피와 나누어지는에 대한 동결 미디어를 준비합니다. 필요한 때까지 이것은 최대 6 개월까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 고정 미디어 HEPES 및 NaHCO 3 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 10 %의 디메틸 sulphoxide (DMSO)와 버퍼 DMEM/F12 미디어를 포함하고 있습니다. 최근 euthanized 여성 마우스 내유 상피를 수확. <ol><li> 70 % EtOH로 마우스를 씻으십시오. </li><li> 복부 뱃속의 장액의 세포막을 관통하지 않고 치골에서 흉골에 걸쳐 신체의 벽을 통해 중간 화살 절단하십시오. 각 뒷다리 다리 (그림 1) 방향으로 치골의 초기 절개에서 경사 절단하십시오. </li><li> 거리에 시체 벽 아래쪽에있는 근막에 첨부된 5 일 사타구니 유선을 노출하는 장액의 세포막에서 몸을 벽 껍질. 이것을 달성하는 가장 좋은 방법은 아니 피어스 배면의 뱃속에주의하고, 곡선 포셉의 쌍 곡선 부분과 함께주의 깊게 장액의 세포막을 쥐고 것입니다. 동시에, 직선 톱니 모양의 집게와 외피의 절단 가장자리를 파악하고 거리에 장액의 세포막에서 몸을 벽을 가져옵니다. </li><li> 유선 내에 림프 노드를 식별합니다. 림프절은 유선 세 저명한 혈관의 교차로에 위치하고 있으며 지방 패드 (그림 2) 내에서 고밀도 결절로 느낄 수 있습니다. 눈 가위, 노드를 둘러싼 따다 지방 조직의 쌍 끝으로. 피부의 표피쪽에 포어 손가락으로, 지방 패드의 노드 밖 인상과 곡선 포셉 한 쌍의로를 공략 압력을 적용합니다. 림프 노드를 폐기하십시오. </li><li> 피부의 여백을 누른 상태, 곡선 포셉의 쌍 곡선 가장자리와 점점 거리 신체 벽에서 지방 패드 껍질 내유 지방 패드를 파악. 한 조각의 전체 유선을 제거로 마우스 등의 표면을 향해 지방 패드의 방향을 따르십시오. </li><li> 멸균 플라스틱 절단 블록에 유선 놔. 이 촉촉한 유지하는 선 (腺)의 표면에, 200 μl에 대한 미디어의 작은 금액을 추가합니다. 신선한 면도날로 1mm의 조각에 선 (腺)을 말하다. 네 부분으로 다진 선을 나누어 집게로 고정 매체 네 가지 cryovials 사이에 배포할 수 있습니다. 외부 구획에 이소 프로필 알코올의 250ml 가진 Nalgene &#39;미스터 프로 스티 셀 냉동실에 cryovials 넣어. 24 시간 동안 -70 ° C의 냉동고에 Nalgene 냉장고 놔. 필요한 때까지 액체 질소에 내유 조각 냉동 튜브를 저장 이식은. 각 cryovial은 4-8 호스트 마우스의 해제 지방 패드에 이식하기에 충분한 유선 조각이 포함됩니다. </li></ol> 2. 이식 세포의 준비 우리 연구실은 불후의 내유 상피 세포 라인, 내유 종양 세포 라인 또는 마우스에 기본 내유 세포 지방 패드를 해제 포함한 다양한 셀 유형을 이식했다. 다음과 같이 이식을위한 쉼표 - D 세포의 준비를 위해 프로토콜은 다음과 같습니다 : <ol><li> 쉼표 - D 세포는 DMEM을 포함하는 일반 MECL 미디어 양식입니다 F12는 2퍼센트 성인 소 혈청 (ABS), mEGF, 인슐린, Antimycotic / 항생제 (AB / AM)과 보완. </li><li> 하베스트 쉼표 - D 세포 세포 85 % -90 %의 합류 때. </li><li> 펠렛 세포 5 분 동안 1200rpm에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 신선한 MECL 미디어 세포를 Resuspend 5 × 10 6 / ML에 세포 농도를 조정합니다. </li></ol> 기본 내유 세포의 이식은 기본 내유 상피 세포는 마우스 5 일 내유 땀샘에서 기계 및 효소 분해를 통해 고립됩니다. F12 미디어를하여 원하는 농도 조정, 보통 5 × 10 6 / ML : 세포 DMEM에 resuspended 있습니다. 3. 마우스 내유 지방 패드를 비우는 방법에 대한 표준 절차 <ol><li> 삼주 이전 호스트 마우스를 마취. 내유 ductal 성장이 시작되지 않았음을 보장하기 위해 &lt;12g 아르 생쥐를 선택합니다. 우리는 2,2,2 - tribromoethanol의 체중 200mg/kg 사용합니다. </li><li> 마우스 anesthetized 후 복부가 조롱이다 있도록 단단히 수술 무대에 뻗은 팔다리와 복부 쪽 마우스를 구속. 이전 수술로 진통제를 관리, bupivacaine (&lt;1mg/kg) 또는 buprenorphine (0.05mg/kg) 중 하나는 subcutaneously. </li><li> 몇 mm 골반 위 포셉로 피부를 파악하고 복부에서 올려<html> . 니프는 가위로 피부와 치골에서 흉골에 걸쳐 신체의 벽을 통해 중간 화살 몫을 할 수 있습니다. 복부 뱃속의 피어스 장액의 세포막은하지 마십시오. 상처 클립은 소변을 마우스의 능력에 방해가되지 않도록하여 초기 절개도 요도에 가까이하지 마십시오. </li><li> 초기 절개에서 각 뒷다리 다리를 향해 골반에 걸쳐 중반 선에서 피부를 통해서도 경사 인하합니다. </li><li> 부드럽게 장액의 세포막을 파악하기 위해 곡선 포셉의 곡선 영역을 사용합니다. 피부의 상처 여백을 파악하고 거리에 장액의 세포막에서 몸을 벽을 끌어와 본문 벽 아래쪽에있는 근막에있는 5 일 사타구니 유선을 폭로하기 위해 조직 집게를 사용하십시오. </li><li> 젖꼭지, 노드와 노드 (그림 2)로 이어지는이 동맥을 부식 </li><li> 네 번째와 다섯째 분비를 분리합니다. 6 회 선의 안쪽으로의 성장을 방지하기 위해 다섯 번째 선 (腺)의 여백을 부식. </li><li> 노드의 (유두쪽으로 쪽) 그냥 가위로 복부 지방 패드를 통해 절단에 의해 네 번째 유선의 지방 패드를 나누십시오. 단단히 지방 패드의 복부 부분을 파악하고 한 조각의 몸 벽에서 멀리 잡아 곡선 집게를 사용하십시오. 두 슬라이드 사이에 지방 패드의 복부 부분을 누르면 Carnoy의 정착액을 포함하는 유리의 조직​​학 얼룩 요리에 넣어. 이 조직은 고정 및 해제 마진 (그림 3)를 확인하기 위해 카르민 명반 솔루션 나중에 물들일 것이다. 곡선 포셉과 유선의 모든 흔적을 제거하는 지방 패드의 제거 부분의 지역 주변의 근막를 청소합니다. </li></ol> 4. 지방 패드를 비우는 방법에 대한 대체 &quot;아끼며 사용하는 방법 하나는 마우스 내유 지방 패드를 비우는 방법에 대한 표준 절차와 능력이 될 후에, 그들은 브릴 외. (2008) 2 개발한 적은 침입 살려주는 절차를 시도하는 것이 좋습니다. <ol><li> 표준 절차로 마우스를 준비합니다. </li><li> 네번째 사타구니 유선의 젖꼭지를 잡고 가위 끝에있는 유두 주변 3-5mm의 둘레 서클 컷. </li><li> 피부의 상처 부분을 분리하고 구멍을 통해 네 번째 사타구니 유선을 그려 멀리 떨어진 신체의 젖꼭지를 당겨. </li><li> 노드를 식별합니다. 구멍을 통해 노드와 6 일 유선을 부식하는 소작을 사용합니다. </li><li> 그냥 노드 앞에 5 일 유선의 가장 피상적인 부분을 잘라 분리. 피부 및 내유 지방 패드가 포함된 상피 부분의 젖꼭지, 원형 지역은 한 조각으로 제거됩니다. </li></ol> 5. 조직 / 세포 이식 <ol><li> 이식 상피 조각 들어, 서리를 없애다 상피의 cryovial와 DMSO를 희석하기 위해 새로운 미디어를 포함하는 페트리 접시에 상피 조각을 전송합니다. 새로운 상피에 대한 가위 팁으로 지워 지방 패드의 작은 구멍이나 주머니를 확인하십시오. 바늘 집게와 포켓에 기증 상피의 1mm의 조각을 넣어. 조직이 자리에 남아 있도록 바늘 집게를 철회 등 조직 포셉과 닫힌 주머니를 잡아. </li><li> 이식 세포의 경우, 22s 게이지 바늘로 50μl 해밀턴 주사기를 사용하여 각 지방 패드로 미디어 10 μl의 세포를 주입 50000. </li></ol> 6. 휴관일 / 마우스의 리바이벌 <ol><li> 폐쇄 피부를 정렬. 피부의 여백을 반대 이해, 포셉 그들을 함께 보유하고있는 복부 뱃속의 장액의 세포막에서 멀리 리프트와 상처에 클립 닫습니다. 일반적으로, 그것은 중간 화살 절개 및 표준 절차에 대한 각각의 경사 절개 하나의 클립을 닫습니다 두 클립을 사용해야합니다. 요도를 방해하지 마십시오. 그것은 치료와 함께 중간 화살과 경사 incisions의 교차로에서 피부에 격차를 가까이 할 수 있습니다. 살려주 절차는 각 측면에 대해 하나 상처 클립이 필요합니다. </li><li> . 그녀의 새장에 마우스를 놓고 마우스가 부활 때까지 가열 램프 아래에있는 새장을 유지. </li><li> 상처 클립 2 주 후에 제거되어야합니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 절개 패턴의 데모. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 림프절, 혈관, 유두 및 내생 상피의 위치. 위치에 표시를 부식. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 전체 마운트는 내생 상피는 동그라미 내의 지역 제한 때문에 마진이 &#39; &quot;분명합니다 보여줍니다. 7. 대표 결과 _r.jpg &quot;고도 =&quot;그림 4 &quot;/&gt; 그림 4. 지워집 여백을 보여주는 삼주 이전 마우스에서 제거 지방 패드의 전체 탑재합니다. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 내생 내유 상피에서 벗어날 지방 패드를 보여주는 10주 된 마우스에서 전체 탑재합니다. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6. Hematoxylin 및 10주 된 마우스에서 지워집 지방 패드의 eosin 스테인드 섹션을 참조하십시오. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="그림 7" /> 그림 7. 이식 상피에서 개발된 일반 내유 ductal 나무를 보여주는 10주 된 마우스에서 전체 탑재합니다. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="그림 8" /> 그림 8. Hematoxylin 및 이식 상피에서 개발 내유 관의 eosin 스테인드 섹션을 참조하십시오. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="그림 9" /> 이식 상피에서 개발한 내유 종양의 그림 9. Hematoxylin 및 eosin 스테인드 섹션을 참조하십시오.

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	<li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice.">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li><li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis.">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li><li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development.">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li><li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -. L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li><li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer.">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li><li>Wagner, K. -. U., Boulanger, C. A., Henry, S. g. a. g. i. a. s., Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females:+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal.">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li><li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB/c-Trp53+/-+mice.">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li></ol>

이 보고서에서는, 우리는 내유 상피 이식을위한 준비에서 마우스 내유 지방 패드를 청소 두 가지 다른 방법을 제시한다. 표준 절차는 DeOme 외 의해 1959 년 개발 이후 사용되었습니다. 1보다 침략 동안 유선의 구조와 방향을 쉽게 볼되기 때문에, 표준 방법은 초보자 훈련에 대한 선호하는 방법입니다. 그러나, 살려주는 프로 시저가 있기 때문에 몇 가지 장점 2의 경험 많은 외?...

mammary epithelial transplant procedure

이 문서에서는 설명하고 DeOme 킬로바이트 외 개발한 지방 패드 통관 절차를 비교합니다. 1 브릴 B 외 개발한 살려주는 절차를. 2, 내유 상피 이식 절차가옵니다. 그것은 내유 상피의 중요한 개발 사춘기 전까지는 발생하지 않는다는 사실을 활용하기 때문에 내유 이식 절차는 널리 내유 생물학 자에 의해 사용됩니다. 연령 3 주가, 내유 상피 나무의 성장은 유두 부근에 갇혀 있으며, 지방 패드 내유 상피의 대부분 찾아볼 수 있지만, 나이 7주하여 상피 ductal 나무가 전체 지방 패드에 걸쳐 확장됩니다. 따라서 상피를 포함하는 지방 패드의이 작은 부분, 유두 및 림프 노드 사이의 지역은, 시대의 삼주에서 제거하면, 내생 상피는 내유 지방 패드를 삽입하지 않습니다 그리고 지방 패드는 &quot;해제로 설명되어 있습니다 &quot;. 이때, 다른 소스에서 내유 상피는 그것이 지방 패드 밖으로 내유 ductal 나무를 확장할 수있는 가능성이 해제 지방 패드에 이식 수 있습니다. 이 절차는 결정, 4,5 제한 희석에 세포를 이식하여 내유 줄기 세포의 식별에, 전체 동물 3 유전자형의 혼란함을 주죠 효과없이 유전자 변형 내유 상피 조직의 종양 표현형의 심사 등 많은 실험 모델로 이용되어 hyperplastic nodules는 내유 종양 6을 진행하고, 내유 상피 7,8의 행동에 대한 사전 호르몬 노출의 효과를 평가한다면. 3 주 된 호스트 마우스, anesthetized 아르 청소하고 수술 무대에서 구속. 중간 화살 절개는 피부를 통해서도했지만, 치골에서 흉골을 연장하지 복막. 것입니다 경사 인하는 각 다리 방향으로 골반에 걸쳐 중반 화살 절개부터 피부를 통해서 만들어집니다. 피부는 4 사타구니 유선을 폭로하기 위해 멀리 복막에서 가져온 것입니다. 지방 패드가 림프절로 지방 패드 조직 앞쪽에를 제거하여 지워집니다. 상피 조각이나 상피 세포가 남아있는 해제 지방 패드로 이식되고 마우스가 닫힙니다.

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Mammary Epithelial Transplant Procedure

이 문서 DeOme 킬로바이트 개발한 절차를 보여줍니다<em&gt; 외.</em&gt; (1959)와 브릴 B 개발한 아끼며 사용하는 절차<em&gt; 외.</em&gt; (2008) 내유 조각, 내유 상피 세포, 또는 내유 종양 세포 이식을위한 준비 사춘기 마우스 4 사타구니 내유 지방 패드를 청소하십시오.

내유 상피 이식 절차

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Research

JoVE Journal

Biology

30.9K 조회수.  University of Massachussetts. 이 문서 DeOme 킬로바이트 개발한 절차를 보여줍니다 외. (1959)와 브릴 B 개발한 아끼며 사용하는 절차 외. (2008) 내유 조각, 내유 상피 세포, 또는 내유 종양 세포 이식을위한 준비 사춘기 마우스 4 사타구니 내유 지방 패드를 청소하십시오.

비디오: Mammary Epithelial Transplant Procedure

Investigating the Immunological Mechanisms Underlying Organ Transplant Rejection

면역 메커니즘 찍힌 장기 이식 거부를 조사

연구

생물학

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

마우스 내유 상피 세포는 Lactogenic 차별 동안 Mammospheres를 형성

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4 has resulted in important insights into mechanisms of metastatic behavior such as migration, invasion and intravasation of tumor cells5, 6, angiogenesis3 and immune cells response7-9. We have recently reported a technique to image orthotopic mammary carcinomas over multiple intravital imaging sessions in living mice10. For this, we have developed a Mammary Imaging Window (MIW) and optimized imaging parameters for Dendra211 photoswitching and imaging in vivo. Here, we describe the protocol for the manufacturing of MIW, insertion of the MIW on top of a tumor and imaging of the Dendra2- labeled tumor cells using a custom built imaging box. This protocol can be used to image the metastatic behavior of tumor cells in distinct microenvironments in tumors and allows for long term imaging of blood vessels, tumor cells and host cells.

Intravital photoswitching and tracking of Dendra2-labeled tumor cells through the Mammary Imaging Window is a technique which allows us to image the metastatic behavior of tumor cells in chosen tumor microenvironments over a timescale of days.

내유 이미징 창문 Dendra2 Photoswitching

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

Right Hemihepatectomy by Suprahilar Intrahepatic Transection of the Right Hemipedicle using a Vascular Stapler

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after preparing the extrahepatic hilar structures within the hepatoduodenal ligament, even in benign tumours or liver metastasis.1-5. Regional extrahepatic lymphadenectomy is an oncological standard in hilar cholangiocarcinoma, intrahepatic cholangio-cellular carcinoma and hepatocellular carcinoma, whereas lymph node metastases in the hepatic hilus in patients with liver metastasis are rarely occult. Major disadvantages of these procedures are the complex preparation of the hilus with the risk of injuring contralateral structures and the possibility of bleeding from portal vein side-branches or impaired perfusion of bile ducts. We developed a technique of right hemihepatectomy or resection of the left lateral segments with intrahepatic transection of the pedicle that leaves the hepatoduodenal ligament completely untouched. 6 However, if intraoperative visualization or palpation of the ligament is suspicious for tumor infiltration or lymph node metastasis, the hilus should be explored and a lymphadenectomy performed.

This video describes a right hemihepatectomy with intrahepatic transection of the right hemipedicle leaving the hepatoduodenal ligament completely untouched.

혈관 스테플러를 사용하여 마우스 오른쪽 Hemipedicle의 Suprahilar Intrahepatic의 절개에 의해 오른쪽 Hemihepatectomy

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

에있는 동물 캡 이식 (ACT) 어세를 사용하여 조직 결정 Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

쥐 대장 점막의 이외에 Microdissection을위한 냉동 절편 방법

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.