우리는 인간의 세포 HIO118를 제공하기 위해, 박사 앤드류 K. 윈, 캔자스 의료 센터의 대학에게 감사의 말씀을 전합니다. (; T028095 NYSTEM) 모자 건강 및 AFN에 인간 개발 (P50HD076210)의 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소 및 NYSTEM (C028125, C024174과의 보조금이 연구는 뉴욕 줄기 세포 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다 T028095), 건강 / 국립 암 연구소 (CA182413)와 아인에 난소 암 연구 기금 (327516)의 국립 연구소.

설명 된 모든 생체 내 작품은 코넬 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인된다. 난소 지방 패드 시험 법 1. 샘플 준비 <ol><li> 분리 및 문화 차의 두발 상피 (TE) 세포 <ol><li> CO에 의해 8 주령 처녀 β - 굴지 - 강화 된 녹색 형광 단백질 (EFGP) 또는 β-액틴 Discosoma 붉은 형광 단백질 (을 DsRed) 마우스에 자궁 경부 전위 다음이 관리 기증자 6- 안락사. 발가락 핀치에 의해 성공적으로 안락사를 확인합니다. </li><li> 흡수 드레이프, 복부 쪽이 위로에 개별 마우스를 놓은 다음 70 % 에탄올로 복부를 닦아냅니다. 신체 중앙선에서 횡 절개함으로써 손가락 끝 위에서 마우스의 머리와 꼬리쪽으로 절개 아래의 피부를 당기로 피부를 연다. </li><li> 무딘 집게를 사용하여 복막을 잡고 체강을 열 미세 가위로 절단을합니다. 조심스럽게 intestin의 코일을 밀어옆으로 전자 및 생식 기관을 찾습니다. </li><li> 미세 집게로 한 자궁 경적을 선택하고 자궁 뿔이 분리 점 이상 0.5 cm를 잘라. 자궁 경적을 누른 상태에서, 결합 자궁 뿔에 부착 조직, 자궁 관 난소와 난소 지방 패드를 멀리 해부하다. 6 ml의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 함께 접시에 해부 생식 기관을 배치합니다. 두 번째 생식 기관을 진행합니다. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛에 접시를 전송하고 멸균 PBS 6 ml의 조직을 3 회 씻는다. 바이오 안전성 캐비닛에있는 해부 현미경 작업을 계속합니다. 미세 핀셋 자궁 뿔을 잡아와 자궁 - 난관 접합부에서 절단하여 자궁 관에서 자궁 경적을 분리합니다. 25 G 바늘을 사용하여 난소를 둘러싼 난소 점액낭을 잘라. 주 : 점액낭 난소가 제거 된 후, 박리가 완료되고 개개의 자궁 관의 PBS 용액에 남아있다. </li><li> 자장하게 이동3.5 cm 접시에 PBS의 50 μl의 강하 전자 자궁 튜브와 28 게이지 바늘을 사용하여 0.1 mm 조각으로 말하다. 200 μL 소화 버퍼 1 (둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM) F12이 (햄) 매체가 300 단위 ml의 -1 콜라게나 100 단위 ml의 -1 히알루로 보충) 및에 전송 5 % CO에서 37 ° C에서 1 시간 동안 배양 2 배양기. </li><li> 배양 후, 1 ml의 0.25 %의 트립신 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추가하고 1 ML의 피펫 팁 (일명 블루 팁) 3 분간 20 배의 도움으로 솔루션을 일시 중지합니다. (햄) 매체는 2 % 소 태아 혈청을 포함하는 5 ml의 + 4 ° C DMEM / F12를 추가합니다. </li><li> ((햄) 매체는 7 밀리그램 ml의 -1 스파 아제 (Dispase) II 10 μg의 ml의 -1 디옥시리보 뉴 클레아 제 I 보충 원심 분리 (600 RCF, 5 분, 실온 (RT))에 의해 조직을 수집하고 1 ML의 소화 버퍼 2 (DMEM의 F12를 추가 DNase의의 I)). 1 ml를 피펫 TI의 도움으로 조직 펠렛을 20 회 일시 중단피. </li><li> 5 ml의 무 혈청 완전한 마우스 난관 상피 세포 성장 매체 (M-TE-GM, 표 1)를 추가합니다. </li><li> 원심 분리하여 세포 (600 RCF, 5 분, RT)을 수집합니다. 일시 중지 및 혈구로 세포를 계산, 1 ml의 M-TE-GM을 추가합니다. 종자 1 × 10 5 24 웰 낮은 부착 판에 웰 당 1 ml의 세포 4 일 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 M-TE-GM에 품어. </li><li> 매일 매체를 변경합니다. </li><li> β - 액틴 EGFP 또는 β-액틴을 DsRed 쥐에서 배양 차 서스펜션 TE 세포의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. <ol><li> 24도 낮은 부착 판에서 TE 서스펜션 문화를 수집합니다. 1 ml의 0.25 % 트립신 - EDTA와 원심 분리기 (600 RCF, 5 분, RT) 및 일시 중단 세포 펠릿. 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 10 분 동안 인큐베이션. </li><li> 5 ㎖의 DMEM / F12 5 % 소 태아 혈청을 함유하는 (햄) 배지를 첨가함으로써 트립신 활성을 멈춘다. 원심 분리 (600 RCF, 5 분, RT)에 의해 세포 알약을 수집합니다. </li></ol></li><li> 세척 세포 펠렛을 두 번 차가운 PBS (4 ° C)의 4 ㎖로, 세포 펠렛 당 1 ml의 PBS를 추가하고 일시 중지합니다. 혈구에 의해 세포를 계산 1.7 ml의 원심 분리 튜브에 전송할 수 있습니다. 얼음에서 작업, 10 ㎕의 PBS에 1 × 10 5 세포를 추가 한 후 10 μl의 기저막 행렬을 추가합니다. 일시 중지 및 동물의 방에 얼음 운반 할 것. 참고 : 무균 조건 하에서 바이오 안전성 캐비닛에있는 모든 해부 및 조직 문화 작업을 수행합니다. </li></ol></li><li> 불멸화 된 인간 세포주의 제조 <ol><li> 별도로 성장 렌티 바이러스-EGFP 및 -mCherry 표시 인간의 불후의 난소 표면 상피 세포 lineHIO118 80까지 - 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 10cm 요리에 90 % 포화 상태. </li><li> 10 ml의 PBS로 두 번 설거지, 접시 당 1 ml의 0.25 %의 트립신 - EDTA를 추가하고 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 10 분 동안 배양한다. 10 ㎖의 DMEM / F12 5 % 소 태아 혈청을 함유하는 (햄) 배지를 첨가하여 반응을 정지. 수집원심 분리하여 세포 펠렛 (600 RCF, 5 분, RT). </li><li> 세척 세포 펠렛을 두 번 차가운 PBS (4 ° C) 10 ㎖로, 세포 펠렛 당 1 ml의 PBS를 추가하고 일시 중지합니다. 혈구에 의해 세포를 계산 1.7 ml의 원심 분리 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> 얼음에서 작업, 1.0 × 10 6 렌티 - mCherry 표시 셀 + 1.0 × 10 6 렌티-EGFP 10 μl의 PBS로 세포를 표지에 추가합니다. 10 μl의 기저막 행렬을 추가합니다. 일시 중지 및 동물의 방에 얼음 운반 할 것. </li></ol></li><li> 자궁 튜브의 제조 <ol><li> 1.1.1-1.1.5 단계에 설명 된대로 6에서 PBS에서 8 주 이전 처녀 β - 액틴을 DsRed 마우스 개별 자궁 튜브를 해부하다. 해부 현미경 PBS의 200 μL 드롭으로 하나의 자궁 튜브를 전송합니다. 부드럽게 mesosalpinx, 자궁 관의 세그먼트를 지원하는 폭 넓은 인대의 일부를 제거하여 핀셋, 28 게이지 주사 바늘의 도움으로 자궁 관 풀다. (2)의 드롭 단일 uncoiled 자궁 튜브를 배치00 μl의 얼음처럼 차가운 PBS받는 사람의 난소 지방 패드가 노출 이식을받을 준비가 될 때까지. </li></ol></li></ol> 2. 난소 지방 패드 이식 참고 : 각 동물 수술 사이에 악기를 소독. 준비하고 사전에 모든 장비를 배치. 이 비장를 방지로 오른쪽 난소 지방 패드 등의 이식이 우선이다. 그러나받는 사람은 모두 난소 지방 패드에 이식을 가질 수있다. <ol><li> 동계 마우스 또는 일차 전지의받는 등 심한 결합 된 면역 결핍 (SCID / NCR) 마우스를 사용합니다. 인간의 세포와 같은 HIO118 세포를 사용 놋 / SCID / 감마 (NSG) 마우스 나 SCID 마우스하십시오. </li><li> 0.15 ml / 10 g 체중의 투여 량 2,2,2- Tribromoethanol 단일 복강 내 주사로받는 마우스를 마취. 동물 후드, 가열 패드에있는 동물을 놓고 페달 반사 (발가락 핀치)의 손실에 의해 적절한 마취를 확인합니다. 그동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 적용동물 마취입니다. 수술 - 후 통증 치료 4 밀리그램 / g 체중의 투여 량에서 진통 케토 프로 펜과 동물의 피하에 주입한다. 참고 : 다른 방법으로 마취에 대한 이소 플루 란을 사용합니다. 유도 챔버에 놓고, 동물 0.8-1.5 L / 분, 2-3 %로 이소 플루 란 기화기에 산소 유량계를 조정한다. 챔버에서 마취 동물을 제거 후 수술을 시작, 마스크에서 이소 플루 란을 흡입 및 0.4-0.8 L / 분 1.5 %로 이소 플루 란 기화기에 산소 유량계을 설정할 수 있습니다. </li><li> # 40 가위로 수술 영역을 면도; , 영역에서 두 배의 외과 영역 모발 제거 70 % 에탄올 다음 포비돈 요오드 세 살균 수술과 면도 된 피부를 준비하고 멸균 드레이프 커버. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛에있는 해부 현미경으로 동물을 이동합니다. 직접 난소 지방 패드 위의 dorsomedial 위치에 절개하여 생식 기관을 노출. 참고 : 치명타iCal의 단계 : 정확한 피부 절개는 상처 치유를 촉진은 메스의 사용 단계 2.4 권장합니다. </li><li> 사용 무딘 미세 집게는 신경 및 주요 혈관의 손상을 최소화 조심스럽게 중간 선으로 절개를 통해 난소 지방 패드를 당깁니다. 중요한 단계 : 출혈이 발생하면, 수술을 중단하고 다른 숙주 동물에게 이식을 고려한다. </li><li> 28 게이지 경 바늘의 도움으로 해부 현미경의 제어하에 난소 지방 패드로 2-4mm 깊은 절개, 난소 위 3-4mm합니다. 중요한 단계 : 절개 만 지방 패드의 절반을 통과 있는지 확인; 바닥면까지 줄곧 천공하여 누설을 야기한다. 신속하고이 단계 후 지체없이 진행합니다. </li><li> 세포 이식의 경우, 세포 기저막 매트릭스 혼합물을 10 내지 20 μL의 주사기 (30 게이지 니들)을 채우고 지방 패드에 주입 절개. 자궁 관 이식의 경우, 자궁 관 재치를 데리러시간 미세 집게와 10 위 - 20 μl의 기저막 행렬은 얼음에 보관. 0.1 / 20 μl를 사용 XL (3 mm 정도 단축) 필터 팁 조직 및 기저막 매트릭스 정지를 픽업하여 지방 패드 절개로 해제를 졸업했다. </li><li> 기저막 행렬이 응고 다시 복막에 생식 기관을 배치하는 5 분 정도 기다립니다. 이 수술 봉합의 stiches와 두 개의 작은 상처 클립이나 수술 봉합사로 피부와 근육을 닫습니다. </li><li> 반복 제어 될 것 동물의 콘트라 측면 지방 패드에 PBS-기저막 매트릭스 혼합물을 이식 2.4-2.8 단계를 반복합니다. 중요한 단계 : 열 손실은 마취 된 쥐의 급격한 때문에 수술 후, 가열 패드에 동물을 배치합니다. </li><li> 동물 네이티브 장에 가열 패드에 복구하고 마취에서 완전히 깨어 때까지 동물을 관찰 할 수 있습니다. 이 sterna을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오리터로 누워. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다. </li><li> 수술 후 케이지에 음식을 건조뿐만 아니라 케이지 내부에 미리 젖은 음식 펠렛의 소수를 놓습니다. 다음 몇 일 동안 필요한 경우 수술 후 진통제를 적용하고 매일 상처를 검사합니다. 창상 감염이 발생하는 경우 승인 된 동물 프로토콜에 따라 항생제를 적용합니다. 상처가 완전히 폐쇄되면 수술 후 상처 클립 10 일 제거합니다. </li></ol> 3. 조직학 및 이미지 인식 <ol><li> 이식 수집 및 보존 <ol><li> 4 ml의 10 배 PBS 10 ml의 16 % 파라 포름 알데히드 용액으로 26 ML의 DDH 2 O를 혼합하여 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 제조 하였다. </li><li> 하나의 블록에 접목 난소 난소 지방 패드, 자궁 관, 1.1.1-1.1.4 단계에 설명 된대로 0.5 cm의 자궁을 해부하다. 즉시 2 ml의 4 % 파라 포름 알데히드에 배치하고 실온에서 2 시간 동안 고정한다. 동일한 동물로부터 비 접목 해부대조군으로서 PBS-기저막 매트릭스 혼합물을 이식 반대측 난소 지방 패드 시스템 (단계 2.9 참조). 수정과 동일한 방식으로 처리. </li><li> 정착 세척 후 5 분 동안 PBS로 3 회 조직 및 4 ℃에서 PBS에서 밤새 배양한다. </li><li> 난소 지방 패드의 전체 마운트 이미징 3.2.1 단계로 진행합니다. 참고 : 이미지 수집 조직이 얼 수 후 (3.3.1) 또는 파라핀 포함 (3.3.2)에 대한 처리. 4 ° C에서 PBS의 30 % 자당의 하룻밤 배양 냉동 조직의 품질을 향상시킵니다. </li></ol></li><li> 이미지 획득 <ol><li> 형광 첨부 컬러 카메라와 플랜 갖춘 4 배 목적 및 실체와 에피 형광 부착 고화질 컬러 카메라 장착 PBS 가득 요리 거꾸로 현미경을 사용하여 화상 난소 지방 패드 시스템 - 온 탑재 장소 아포 1xWD70, ED 계획 1.5xWD45 목표. </li></ol></li><li> 조직학 <ol><li> 수행원전체 마운트 이미지 수집 (3.2.1) 실험 영화와 집게를 사용하는 2 × 1cm의 조각에 냉동 조직 표본에 대한 매체를 포함하는 200 ~ 500 ㎕를 드롭 배치, 드롭에 조직을 전송합니다. 하나의 가장자리에 필름을 들고 1.8 ml의 극저온 유리 병에 조직 매체 드롭을 전송합니다. 유리 병을 닫고 액체 질소에 뛰어 들다. -80 ° C에서 냉동 조직을 저장합니다. </li><li> 또한, 표준 파라핀 삽입 진행합니다. 각 단계에 대한 조직 부피의 20 ~ 40 볼륨을 사용합니다. <ol><li> 실온에서 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 한번 65 % 에탄올에 담가 조직. </li><li> 실온에서 부드럽게 흔들어 30 분 동안 한 번에 70 % 에탄올에 조직을 담가. 이 단계에서 샘플 RT에서 개월 동안 저장 될 수있다. </li><li> 실온에서 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 한번 90 % 에탄올에 담가 조직. </li><li> 실온에서 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 한번, 95 % 에탄올에 담가 조직. </li><li> 실온에서 부드럽게 흔들어 30 분 동안 두 번 무수 에탄올 (200 증거)에 조직을 담가. </li> &lt;리&gt; 실온에서 부드럽게 흔들어 30 분간 클로로포름에 두 번 조직을 담가. </li><li> 58 ° C에서 부드럽게 흔들어 30 분간 파라핀에 한 번 조직을 담가. </li><li> 58 ° C에서 부드럽게 흔들면서 12 시간 동안 파라핀에 한 번 조직을 담가. </li><li> 58 ° C에서 3 시간 동안 파라핀에 한 번 조직을 담가. </li><li> 금속 조직학 금형에 조직을 배치하고 58 ° C 파라핀와 금형을 입력합니다. 파라핀의 상단에 플라스틱 조직학 카세트를 추가하고 4 ℃로 파라핀을 냉각. RT에서 파라핀 조직 블록 및 저장의 압축을 풉니 다. 참고 : 파라핀의 온도가 면역 조직 화학 염색에 적합한 조직의 최적의 보전을 위해 58 ° C를 초과하지 않아야한다. </li></ol></li><li> 또한, 표본 처리 젤과 파라핀 포함]를 준비합니다. <ol><li> PBS를 대기음 및 70 % 에탄올로 전체 마운트 조직을 전송합니다. 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션. 수조에서 예열 시험편을 60 ℃로 겔을 처리하는 단계를 포함한다. </li><li> PipettE 실험실 필름 늘어선 페트리 접시 위에 시료 처리 겔 200 μL. 사용하여 미세 해부 집게는 시편 처리 겔 드롭에 전체 마운트 조직 시스템을 전송합니다. </li><li> 시험편 가공 겔​​ 플러그 실온에서 고화, 4 ° C에서 10 분 동안 플러그를 고체화 할 수있다. </li><li> 조직 검사 폼 패드 사이에 끼워 조직학 조직 카세트에서 시료 처리 겔 포함 된 조직을 놓습니다. 단계 3.3.2-3.3.2.10과 파라핀에 포함. 참고 : 시료 처리 젤 삽입 손실을 방지하고 작은 깨지기 쉬운 조직 샘플을 보존 할 수 있습니다. 참고 : 냉동 또는 파라핀 삽입에 의해 보존 된 조직이 면역 조직 화학 염색 14, 15에 적합하다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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A., Nikitin, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+stem+cell+niche+in+the+pathogenesis+of+epithelial+ovarian+cancers.">Role of the stem cell niche in the pathogenesis of epithelial ovarian cancers.</a> Mol Cell Oncol. 1, 963435 (2014).</li><li>Ng, A., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovary+and+fimbrial+stem+cells:+biology,+niche+and+cancer+origins.">Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 625-638 (2015).</li><li>Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+cancer.">Cells of origin in cancer.</a> Nature. 469, 314-322 (2011).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2015.">Cancer statistics, 2015.</a> CA Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).</li><li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+high-resolution+imaging+of+epithelial+ovarian+cancer+by+laparoscopic+nonlinear+microscopy.">Strategies for high-resolution imaging of epithelial ovarian cancer by laparoscopic nonlinear microscopy.</a> Transl Oncol. 3, 181-194 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

우리는 상피 세포와 조직의 정확한 전달 및 검출을 허용 난소 지방 패드 이식 분석을 설립했다. 난소 지방 패드 분석 이식 절차는 적은 기술적으로 도전 intrabursal 주입 10-12보다 더 균일하고 복강 내 주입 구에 비해 이식 된 세포의 정확한 위치 수 있습니다. 또한, 웰 등 자궁 관으로 전체 기관의 장기 이식에 적합하다. 중요한 것은, 난소 지방 패드는 여성의 생식 시스템의 상피 세포에 대한 친숙한 미세 환경을 제공합니다. 그것은 재생 및 악성 변환하는 동안 인간 및 마우스 난소 및 난관 상피 세포의 분자 및 세포 특성의 연구에 특히 적합해야한다. 다른 장기 달리, 몇몇 연구는 암 연구의 상피에서 식별 및 줄기 세포의 특성에 초점을 맞추었다eproductive 기관 18, 19. 많은 암이 성체 줄기 세포 (20)로부터 발생한 것으로 생각되기 때문에 이러한 연구는 특히 중요하다. 상피 성 난소 암의 또 세포의 기원은 18 매우 논쟁의 여지가 남아있다. 상피 난소 암은 난소 암의 대부분을 차지, 미국 (21)에서 여성의 모든 암 관련 사망 중 5 위입니다. 기존의 이식 기술 9-12에 비해 여러 가지 장점을 가진 소성을 분석의 따라서 개발은 크게이 분야의 연구를 촉진해야한다. 난소 지방 패드의 표면 위치를 감안할 때, 작은 동물 이미징 시스템은 강한 형광 발광 생물 기자로 표지 engraftments에 후속하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 비선형 현미경 22 침습적 고해상도 라이브 영상 분석을 확립하는 것이 가능해야한다. 난소 지방 패드는 또한 기관 배양에서 유지 될 수 있도록함으로써,밀접 세포 조직 및 세포 외 기질을 recapitulating 조건 하에서 정상 및 종양 상피 조직의 3 차원 배양을 보내고. 앞으로의 연구는 이러한 유망한 가능성을 해결해야합니다. 몇몇 중요한 단계가 고려되어야한다. 가열 패드를 제공하고 수술 중 따뜻한 설치류 유지 크게 생존율을 향상시킨다. 지방 패드를 취급 상품의 불임이 접목 시스템이 멸균 유지되도록합니다. 우리의 경험, 이식의 성장 지연에 상당한 출혈이 결과에서. 중요한 것은, 지방 패드의 절개를 정확하게해야한다 지방 패드를 찢어 또는 출혈의 원인 통해 천공 때문이다. 응고제는 필요에 출혈을 멈추게하는 데 사용되어야한다. 개발하지 engraftments 경우, 분사 셀의 높은 농도를 고려해야한다. 첫 번째 성공의 outgrowths는 이식 후 일주 일찍 관찰하고 가장 눈에 띄는 것이어야한다 engraftments 할 수있다시술 후 한 달. 이식의 경우, 큰 직경 (23-25​​ G)와 바늘 (직경 10 ㎛ 이상)을 큰 셀 밀림을 방지 할 수있다. 그러나, 이러한 바늘은 지방 패드에 더 외상 할 수 있고, 그 사용이 사전에 시험해야한다. 실험을 위해 우리는 6 ~ 8 주 이전 기증자와받는 사람 마우스를 사용하고 있습니다. 두 목적을 위해 이하의 이상 마우스를 사용할 수있다. 그러나, 주입 된 세포의 수는 조절 될 필요가있다. 이하 도너 난소 지방 패드의 작은 크기도 고려 될 필요가있을 것이다. 어떤 방법과 마찬가지로, 마우스 난소 지방 패드 이식 분석의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 동계 면역 능력이 쥐가 쥐의 기본 세포 / 조직에 사용할 수 있지만, 우리의 기술은 NSG 인간 물질의 이식 SCID 마우스가 필요합니다. 이는 인간 상피 세포의 성장을 지원하기 위해 지방 패드를 인간화 가능 쉽다. 그러나, 우리는 아직이 방법을 테스트하지 않았습니다. 젊은 철의 사용남성은 낮은 사육 비용을 이끌 수있다; 그러나, 성숙한 처녀 암컷 마우스 (8 세 ~ 10 주)함으로써 더 큰 표본의 이식을 허용, 더 큰 지방 패드가 있습니다. 마지막으로, 실험실 직원은 절차의 신속하고 성공적인 실행을 보장하기 위해 동물 수술 훈련을해야합니다.

마우스의 특정 신체 부위에 세포 및 조직의 도입을 포함하는 이식 분석은 조직 재생 및 발암 연구 필수적인 접근을 나타낸다. 동 소성 이식 세포, 즉 네이티브 환경에 자신의 위치는, 성체 줄기 세포의 특성화에 특히 중요하다. 유방 줄기 세포의 존재가 제 1 마우스 선없는 유방 지방 패드에 유선 상피 단편 이식에 의해 제안되었다. 인간화 된 마우스 지방 패드 2에 생착 분석은 인간의 기본 유방 상피 세포의 재생 가능성과 정상적인 발전을 요점을 되풀이하는 데 사용되었다. 또한, 클리어 유방 지방 패드에 별개의 표현형 세포 유형의 직렬 및 제한 희석 유방 이식은 줄기 세포 3-5의자가 재생산 능력과 multilineage 분화를 시험하는 것이 중요했다. combinat에 이식 분석유전 적 혈통을 가진 이온은 유방 발암 5 원산지 셀의 증거를 제공하는 추적. 신장 이식 캡슐은 일반적으로 추정되는 전립선 줄기 세포 (6)의 특성을 테스트하기 위해 사용된다. 정상 및 종양 마우스와 인간의 췌장 organoids의 동 소성 이식은 암의 진행 7 변경 유전자와 경로를 한 것으로 밝혀졌습니다. 네이티브 환경의 중요성도 후 같은 유방 지방 패드, 어깨 지방 패드, 다시 피부 (8)과 같은 다른 위치로 땀샘의 engraftments 다양한 재생의 데모에 의해 지원되고있다. 복강과 난소 점액낭은 일반적으로 여성의 생식 기관 9-12의 상피 세포의 동 소성 이식을위한 장소로 사용된다. 이들 방법은 모두 많은 한계가있다. 세포를 복강 내 주사는 복강 다양한 분야에서 자신의 주입에 이르게함으로써 COM세포의 성장을 모니터링 plicating. 또한, 미세 환경의 변화, 예컨대 혈관, 신경 분포 및 면역 세포의 표현 정도와 같이 복강 다양한 분야에서 매우 중요 할 수있다. 난소 점액낭은 액체의 이하 10 μL의 주입을 허용, 매우 제한된 볼륨이 있습니다. 이로 인해 투여 될 수있는 세포의 양을 제한한다. 또한, 난소 점액낭에 주사 매우 기술적으로 어려울 수 있으며, 절차는 상당한 시간을 필요로한다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 난소 지방 패드의 특성의 장점을 가지고있다. 마우스 난소 지방 패드는 큰 크기를 가지며 난소 및 자궁 관에 인접하고, 수술을 용이하게 접근 할 수있다. 이는 말 영양막 마우스 난소 지방 패드 (13)에 이식 될 수 있다고보고되었다. 그러나 이러한 방법의 상세한 설명은 생략 하였다. 또한이 날 경우보고되지 않았다THOD는 성숙한 세포 및 조직에 적용될 수있다. 여기서는 마우스 및 여성 생식 기관의 인간 세포 이식을위한 신뢰성있는 방법을 설명하고,이 방법은 또한 장기 장기 이식에 적용 할 수 있음을 보여준다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1170">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">25 gauge needle</td>
			<td style="width:339px;">BD Becton Dickinson</td>
			<td style="width:155px;">305122</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:331px;">28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle)</td>
			<td style="width:339px;">Kendall</td>
			<td style="width:155px;">30339</td>
			<td>Part Number: 8881500014</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">basic fibroblast growth factor-2</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">F9786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">basement membrane matrix (Geltrex)</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:155px;">A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">&#946;-actin-DsRed mice</td>
			<td style="width:339px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:155px;">6051</td>
			<td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">&#946;-actin-EGFP mice</td>
			<td style="width:339px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:155px;">3291</td>
			<td>C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">bovine albumin</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">chloroform</td>
			<td style="width:339px;">VWR</td>
			<td style="width:155px;">EM-CX1058-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">collagenase/hyaluronidase</td>
			<td style="width:339px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:155px;">7912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">cryogenic vials</td>
			<td style="width:339px;">Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:155px;">377267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">dispase II</td>
			<td style="width:339px;">Worthington</td>
			<td style="width:155px;">NPRO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DMEM F12 (HAM&#39;s)</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">10-092-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNaseI (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td style="width:339px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:155px;">7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:331px;">embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.)</td>
			<td style="width:339px;">Sakura Finetek&#160;</td>
			<td style="width:155px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">epidermal growth factor</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">E4127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:339px;">Koptec</td>
			<td style="width:155px;">V1001</td>
			<td>to prepare 70%&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:339px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">filter tip 0.1-10/20&#181;lXL&#160;</td>
			<td style="width:339px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:155px;">1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FOXJ1 antibody</td>
			<td style="width:339px;">eBioscience</td>
			<td style="width:155px;">E10109-1632</td>
			<td>used at concentration 1:1000 (no unmasking)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">hydrocortisone</td>
			<td style="width:339px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">H0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">laboratory film (Parafilm M)</td>
			<td style="width:339px;">American National Can</td>
			<td style="width:155px;">PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">insulin-transferin-sodium selenite</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">I884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">isoflurane, 250 ml</td>
			<td style="width:339px;">Santa Cruz Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">sc-363629Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">low attachment plate 24-well</td>
			<td style="width:339px;">Costar</td>
			<td style="width:155px;">3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">MEM non-essential amino acids</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">25-025-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">metal histology molds</td>
			<td style="width:339px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:155px;">62527-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">microscope, inverted</td>
			<td style="width:339px;">Nikon</td>
			<td style="width:155px;">Eclipse TS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">microscope, stereo</td>
			<td style="width:339px;">Nikon</td>
			<td style="width:155px;">SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:331px;">Nod/SCID/gamma (NSG) mice</td>
			<td style="width:339px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:155px;">05557</td>
			<td>NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td style="width:339px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:155px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">paraffin (Paraplast, X-TRA)</td>
			<td style="width:339px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:155px;">23-021-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">PAX8 antibody</td>
			<td style="width:339px;">Proteintech</td>
			<td style="width:155px;">10336-1-AP</td>
			<td>used at concentration 1:1000 (no unmasking)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">PBS (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">&#160;21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:331px;">severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background)</td>
			<td style="width:339px;">NCI-Frederick Animal Production Program</td>
			<td style="width:155px;">01S11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">sodium pyruvate</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">25-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">specimen processing gel (HISTOGEL)</td>
			<td style="width:339px;">Richard-Allan Scientific</td>
			<td style="width:155px;">HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">sucrose</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Trypsin-EDTA, 25%</td>
			<td style="width:339px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation into the mouse ovarian fat pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

세포 및 조직 실험을 정확하게 해부 현미경 (도 1) 하의 난소 지방 패드로 이식 될 수있다. 예는 보편적으로 EGFP (그림 2A) 또는을 DsRed (그림 2B) 및 HIO118 16, 17 세포가 mCherry와 EGFP 렌티 바이러스로 표지 인간의 불후의 난소 표면 상피 세포 (- F 그림 2C)를 발현하는 마우스에서 파생 된 기본 마우스 난관 상피 세포를 포함한다. 이 접근법은 또한 마우스 자궁 관 (도 3)와 같은 기관 장기 이식에 적용 할 수있다. 면역 조직 화학 염색에 따르면, 모두 섬모 (FOXJ1 긍정적 14)과 분비 (PAX8 양성 15) 세포 이식 조직 (그림 3D 및 E)의 난관 상피 세포에서 유지됩니다. <img고도 = &quot;그림 1&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54444 / 54444fig1.jpg&quot;/&gt; 그림 1 :. 이식 (화살표)의 난소 지방 패드 이식 (A) 노출 영역입니다. (B) 절개 28 G 바늘 (화살표)에 의해 이루어진다. 피펫 팁 (화살표)에 의해 (C) UT / 지하 막 매트릭스 혼합 생착. (D) UT 접목 (화살표, 밝은 빨강, β - 액틴을 DsRed 마우스의 UT). FP, 지방 패드; 오븐, 난소; UT, 자궁 관. 스케일 바 = 2 mm이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54444/54444fig2.jpg" /> 그림 2 :. 이식 마우스 차 두발 상피 세포와 인간의 감지 불멸화 된 난소 표면 상피 세포 (A, B) 아웃<html> 기본 마우스 난관 상피 세포 팔일 동계 마우스에 이식 후 (A, 녹색) 및 β - 액틴을 DsRed (B, 레드) β - 굴지-EGFP 마우스의 (화살표)의 성장. (C, D)는 십일 NSG 생쥐에 이식 후 렌티-EGFP (녹색) 또는 렌티 - mCherry (빨간색) 중 표지 혼합 HIO118 세포 (화살표)의 Engraftments. (D) (C, 화살표)에서 확대 영역입니다. (E, F) 이식은 SCID 마우스 (화살표)에 D, 사십삼일 C에서와 같은 세포의 이식 후 개발했다. AD, F, 형광; E, 시야, FP, 지방 패드; 오븐, 난소; UT, 자궁 관. (A, B, DF) 스케일 바 = 500 μm의; (C) 스케일 바 = 1600 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 광고 / 54444 / 54444fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3 : 자궁 관 이식의 특성. (A) β - 액틴을 DsRed 마우스 육일 난소 지방 패드로 이식 후의 전체 자궁 관 (화살표) (화살표, 밝은 빨강). (B) (A)에 도시 이식과 지방 패드의 형광등 동결 절편. 레드,을 DsRed; 청, 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 핵으로 대조. (C) 자궁 관 이식 (화살표) NSG받는 사람 마우스 (화살표)에 이식 후 사십일. 파라핀 섹션. 올바른 모든 원칙 자궁 관 구성 요소의 보존 및 이식 관련 섬유화와 염증의 부족을합니다. 헤 마톡 실린과 에오신 염색. (D, E) 감지 난관 상피 세포 마커 짝 박스 유전자 8 (PAX8) 및 Forkhead 상자 J1의 (FOXJ1, 갈색 핵 색상, 화살촉)에 도시 이식 (화살표)의 세포 ( <strong&gt; C). Immunoperoxidase 시스템. 메틸 녹색으로 대조. FP, 지방 패드; 오븐, 난소; UT, 자궁 관. (A) 스케일 바 = 1000 μm의; (B) 스케일 바 = 200 μm의; (CE) 스케일 바 = 100 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 1 배 DMEM F12 (햄) 매체 </td></tr><tr><td> L 글루타민 </td><td> 2 밀리미터 </td></tr><tr><td> 나트륨 pruvate </td><td> 1 ㎜ </td></tr><tr><td> 표피 성장 인자 </td><td> 10 NG ml의 -1 </td></tr><tr><td> 염기성 섬유 아세포 성장 인자 -2 </td><td> 10 NG ml의 -1 </td></tr><tr><td> 하이드로 코르티손 </td><td> 500 NG ml의 -1 </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 5 μg의 ml의 -1 </td></tr><tr><td> 트라nsferrin </td><td> 5 μg의 ml의 -1 </td></tr><tr><td> 아 셀렌 산 나트륨 </td><td> 5 NG ml의 -1 </td></tr><tr><td> 소 알부민 </td><td> 0.10 % </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> 100 단위 ml의 -1 / 100 μg의 ml의 -1 </td></tr><tr><td> 최소 필수 중간 독수리 (MEM) 비 필수 아미노산 </td><td> 0.1 mM의 </td></tr><tr><td> 베타 - 머 캅토 에탄올 </td><td> 10-4 M </td></tr></tbody></table> 표 1 :. 마우스 두발 Epithelim 성장 매체 (M-TE-GM) 구성 요소의 왼쪽 열에 표시는 1 배 DMEM의 F12 표시된 농도 (햄의) 중간, 오른쪽 열에에 용해시킨다. 최종 배지 조성물은 무료 혈청입니다.

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Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

우리는 여성의 생식 기관의 정상 및 형질 전환 상피의 연구에 적합한 난소 유행 패드 이식 분석에 대해 설명합니다. 마우스 지방 패드는 큰 조직 조각의 이식을 허용 수술과 이미징을위한 쉽게 접근 할 수 있으며, 뮐러 기원의 조직에 가장 유리한 기본 환경을 제공합니다.

마우스 난소 지방 패드 속으로 이식

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

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11.3K 조회수.  Cornell University.  우리는 여성의 생식 기관의 정상 및 형질 전환 상피의 연구에 적합한 난소 유행 패드 이식 분석에 대해 설명합니다. 마우스 지방 패드는 큰 조직 조각의 이식을 허용 수술과 이미징을위한 쉽게 접근 할 수 있으며, 뮐러 기원의 조직에 가장 유리한 기본 환경을 제공합니다. 

비디오: Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

아밀로이드에 대한 앞쪽에 지방 패드의 FNA 공연 및 처리

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

연구

의학

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

의 마우스 모델 Utero에 이식

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

성인 마우스 망막으로 MACS 정제 광수용체 전구체 세포의 감하 이식

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently host immune responses to microbial and environmental agents. Dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS)-induced colitis allows one to study the pathogenesis of IBD associated environmental triggers such as stress and diet, the effects of potential therapies, and the mechanisms underlying intestinal inflammation and mucosal injury. In this paper, we investigated the effects of dietary n-3 and n-6 fatty acids on the colonic mucosal inflammatory response to DNBS-induced colitis in rats. All rats were fed identical diets with the exception of different types of fatty acids [safflower oil (SO), canola oil (CO), or fish oil (FO)] for three&#160;weeks prior to exposure to intrarectal DNBS. Control rats given intrarectal ethanol continued gaining weight over the 5 day study, whereas, DNBS-treated rats fed lipid diets all lost weight with FO and CO fed rats demonstrating significant weight loss by 48&#160;hr and rats fed SO by 72&#160;hr. Weight gain resumed after 72&#160;hr post DNBS, and by 5 days post DNBS, the FO group had a higher body weight than SO or CO groups. Colonic sections collected 5&#160;days post DNBS-treatment showed focal ulceration, crypt destruction, goblet cell depletion, and mucosal infiltration of both acute and chronic inflammatory cells that differed in severity among diet groups. The SO fed group showed the most severe damage followed by the CO, and FO fed groups that showed the mildest degree of tissue injury. Similarly, colonic myeloperoxidase (MPO) activity, a marker of neutrophil activity was significantly higher in SO followed by CO fed rats, with FO fed rats having significantly lower MPO activity. These results demonstrate the use of DNBS-induced colitis, as outlined in this protocol, to determine the impact of diet in the pathogenesis of IBD.

DNBS/TNBS induced colitis offers an alternative and inexpensive method to study the pathobiology of inflammatory bowel disease. The protocol discussed in this paper outlines the successful application of DNBS to induce colitis in mice and rats and allows one to thoroughly study host-mediated intestinal responses.

DNBS / TNBS 대장염 모델 : 염증성 장 질환에 대한 통찰력과식이 지방의 효과를 제공

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed results. However, the cellular and molecular mechanisms of the neotissue development, valve thickening, and stenosis development are not researched extensively. To answer the above questions, we developed a murine heterotopic heart valve transplantation model. A heart valve was harvested from a valve donor mouse and transplanted to a heart donor mouse. The heart with a new valve was transplanted heterotopically to a recipient mouse. The transplanted heart showed its own heartbeat, independent of the recipient&#8217;s heartbeat. The blood flow was quantified using a high frequency ultrasound system with a pulsed wave Doppler. The flow through the implanted pulmonary valve showed forward flow with minimal regurgitation and the peak flow was close to 100 mm/sec. This murine model of heart valve transplantation is highly versatile, so it can be modified and adapted to provide different hemodynamic environments and/or can be used with various transgenic mice to study neotissue development in a tissue engineered heart valve.

In order to understand the cellular and molecular mechanisms underlying neotissue formation and stenosis development in tissue engineered heart valves, a murine model of heterotopic heart valve transplantation was developed. A pulmonary heart valve was transplanted to recipient using the heterotopic heart transplantation technique.

이소성 심장 이식 마우스 모델을 사용하여 폐동맥 판막 이식

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

마우스 신장 이식 : 동종 이식 거부의 모델

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

마이크로 컴퓨터 단층 촬영과 누드 마우스에 인간의 지방 주입의 생존 능력의 평가

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 Preadipocytes

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research. 
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

This novel model for orthotopic hind limb transplantation in the mouse, applying a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis, provides a powerful tool for in&#160;vivo mechanistic immunological research related to vascularized composite allotransplantation (VCA).