Name: intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model
Uploaded: 2017-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
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이 작품은 NIH R01NS087990 (MSL, IVB)에 의해 지원되었습니다.

모든 동물 처치는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 또는 동등한 기관의 승인을 받아야합니다. 여기에 설명 된 특정 절차와 관련하여 불확실성이있는 경우 진행하지 마십시오. 해당 기관의 IACUC 및 지정된 수의진 직원과 명확히하십시오. 1. 배양 세포의 무균 유지 및 무균 기술 원칙 준수 <ol><li> 생쥐에 투여하기 전에 모든 세포 배양 절차 및 세포 시험 및 병원체가없는 상태 확인을위한 IACUC 요구 사항의 표준 실험실 기준을 준수하십시오. </li><li> 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 세포 인증을위한 NIH 요구 사항을 따르십시오 11 . </li><li> 이 원고에서 설명 된 확립 된 작은 동물 수술 무균 기술을 따르십시오. </li></ol> 2. Glioma 세포의 준비 &lt;em&gt; Vivo 실험 2 , 4 <ol><li> Dulbecco 수정 된 이글의 배지 (DMEM) 또는 혈청이없는 배지 (보충제 B27, N2, 헤파린, 상피 세포 성장 인자 (BMP)를 함유 한 Neurobasal 배지)의 혈청 함유 (10 % 태아 혈청 혈청) 배양 신경 교종 세포 (GBM43, GBM6 및 U87MG) EGF], 염기성 섬유 모세포 성장 인자 [bFGF], 항생제, L- 글루타민 12 )을 가습 CO 2 세포 배양기에 넣었다. <ol><li> 상용 서비스 제공 업체가 운영하는 마우스 클리어 패널을 통해 모든 세포주를 테스트하십시오. </li></ol></li><li> 배양 배지를 제거하여 부착 세포를 수집하십시오. 실온에서 5 분 동안 0.05 % 트립신 (T25 플라스크 용 트립신 1 mL, T75 플라스크 용 2 mL,보다 큰 표면적을 가진 배양 플라스크에 따라 스케일)과 함께 인큐베이션 한 다음 칼슘 2+ 및 Mg 2+ 인산염 완충 식염수 (PBS). <ol><li> 탭플라스크에 넣고 세포를 제거하고 과량의 혈청 함유 배지 (8 - 9 mL)로 즉시 중화합니다. 그런 다음 혈청 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 원심 분리 튜브로 흡입합니다. </li><li> 5 분 400 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 반복 원심 분리로 PBS 10 mL로 세포를 적어도 두 번 씻으십시오. </li><li> 원심 분리를 통해 혈청이없는 배지에서 종양 구체로서 성장한 신경 교종 세포를 수집하십시오 (위와 동일한 속도와 지속 시간); 원심 분리 (400 xgx 5 분)에 의해 PBS 10 ML로 두 번 씻기 전에 5 분 37 ° C에서 세포 분리 솔루션의 1-2 ML의 부화로 세포 펠렛을 해리. </li><li> 2.5 μL 당 50,000 - 200,000 세포의 농도로 멸균 생리 식염수에 신경 교종을 재 정지시킵니다. 마우스 두뇌에 주사에 사용되는 세포 번호는 각 신경 교종 세포주의 확립 된 성장 속도에 달려 있습니다. 여기에 GBM43 및 GBM6 환자 유래 종양 세포에 대해 각각 25,000 및 100,000을 사용하십시오. </li><li> nece의 양을 두 배 준비하십시오.프로 시저 동안 분수의 손실을 설명하기 위해 이식을위한 ssary 세포 번호. 주사 가능한 세포 현탁액을 멸균 된 미세 원심 분리기 튜브에 옮기고 얼음에 튜브를 놓습니다. 수술 중 최대 2 시간 동안 세포를 얼음 위에 올려 놓고 연장 수술을 계획하면 새로운 배치를 준비하십시오. </li></ol></li></ol> 3. Xenograft 마우스 모델을 만들기위한 두개 내 주입 ( 그림 1A ) 2 , 4 , 13 <ol><li> 수술 일 전에 오토 클레이브의 모든 수술 도구를 소독하고 IACUC 승인 프로토콜에 따라 모든 수술 전 및 수술 후 동물 보호 재료를 준비합니다. stereotaxic 프레임 및 주변 장비를 소독하여 수술 중 무균 상태를 보장함으로써 합병증을 최소화합니다. </li><li> 혼잡과 오염 가능성을 최소화하기 위해 작업 영역을 구성하십시오. </li><li> 적절한 개인 보호 장비 착용IACUC 요건에 따라 PPE (정신과 의사) </li><li> 적절한 수술 후 회복 챔버를 설치하십시오. 만성적 인 시약을 사용하여 마취제와 진통제를 신선한 상태로 준비하십시오. IACUC 승인 프로토콜에 따라 적절한 체열 관리기구를 설치하십시오. </li><li> 인간 NSC의 비내 전달 검사를 위해 인간 환자 유래 신경 교종 세포 이종 이식편을 확립하려면 약 6 주령의 임의의 성별의 nu / nu 흉선 마우스와 같은 면역 저하 마우스를 사용하십시오. </li><li> 승인 된 시약, 즉 ketamine (50-100 mg / kg, 승인 된 용량 범위에 대한 기관 IACUC)과 xylazine (5-10 mg / kg)의 복강 내 (ip) 주사를 통해 체중을 기준으로 동물을 마취합니다. kg), 승인 된 용량 범위에 대해서는 기관 IACUC에 문의하십시오.) 200-250 μL 멸균 생리 식염수 또는 4-5 % isoflurane 마취를 통해 흡입 장치를 사용하십시오. <ol><li> 동물이 수술 마취기에 도착했는지 확인하십시오. b발가락이 피부 절개 전에 핀치. 동물의 각막의 축축한 상태를 보장하기 위해 충분한 멸균 안과 젤을 적용합니다. </li></ol></li><li> Pritchett-Corning et al.에 의해 betadine과 isopropyl alcohol을 반복적으로 번갈아 사용하여 두개골을 살균하십시오 . 14 . </li><li> 수술 블레이드를 사용하여 절개 전에 Buprenex (0.05 - 2 mg / kg)를 주사하여 절개 전 진통을 제공하십시오. </li><li> 두개골을 노출시키면서 멸균 된 면봉 팁을 사용하여 지혈을 돕습니다. 부수적 인 출혈의 제거를 용이하게하기 위해 3 % 과산화수소를 사용하십시오. </li><li> 배터리 구동 휴대용 전자식 볼펜 드릴 (너비가 1mm 미만)을 사용하여 좌우 2mm, 왼쪽 또는 오른쪽, 중간 선 및 브레 그마 뒤 2mm에 버 구멍을 만듭니다 (위치 좌표는 특정 연구를 위해 의도 된 종양 모델에서). </li><li> 동물을 stereotaxic frame에 고정시킨다.삽입 된 해밀턴 마이크로 주사기가 버어 구멍 주변의 두개골의 표면에 수직이되도록 삽입한다. 동물의 마취기가 꼬집음으로써 양호한 자세를 유지하도록주의하십시오. 다음 단계에서 동물이 통증을 느끼지 않도록 호흡 수를 관찰하십시오. * 다음과 같은 이유로 인 - 이어 바 게재 위치를 강조하지 않습니다. <ol><li> 우리는 바늘의 위치를 ​​정하기 위해 구멍을 미리 뚫어 놓았으므로 정확한 두개골 좌표는 불필요합니다. </li><li> 마우스 귀의 운하는 약해서 귀마개의 정확한 귀에 거는 배치는 우리의 목적과 관련이없는보다 복잡한 훈련을 필요로합니다. 쥐 귀의 파열로 인한 위험은 정확한 배치의 이점을 능가합니다. </li><li> 뺨 지원은 수행하기가 훨씬 쉬우 며 마우스 헤드 안정성과 위치 조정 중 균형을 동일하게 유지할 수 있습니다. 시간에 민감한 여러 번의 수술을 통해 추가적인 이점을 얻을 수 있습니다.적절한 세포 생존 능력으로 적기에 완료하십시오. </li></ol></li><li> stereotaxic 프레임 손잡이를 사용하여 평면 팁 마이크로 주사기를 버어 구멍에 위치시킨 다음 천천히 dura 표면 아래 3mm까지 내립니다. 경막 아래 2.5mm 지점에서 바늘 끝을 유지하려면 0.5mm 후퇴. </li><li> 1 분 동안 미리 장착 된 신경 교종 세포 2.5 μL를 주입합니다. 주사 바늘을 1 ~ 2 분간 천천히 천천히 올려 놓고 바늘을 뇌에서 빼내고 세포 역류를 최소화하도록주의하십시오. 두개강 내 종양 성장을 막기 위해 멸균 뼈 왁스를 바르십시오. </li><li> 스테인레스 스틸로 감긴 클립 (7 mm)을 사용하여 상처를 닫습니다. 멸균 lactated 링거 솔루션 (미리 37 ° C로 따뜻하게) 1 ML의 피하 (SC) 주사를 제공하고 가열 패드의 중간에있는 복구 챔버에 동물을 넣으십시오. </li><li> 이동성이 회복되면 환기 랙으로 동물을 되돌려 놓고 일상적인 수술 후 관리를 통해 평온함을 보장합니다.h 회복. </li></ol> 4. 종양 성장의 생체 내 Bioluminescence 이미징 (BLI) ( 그림 1B ) 15 참고 : 환자 유래 신경 교종 세포는 개똥 벌레 루시퍼 라제를 발현하도록 변형됩니다. 이것은 우리가 intracranial 주입 후 종양의 진행을 따르도록 허락합니다. <ol><li> 이미징 세션 10 분 전에 동물에게 D- 루시 페린, 칼륨 염 (150 MG / kg)의 IP 주사를 줘. </li><li> 즉시 IACUC에서 승인 한 산소가 첨가 된 이소 플루 란 유도 챔버에 동물을 놓으십시오. </li><li> 동물을 가열 된 (37 ° C) 이미징 챔버에 넣고 소프트웨어 설정을 사용하여 BLI 신호를 캡처합니다 (자세한 내용은 제조업체 지침 참조). </li></ol> 5. 전체 뇌 조사 ( 그림 1C ) 2 , 4 , 13 4 . <ol><li> 쥐에게 마취를 적당히 유도하기 위해 부 수술 수술 마취기를 사용하여 ketamine과 xylazine 혼합물 (각각 50-100 mg / kg 및 5-10 mg / kg, 승인 된 용량 범위에 대해 기관 IACUC와상의)을 ip 주사합니다. </li><li> 샘플 트레이를 사용하여 리드 차폐 블록 사이에서 챔버 내부의 마우스를 위치시키고, 방사선 경로에 대한 헤드 전용 노출을 허용합니다 ( 그림 2 ). </li><li> 생쥐에게 5 일 연속 2 Gy 조사량의 종양 성장 (정상적으로 신경아 교종 세포 이식 후 7-8 일째)의 양성 BLI 확인을 제공하십시오. 마지막 조사 선량 후 종양의 BLI 평가를 수행합니다. </li></ol> 6. 인간 신경 줄기 세포의 유전자 변형 (NSCs, Figure 3A) 4 <ol><li> 95 % 실내 공기 및 5 % CO 2 ( N NSCs)하에 가습 된 37 ° C 배양기에서 10 % FBS 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 함유하는 DMEM 배지에서 인간 NSC (클론 HB1.F3.CD) 6 , 7 을 유지한다. </li><li> CXCR4를 코딩하는 렌티 바이러스로 형질 도입함으로써 hNSCs에서 CXC 모티프 케모카인 수용체 4 (CXCR4)와 같은 화학 주성 수용체의 유전 적 과발현을 수행한다. <ol><li> NSC가 75-80 % confluency 근처에있을 때 polybrene (8 μg / mL)과 함께 CXCR4 lentivirus를 배양 배지에 넣고 8 시간 또는 밤새 배양하십시오. </li><li> 형질 감염된 세포의 양성 선택을 위해 4 μg / mL의 blasticidin을 함유하는 새로운 배지로 바이러스 함유 배지를 대체하십시오. </li><li> 항 -CXCR4 항체와 일치하는 isotype 항체 및 vi를 사용하여 유세포 분석을 통해 변형 된 hNSCs ( CXCR4 NSCs)에서 CXCR4 발현의 수준을 확인합니다.CXCR4와 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) cDNAs를 증폭하는 한 쌍의 프라이머를 사용한 정량적 RT-PCR 4 . </li><li> CXCR4 유전자를 대체하는 RFP와 동일한 전략을 사용하여 벡터 제어 NSC ( VC NSC)를 생성하고 RFP 형광의 존재로 인해 현미경 또는 유동 세포 계측법 을 통해 검증하십시오. </li></ol></li></ol> 7. 인간 NSCs의 hypoxic preconditioning ( 그림 3A ) 4 <ol><li> 상기 한 바와 같이 T75 배양 플라스크에서 배양 한 NSC는 90 %의 confluency에이를 때까지 배양 하였다. </li><li> 자동화 된 내장 유량계로 제어되는 N 2 가스 공급 을 통해 24 시간 동안 1 % O 2 수준을 유지 한 가습 된 CO2 챔버 / 인큐베이터에 세포 배양 플라스크를 놓습니다. 이러한 세포를 H NSC라고합니다. Control N NSC는 단계 7.1에 설명되어 있습니다. </li></ol> 8. 후진타오의 로딩Oncolytic Virus를 가진 사람 NSCs ( 그림 3B -3H ) 5 <ol><li> 8.1. 50 개의 조건부 복제 아데노 바이러스 (CRAd) -S-pk7 바이러스 입자 / 세포 4 , 16을 갖는 N 개의 NSCs, H NSCs, VC NSCs 및 CXCR4 NSCs. </li><li> 주기적 두드리기와 함께 실온에서 2 시간 인큐베이션 한 후, 언 바운드 바이러스 성 입자를 제거하기 위해 배지로 세포를 세 번 씻고 주사 용 멸균 생리 식염수에 세포를 부순다. 주의 : BSL2와 같은 적절한 생물 안전성 레벨 지정이있는 시설에서 모든 바이러스 관련 시험관 세포 배양 절차를 수행하십시오. 적절한 개인 보호 장비는 기관 동물 시설 지침 4 , 16에 따라 온 콜리 틱 바이러스를 다루는 연구원이 착용해야합니다. </li></ol> 9. 줄기 세포를 마이크로로 적재자기 공명 영상 (MRI; 그림 3B -3H )을 통한 In Vivo 추적을위한 n 크기의 상자성 산화철 (MPIO) 2 <ol><li> 줄기 세포를 표시하려면 밤새 배양을위한 transfection 시약이있는 상태에서 ~ 80 % confluency에서 줄기 세포 배양에 MPIO를 추가하십시오. MPIOs (플래시 레드 공액)와 줄기 세포 라벨 (NSCs 4 또는 MSCs 2 )의 효율은 유동 세포 계측법에 의해 결정됩니다. </li><li> 신경 교종 보유 동물의 뇌에서 줄기 세포의 이동과 분포를 시각화하기 위해서는 Relaxation Enhancement 스핀 에코 이미지와 멀티 슬라이스 T1 가중 Fast Lo Angle Shot (FLASH) 그래디언트 에코 ​​시퀀스를 다중 슬라이스 고해상도 T2 가중 급속 수집과 마우스 뇌의 관상면과 축면을 통해 구조를 평가하십시오 2 . </li></ol> 10. 치료 용 NSC의 비강 내 전달 ( 그림 3D ) 2 , 4 <ol><li> (3)에서 설명한 프로토콜에 따라 NSC ( N NSC, H NSC, VC NSC 및 CXCR4 NSC)를 수집하고 수집합니다. 주의 : OV로드 된 NSC와 관련된 모든 동물 절차는 BL2 또는 BSL2 시설과 같은 적절한 생물 안전성 수준 지정이있는 시설에서 수행되어야합니다. </li><li> 단계 3.6에 따라 ketamine과 xylazine 혼합물의 IP 주입을 통해 마우스를 마취. </li><li> 쥐를 체온을 유지하기 위해 아래에 가열 패드가있는 깨끗한 드레이프 위에 올려 놓습니다. 쥐의 머리 밑에 놓았을 때 콧 구멍의 수직을 확보하기 위해 테이프로 말린 종이 타월로 만든 패딩 된 베개를 조정하십시오. 참고 : 비강 내 Hyaluronidase 전처리 (5 분 간격으로 4 회 반복 접종하여 100 U, 각 비공에 3 μL)pithelium 이전에 2,17 설명했다. </li><li> micropipette를 사용하여 마우스의 각 콧 구멍에 NSC 현탁액 2 μL를 분배합니다. 다음 마우스로 이동하기 전에 드롭 릿의 흡인을 육안으로 확인하십시오. 배달 된 총 셀 수는 사용자가 결정할 수 있습니다. 5 ~ 1 백만 개의 세포가 4 x 2 μL 용량으로 전달 될 수 있도록 62,500-125,000 개의 세포 / μL를 사용하십시오. </li><li> 타이머를 사용하여 최대 4 회 각 세포 현탁 투여 사이에 5 분 간격을 확보하십시오. </li><li> 회복 실에서 동물이 이동성을 되 찾는 것을 허용하며, 전체적으로 앙와위가 유지됩니다. </li></ol> 11. 생존 분석 ( 그림 3E ) <ol><li> 통계 소프트웨어에서 동물의 생존 기간 데이터를 입력하고 다음 유의 기호를 사용하여 로그 순위 테스트를 사용하여 통계 비교를 수행하십시오. * p &lt; 0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001. </li></ol> 12. 조직 수집 및 조직학 / Immunocytochemistry 비내 감염의 줄기 세포 뇌 항목의 확인 2 , 4 <ol><li> 연구의 마지막 시점에서 IACUC 승인 프로토콜 을 통해 생쥐 를 안락사시켰다. 표준 관행은 유량 조절 CO 2 챔버를 사용하여 일차 안락사 전략으로 동물을 희생 한 다음 재관류 고정에 의한 삽혈로 이어집니다. </li><li> 희생당한 즉시 혈관에서 혈액 잔류 물이 제거되고 이후의 조직 학적 분석을 위해 조직이 보존되도록 동물에게 PBS로 심내 관류를 실시하십시오. </li><li> CO 2 - euthanized 동물을 앙와위의 흡수 패드 위에 놓고 개복술로 진행하여 흉곽과 함께 절개 된 횡경막 근육을 노출시켜 심장을 노출시킵니다. </li><li> 엄마 후절개 가위를 사용하여 우심방에 딱지를 붙이고 정점에있는 좌심실을 통해 PBS 주사 3-5 mL로 방 사를 촉진합니다. 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 순환 주사하십시오. 말초 근육 경련은 적절한 조직 고정을 방지하는 혈액 순환 장애를 막지 못한다는 시각적 인 확인을 제공합니다. </li><li> 외과 적으로 시체의 머리를 제거하고 4 ° C에서 4 % PFA 50 ML 원심 튜브에 보관하십시오. 다음 24 시간 후 뇌 조직 해부 전에 30 % 자당으로 솔루션을 변경합니다. </li><li> OCT 화합물에 뇌 조직을 삽입하고 드라이 아이스에서 이소 펜탄으로 섬광 동결. 조직학 및 immunocytochemistry 애플 리케이션을위한 10-20 μm의 조직 섹션을 생성하는 결과 조직 블록의 cryosectioning를 수행합니다. </li></ol>

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	<li>Shah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+therapies+for+tumors+in+the+brain:+are+we+there+yet?.">Stem cell-based therapies for tumors in the brain: are we there yet?.</a> Neuro Oncol. 18 (8), 1066-1078 (2016).</li><li>Balyasnikova, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+mesenchymal+stem+cells+significantly+extends+survival+of+irradiated+mice+with+experimental+brain+tumors.">Intranasal delivery of mesenchymal stem cells significantly extends survival of irradiated mice with experimental brain tumors.</a> Mol Ther. 22 (1), 140-148 (2014).</li><li>Reitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+neural+stem/progenitor+cells:+a+noninvasive+passage+to+target+intracerebral+glioma.">Intranasal delivery of neural stem/progenitor cells: a noninvasive passage to target intracerebral glioma.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (12), 866-873 (2012).</li><li>Dey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+Oncolytic+Virotherapy+with+CXCR4-Enhanced+Stem+Cells+Extends+Survival+in+Mouse+Model+of+Glioma.">Intranasal Oncolytic Virotherapy with CXCR4-Enhanced Stem Cells Extends Survival in Mouse Model of Glioma.</a> Stem Cell Reports. 7 (3), 471-482 (2016).</li><li>Ahmed, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preclinical+evaluation+of+neural+stem+cell-based+cell+carrier+for+targeted+antiglioma+oncolytic+virotherapy.">A preclinical evaluation of neural stem cell-based cell carrier for targeted antiglioma oncolytic virotherapy.</a> J Natl Cancer Inst. 105 (13), 968-977 (2013).</li><li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+stem+cells+target+experimental+intracranial+medulloblastoma+and+deliver+a+therapeutic+gene+leading+to+tumor+regression.">Human neural stem cells target experimental intracranial medulloblastoma and deliver a therapeutic gene leading to tumor regression.</a> Clin Cancer Res. 12 (18), 5550-5556 (2006).</li><li>Lee, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+rat+brainstem+glioma+using+human+neural+stem+cells+and+human+mesenchymal+stem+cells.">Targeting rat brainstem glioma using human neural stem cells and human mesenchymal stem cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (15), 4925-4934 (2009).</li><li>Lesniak, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+malignant+glioma:+neural+stem+cells.">Targeted therapy for malignant glioma: neural stem cells.</a> Expert Rev Neurother. 6 (1), 1-3 (2006).</li><li>Robinson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLPs+and+the+Importance+of+Standard+Operating+Procedures.">GLPs and the Importance of Standard Operating Procedures.</a> BioPharm International. 16 (8), (2003).</li><li>World Health Organization on behalf of the Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook: Good Laboratory Practice (GLP). , (2009).</li><li>NIH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Number: NOT-OD-16-011. Implementing Rigor and Transparency) in NIH &amp; AHRQ Research Grant Applications. , (2015).</li><li>Wakimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+primary+tumor+phenotype+and+genotype+in+glioblastoma+stem+cells.">Maintenance of primary tumor phenotype and genotype in glioblastoma stem cells.</a> Neuro Oncol. 14 (2), 132-144 (2012).</li><li>Cheng, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+In+Vivo+SPECT+Imaging+of+Neural+Stem+Cells+Functionalized+with+Radiolabeled+Nanoparticles+for+Tracking+of+Glioblastoma.">Dynamic In Vivo SPECT Imaging of Neural Stem Cells Functionalized with Radiolabeled Nanoparticles for Tracking of Glioblastoma.</a> J Nucl Med. 57 (2), 279-284 (2016).</li><li>Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rodent+surgery+for+the+new+surgeon.">Principles of rodent surgery for the new surgeon.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li><li>Clark, A. J., Fakurnejad, S., Ma, Q., Hashizume, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+Imaging+of+an+Immunocompetent+Animal+Model+for+Glioblastoma.">Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li><li>Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivin-driven+and+fiber-modified+oncolytic+adenovirus+exhibits+potent+antitumor+activity+in+established+intracranial+glioma.">Survivin-driven and fiber-modified oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor activity in established intracranial glioma.</a> Hum Gene Ther. 18 (7), 589-602 (2007).</li><li>Danielyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+of+cells+to+the+brain.">Intranasal delivery of cells to the brain.</a> Eur J Cell Biol. 88 (6), 315-324 (2009).</li><li>Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+delivery+to+the+central+nervous+system:+mechanisms+and+experimental+considerations.">Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations.</a> J Pharm Sci. 99 (4), 1654-1673 (2010).</li><li>Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphometry+of+the+nasal+cavity+in+rats+and+mice.">Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice.</a> J Anat. 135 (Pt 1), 83-88 (1982).</li><li>Marieb, E. N., Hoehn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Anatomy &amp; Physiology. , (2007).</li></ol>

저자는 선언 할 이해 관계가 없습니다.

약물 전달의 비강 경로가 소분자, 나노 메디신 및 단백질 화합물 모두에 대해 광범위하게 탐구되었지만, 비내심 뇌종양 표적화를위한 치료 줄기 세포의 적용은 발달중인 뇌종양 치료제 스펙트럼에서 매우 새롭다 2 , 3 , 4 . 비강 내 줄기 세포의 행동과 관련된 본질적인 복잡성이 있으며, 분자의 세부 사항은 아직 명확하지 않습...

인간 줄기 세포의 낮은 독성, 낮은 면역 원성, 내인성 뇌종양의 방향성은 치료제 전달에있어 매력적인 특성입니다 1 . 최근 악성 뇌종양에 대한 새로운 줄기 세포 기반 치료법은 최근 개발 된 유망한 혁신이며이 치료 전략의 비내 적응은 비 침습적이고 반복적 인 투여가 환자의 응용에 대한 장벽을 크게 줄일 수 있다는 점에서 임상 번역으로의 도약을 의미한다. 침습적 외과 수술 1 , 2 , 3 , 4 와 관련된 전신 마취 또는 오랜 환자 서비스없이 외래 환자 서비스에 적용 할 수 있습니다. 우리와 다른 사람들은 줄기 세포 전달이 뇌종양으로가는 비강 내 경로를 개척했으며 몇 가지 기본 원칙마우스 이종 이식 모델 2 , 3 , 4 를 사용하여 번역 연구를 수행하고 MRI (magnetic resonance imaging) 시약 캐리어를 통해 생체 내에서 줄기 세포 의 이동을 조사했습니다. 이러한 파일럿 실험을 통해 우리는 확립 된 환자 유래 이종 이식 (PDX) 마우스 모델을 악성 신경 교종으로 사용하여 강력한 전임상 평가 전략을 가장 잘 구축하는 방법에 대한 실질적인 경험과 통찰력을 얻었습니다. 비강으로 전달 된 치료 용 줄기 세포의 비내 두뇌 진입의 정교한 생물학적 현상에 대한 미묘한 메커니즘의 상세한 설명. 여기서는 잘 확립 된 인간 신경 줄기 세포주 인 HB1.F3.CD 5 를 사용하여 실험적 연구의 현재 상태를 보여주기 위해 표준화 된 작동 프로토콜의 원리를 설명합니다 <sup&gt;, 6 , 7 , 8 , 치료 용 담체로서 인간 줄기 세포를 사용하는 특정 종양 모델 또는 전략에 적응하기 위해 쉽게 수정할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxic Cell Culture Incubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VIOS 160i</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture supplies (Plastics)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Varies</td><td>Replaceable with any source</td></tr><tr><td>Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002490</td><td>Replaceable with any source</td></tr><tr><td>Bench centrifuge Sorvall ST16R&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004240</td><td>Replaceable with any source</td></tr><tr><td>Micro syringe 702N 25 &amp;micro;l (22S/2&quot;/2)</td><td>Hamilton Company</td><td>80400</td><td>Flat tip</td></tr><tr><td>Sample Tray for Irradiator</td><td>Best Theratronics</td><td>A13826</td><td>To set up mice protection with lead shield</td></tr><tr><td>Leica DMi8 Microscope</td><td>Leica Microsystem</td><td></td><td>Custom setup</td></tr><tr><td>Leica CM1860 UV cryostat</td><td>Leica Microsystem</td><td></td><td>Custom setup</td></tr><tr><td>Exel International Insulin Syringe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-841-31</td><td></td></tr><tr><td>Corning Phosphate Buffer Saline</td><td>Corning Cellgro/ThermoFisher</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium&amp;nbsp;</td><td>Corning Cellgro/ThermoFisher</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.05%</td><td>Corning Cellgro/ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase from bovine testes</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3506</td><td></td></tr></tbody></table>

intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model

뇌 악성 종양에 대한 내재적 향성은 줄기 세포를 악성 종양 치료제의 유망한 매개체로 만듭니다. 비강 내 경로를 통한 치료 줄기 세포의 전달은 두개 내 이식이나 전신 경로를 통한 전달과 비교하여 비 침습적 특성으로 인해 임상 번역 가능성이 높은 최근에 발견 된 대안 전략입니다. 혈액 뇌 장벽의 부족은 비강 두뇌 진입을 겪고있는 줄기 세포의 치료 가능성을 더욱 강화시킵니다. 이 기사는 본 연구에 사용 된 필수 기술을 요약하고 마우스 모델의 두개강 내 신경 교종 이종 이식편을 사용하여 줄기 세포 전달을위한 비강 내 전략의 기본 원리를 개략적으로 설명합니다. 우리는 특정 사전 결정된 실험 매개 변수를 사용하여 일관되고 재현 가능한 결과를 생성하는 최적화 된 절차를 시연하고 능률적 인 실행 및 신뢰할 수있는 경험을 보장하는 간소화 된 작업 흐름에 대한 지침을 제공합니다.결과. 이 기사는 가설, 줄기 세포 유형 또는 종양 특이성에 근거한 추가 실험 맞춤화를위한 기준선 역할을하도록 고안되었습니다.

저산소 전처리 ( 그림 4A ) 4 와 CXCR4 과다 발현 ( 그림 4B 와 4C ) 4 모두는 유동 세포 계측법에 의해 입증 된 것처럼 CXCR4 수용체의 세포막 존재를 현저히 상향 조절합니다. NSC에 의해 입증 된 종양 향성 (파란 화살표)은 종양 조직 조직학 (빨간색 원)에 표시됩니다. 종양에서 MPIO로 표지 된 ( <str...

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Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

줄기 세포는 내재 된 종양 향성으로 인해 뇌종양 치료제로서 유망한 치료제입니다. 비 침습적 비강 내 줄기 세포 전달은 혈액 뇌 장벽을 우회하여 임상 번역의 가능성을 보여줍니다. 이 기사는 신경 교종 마우스 모델에서 비강 줄기 세포 전달의 기본 원리를 요약합니다.

마우스 모델에서 아교 모세포종에 치료 용 줄기 세포 비강 전달

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

intranasal-delivery-therapeutic-stem-cells-to-glioblastoma-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

12.1K 조회수.  Northwestern University.  줄기 세포는 내재 된 종양 향성으로 인해 뇌종양 치료제로서 유망한 치료제입니다. 비 침습적 비강 내 줄기 세포 전달은 혈액 뇌 장벽을 우회하여 임상 번역의 가능성을 보여줍니다. 이 기사는 신경 교종 마우스 모델에서 비강 줄기 세포 전달의 기본 원리를 요약합니다. 

비디오: Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Orthotopic 마우스 뇌종양 모델의 조합 방사선 치료

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

연구

의학

Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice

Delivery of therapeutics into the brain is impeded by the presence of the blood-brain barrier (BBB) which restricts the passage of polar and high molecular weight compounds from the bloodstream and into brain tissue. Some direct delivery success in humans has been achieved via implantation of transcranial catheters; however this method is highly invasive and associated with numerous complications. A less invasive alternative would be to dose the brain through a surgically implanted, semipermeable membrane such as the nasal mucosa that is used to repair skull base defects following endoscopic transnasal tumor removal surgery in humans. Drug transfer though this membrane would effectively bypass the BBB and diffuse directly into the brain and cerebrospinal fluid. Inspired by this approach, a surgical approach in mice was developed that uses a donor septal mucosal membrane engrafted over an extracranial surgical BBB defect. This model has been shown to effectively allow the passage of high molecular weight compounds into the brain. Since numerous drug candidates are incapable of crossing the BBB, this model is valuable for performing preclinical testing of novel therapies for neurological and psychiatric diseases.

A mouse model of human endoscopic skull base reconstruction has been developed that creates a semipermeable interface between the brain and nose using nasal mucosal grafts. This method allows researchers to study delivery to the central nervous system of high molecular weight therapeutics which are otherwise excluded by the blood-brain barrier when administered systemically.

쥐의 뇌에 직접 약물 전달 이소성 점막 Engrafting 절차

Delivery of therapeutics into the brain is impeded by the presence of the blood-brain barrier (BBB) which restricts the passage of polar and high ...

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain tumors. Unlike xenograft tumors, in GEMs, tumors arise in the native microenvironment in an immunocompetent mouse. However, the use of GBM GEMs in preclinical treatment studies is challenging due to long tumor latencies, heterogeneity in neoplasm frequency, and the timing of advanced grade tumor development. Mice induced via intracranial orthotopic injection are more tractable for preclinical studies, and retain features of the GEM tumors. We generated an orthotopic brain tumor model derived from a GEM model with Rb, Kras, and p53 aberrations (TRP), which develops GBM tumors&#160;displaying linear foci of necrosis by neoplastic cells, and dense vascularization analogous to human GBM. Cells derived from GEM GBM tumors are injected intracranially into wild-type, strain-matched recipient mice and reproduce grade IV tumors, therefore bypassing the long tumor latency period in GEM mice and allowing for the creation of large and reproducible cohorts for preclinical studies. The highly proliferative, invasive, and vascular features of the TRP GEM model for GBM are recapitulated in the orthotopic tumors, and histopathology markers reflect human GBM subgroups. Tumor growth is monitored by serial MRI scans. Due to the invasive nature of the intracranial tumors in immunocompetent models, carefully following the injection procedure outlined here is essential to prevent extracranial tumor growth.

Here, we describe a preclinical orthotopic mouse model for GBM, established by intracranial injection of cells derived from genetically engineered mouse model tumors. This model displays the disease hallmarks of human GBM. For translational studies, the mouse brain tumor is tracked by in vivo MRI and histopathology.

다형성 교모세포종의 번역 동소 모델

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

암 연구학

<meta charset="utf8"></head><body>쥐 모델에 주입 후 일반 경동맥 수리

Facilitating Repeat Intracarotid Injections in Mouse Models by a Novel Injection Site Repair Technique

Given recent advances in the delivery of novel antitumor therapeutics using endovascular selective intraarterial delivery methods in neuro-oncology, there is an urgent need to develop methods for intracarotid injections in mouse models, including methods to repair the carotid artery in mice after injection to allow for subsequent injections. We developed a method of intracarotid injection in a mouse model to deliver therapeutics into the internal carotid artery (ICA) with two alternative procedures. 
During injection, the needle is inserted into the common carotid artery (CCA) after tying a suture around the external carotid artery (ECA) and injected therapeutics are delivered into the ICA. Following injection, the common carotid artery (CCA) can be ligated, which limits the number of intracarotid injections to one. The alternative procedure described in this article includes a modification where intracarotid artery injection is followed by injection site repair of the CCA, which restores blood flow within the CCA and avoids the complication of cerebral ischemia seen in some mouse models. 
We also compared the delivery of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (BM-hMSCs) to intracranial tumors when delivered through intracarotid injection with and without injection site repair following the injection. Delivery of BM-hMSCs does not differ significantly between the methods. Our results demonstrate that injection site repair of the CCA allows for repeat injections through the same artery and does not impair the delivery and distribution of injected material, thus providing a model with greater flexibility that more closely emulates intracarotid injection in humans.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Advancing Glioblastoma Treatment Through Intraarterial Delivery Strategies for Oncolytic Virus and MicroRNAs

Repair of the intracarotid artery in a mouse model after injection returns blood flow to the artery without negatively impacting the distribution of the injected material. Injection site repair facilitates subsequent injections through the same artery and prevents cerebral ischemia in mouse strains that lack a complete Circle of Willis.

새로운 주입 부위 복구 기법을 통한 마우스 모델의 반복 경동맥 내 주입 촉진

Given recent advances in the delivery of novel antitumor therapeutics using endovascular selective intraarterial delivery methods in neuro-oncology, there ...

<meta charset="utf8"></head><body>쥐 교모세포종에서 영상 유도 치료 전달을 위한 산화철 나노입자

Nanoparticle Delivery of an Oligonucleotide Payload in a Glioblastoma Multiforme Animal Model

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies to GBM. Reported here is an image-guided, iron oxide-based therapeutic delivery nano platform capable of bypassing this physiological barrier by virtue of size and accumulating in the tumor region, delivering its payload. This 25 nm nano platform consists of crosslinked dextran-coated iron oxide nanoparticles labeled with Cy5.5 fluorescent dye and containing antisense oligonucleotide as a payload. The magnetic iron oxide core enables tracking of the nanoparticles through in vivo magnetic resonance imaging, while Cy5.5 dye allows tracking by optical imaging. This report details the monitoring of the accumulation of this nanoparticle platform (termed MN-anti-miR10b) in orthotopically implanted glioblastoma tumors following intravenous injection. In addition, it provides insight into the in vivo delivery of RNA oligonucleotides, a problem that has hampered the translation of RNA therapeutics into the clinic.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 교모세포종 치료를 위한 산화철 나노입자를 사용한 혁신적인 암 치료법

The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies for glioblastoma, a disease for which there is no cure. Here, we report an in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform that can bypass this physiological barrier by virtue of size and accumulate in the tumor.

Glioblastoma multiforme animal model에서 oligonucleotide payload의 나노입자 전달

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a ...

An Immunocompetent Murine Model for Laser Interstitial Thermal Therapy of Glioblastoma

Glioblastoma (GB), the most aggressive form of primary brain cancer, accounts for approximately half of all high-grade primary brain tumors in adults and has no cure. Laser interstitial thermal therapy (LITT) is a Food and Drug Administration (FDA)-approved treatment for GB and is used in patients who may not be candidates for conventional surgical resection. While the clinical efficacy of LITT has been established, research beyond clinical case studies and case series is limited and hindered by the lack of an established animal model. This protocol uses C57BL/6 mice and syngeneic CT2A glioma cancer cell line to closely recapitulate human GB&#160;while also using a 1064 nm Neodymium-doped Yttrium Aluminum Garnet (Nd:YAG) laser, such as is used in one of the two FDA-approved LITT systems, providing excellent pre-clinical relevance. The successful establishment of this LITT murine model will provide a valuable platform for investigating the unique features of LITT ablation and its effects on the tumor microenvironment, potentially leading to improved therapeutic strategies.

Glioblastoma is a devastating form of primary brain cancer, and laser interstitial thermal therapy is emerging as a promising alternative to conventional surgical resection for inoperable glioblastoma. This protocol describes an optimized pre-clinical mouse model that can be used to study treatment effects or adjuvant and combinatorial treatments.

Glioblastoma (GB), the most aggressive form of primary brain cancer, accounts for approximately half of all high-grade primary brain tumors in adults and ...

마우스 모델에서 아교 모세포종에 치료 용 줄기 세포 비강 전달

요약

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이 비디오의 챕터

Orthotopic 마우스 뇌종양 모델의 조합 방사선 치료

쥐의 뇌에 직접 약물 전달 이소성 점막 Engrafting 절차

다형성 교모세포종의 번역 동소 모델

새로운 주입 부위 복구 기법을 통한 마우스 모델의 반복 경동맥 내 주입 촉진

새로운 주입 부위 복구 기법을 통한 마우스 모델의 반복 경동맥 내 주입 촉진

새로운 주입 부위 복구 기법을 통한 마우스 모델의 반복 경동맥 내 주입 촉진

Glioblastoma multiforme animal model에서 oligonucleotide payload의 나노입자 전달

Glioblastoma multiforme animal model에서 oligonucleotide payload의 나노입자 전달

Glioblastoma multiforme animal model에서 oligonucleotide payload의 나노입자 전달

An Immunocompetent Murine Model for Laser Interstitial Thermal Therapy of Glioblastoma