이 원고 UT-Battelle, 계약 번호 아래 LLC에 의해 작성 되었습니다. 드-AC05-00OR22725 미국 에너지 부와 함께. 미국 정부를 유지 하 고 게시자, 게시를 위해 문서를 수락 하 여 인정 미국 정부는 비-, 유료-, 돌이킬 수 없는 세계적인 라이센스를 게시 또는 게시 된 형태의 재현 유지 이 원고 또는 다른 미국 정부 목적을 위해, 이렇게. 에너지의 DOE 공용 액세스 계획 (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan)에 따라 연방 후원된 연구의 이러한 결과에 대 한 공개 액세스를 제공 합니다.
이 작품은 게놈 과학 프로그램, 미국 에너지 부, 과학, 생물학 및 환경 연구, 식물 미생물 인터페이스 과학적인 초점 영역 (http://pmi.ornl.gov)의 일환으로 일부 지원 했다. 미세 플랫폼의 제조 실행 되었다 센터 Nanofabrication 연구소에 대 한 Nanophase 물자는 과학, 과학 사용자 시설의 암컷 사무실. JAA는 NSF 대학원 연구 친교 당선-1452154에 의해 지원 됩니다.

1. 2 층 플랫폼 제작
<ol>
	<li>다층 마스터의 제조
	<ol>
		<li>스핀 코트 에폭시 기반 부정적인 감광 제 (~63.45% 고체, 1250 중부 표준시) 제조업체의 사양에 따라 (2000 rpm 45 s) 첫 번째 디자인 계층에 대 한 20 µ m의 원하는 높이를 4 인치 직경 실리콘 웨이퍼에.</li>
		<li>소프트-빵 4 분 95 ° c.에 대 한 저항 입히는 웨이퍼 냉각 5 분 노출 UV 15 빛을 웨이퍼에 웨이퍼를 허용 s (150 ~ mJ/cm2 365 nm)는 UV에 포토 마스크를 통해 문의 aligner 아래 계층의 형상을 정의 하.</li>
		<li>사후 노출 구워 95 ° c.에 5 분 동안 웨이퍼 부정적인 감광 에폭시 기반의 두 번째 계층에 반환 웨이퍼 spin coater를 스핀으로 개발, 없이 (~76.75% 고체, 80000 cSt) 150-200 µ m의 두 번째 레이어 높이 달성 하기 위해 3000 rpm에서.</li>
		<li>45 분 동안 95 ° C 열판을 전송 하기 전에 5 분 동안 휴식을 웨이퍼를 허용 합니다. 열판에 베이킹 후 웨이퍼를 제거 하 고 냉각 하 고 편평한 평면에 또 다른 5 분 동안 실내 온도에 강하게 저항을 허용 합니다. 정렬 및 30에 대 한 두 번째 레이어 포토 마스크를 웨이퍼를 노출 UV 연락처 aligner (약 300 mJ/cm2의 복용량)에 s.</li>
		<li>사후 노출 빵 95 ° C에서 15 분 열판에 웨이퍼를 배치 하 여 수행 하 고 웨이퍼를 개발 하기 전에 5 분 동안 편평한 평면에 냉각을 허용.</li>
		<li>플라스틱 그릇에 웨이퍼를 배치 하 고 적절 한 개발자에 웨이퍼를 잠수 하 여 저항 레이어 모두를 동시에 개발 하는 방법 ( 자료 표참조). 부드럽게 바위는 웨이퍼 위에 신선한 개발자를 때때로 요리.</li>
		<li>17 분 후 소 프로 파 놀 (IPA)와 웨이퍼 린스. 흰색 필름 나타나면 영화 사라질 때까지 개발자와 IPA는 웨이퍼를 rinsing 사이 반복을 계속 합니다. 건조 질소로 꽃무늬 실리콘 웨이퍼.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>입니다 소프트-리소 그래피
	<ol>
		<li>30에 대 한 공기 플라즈마 실리콘 웨이퍼를 노출 높이 설정 플라즈마 클리너에 s (자료 테이블 참조) 청소. Silanize trichloro (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 시간-퍼플-n-octyl) silane silane (85 ° C) 2 h의 인화점 아래 열판에 화학 후드에서와 웨이퍼.</li>
		<li>마스터 실리콘 웨이퍼에 경화제를 10:1 비율입니다 (PDMS)을 붓는 다. 진공 챔버에 혼합된 PDMS 드 고 1 시간 또는 PDMS 완전히 치료 될 때까지 70 ° C 오븐에 폴리머를 치료.</li>
		<li>메스를 사용 하 여, PDMS 장치 잘라내어 실리콘 마스터 웨이퍼에서 껍질. 1.5 m m 생 검 펀치를 사용 하 여 시드 및 치료 후미, 메인 채널에 루트 성장을 촉진 하는 45 ° 각도로 씨앗 입구 펀치를 만들.</li>
		<li>지우기 접착 테이프를 사용 하 여 PDMS 장치에서 파편을 제거 하 고 유리 coverslip에 아래로 장치 디자인 측면을 놓습니다. 오토 클레이 브 조립된 장치.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 장치 설치
<ol>
	<li>애기 thaliana 씨앗 준비
	<ol>
		<li>표면 30% 시중 표 백제 살 균 물으로 4 시간 7 분 세척 씨앗에 대 한 드 이온된 물과 0.1% 트리톤 X 세제에 희석의 솔루션 microfuge 관에서 A. thaliana 씨앗 소독.</li>
		<li>하룻밤 또는 4 ° c.에 주일 microfuge 관을 냉동 하 여 씨앗을 충</li>
	</ol>
	</li>
	<li>장치 준비
	<ol>
		<li>Degassing 챔버 가스에서 공기를 제거 하는 진공 상태에서 멸 균된 장치를 배치 침투성 PDMS 및 유체 채널 작성의 용이성을 개선 하기 위해.</li>
		<li>진공 약 실에서 장치를 제거 하 고 즉시 pH 5.7에서 액체 ¼ 강도 식물 기반의 미디어 가득 페 트리 접시에 장치를 잠수함.</li>
		<li>피 펫을 사용 하 여 장치를 채우기 위해 후미를 통해 액체를 당겨. 없음 기포 육안 검사 하 여 채널 내에 남아 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>새로운 건조 접시 개별 장치 전송. 부 또는 피 펫 뜨거운 agar agar 수준까지 장치 주위는 거의 PDMS 장치 상단으로 플러시입니다. 공고히 agar를 허용 합니다. 참고: 장치 또는 씨앗을 심기 위해 지금 준비가 필요할 때까지 4 ° C에서 저장 될 수 있다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>장치에 씨앗 심기
	<ol>
		<li>메 마른 환경에서 작은 피 펫을 사용 하 여 각 장치의 입구에 소독된 한 종자를 전송.</li>
		<li>왁 스로 페 트리 접시 ( 자료 표참조) 영화와 명암 자전거 성장 챔버 또는 실내 온도에 창턱에 커버. 동양 페 트리 접시를 장치 수직 중력 채널을 통해 성장 하는 뿌리를 격려 할 것 이다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3입니다. 치료
<ol>
	<li>실험적 치료
	<ol>
		<li>종묘의 개발에서 원하는 시간에 피 펫을 통해 8 측면 포트의 각 치료의 소정의 금액을 추가 하 여 실험 치료는 경종을 추가 합니다.</li>
		<li>페 트리 접시를 다시 봉인 하 고 성장 챔버 또는 창턱을 반환 합니다.</li>
		<li>개별 시간 포인트 캡처 또는 시간 경과 영상 시작을 원하는 시간에 샘플을 이미지와 함께 진행 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 광학 이미징
<ol>
	<li>낮은 해상도 (4-20 X) 이미징
	<ol>
		<li>장치 및 더 낮은 해상도 (4-20 X) 밝은 분야 또는 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미징 거꾸로 밝은 분야 현미경 종묘를 포함 하는 전체 페 트리 접시를 놓습니다. 노출 시간, 램프 밝기, 조리개, 그리고 빛의 극성을 조정 하 여 관심의 형태학 상 특징을 명료 하 게 조명 조건 최적화. 루트 또는 관심의 root hair(s)에는 루트와의 원하는 영역에 무대를 드라이브.</li>
		<li>한 번 포인트 또는 시간 일련의 이미지를 취득. 루트 머리카락의 성장을 시각화, 분 당 한 번 성장 루트 머리카락을 이미지. 주요 루트의 성장을 시각화, 취득 한 이미지 마다 30 분 반환 페 트리 접시와 성장 챔버에 수직 위치에 창턱 묘 이미징 완료 되.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>높은 해상도 (20-63 X) 이미징
	<ol>
		<li>일단 원하는 시간에 대 한 묘 종 성장, 집게를 사용 하 여는 agar에서 coverslip 및 장치를 제거 하. 사용 하는 에탄올 젖는 실험실 조직 coverslip의 바닥 떨어져 청소.</li>
		<li>현미경 렌즈 제조 업체에 의해 제안 목표를 권장된 침수 미디어를 적용. coverslip 아래로 현미경 스테이지에 놓고 목표에 집중 미디어를 연결할 무대를 마련 합니다. 노출 시간, 램프 밝기, 조리개, 그리고 빛의 극성을 조정 하 여 조명 조건을 최적화 합니다. 관심의 root hair(s)에는 원하는 지역와 무대를 드라이브. 참고: DIC는 세포질 스트리밍, 시각화 하 고 형광 마커 세포 기관이 움직임을 시각화 하는 데 필요한.</li>
		<li>계량 시간이 지남에 루트 머리 성장, 당 분 한 이미지를 취득 합니다. 세포 기관이 움직임을 시각화 하는 세포에서 식별 형광 신호를 유지 하면서 형광 노출 시간을 최소화 합니다. 빨리 노출 시간 수는 세포의 이미지를 취득 합니다. 더 이상 시간 경과 영상에 대 한 라이브 셀 이미징 단계 인큐베이터를 사용 하 여 주위 온도 습기를 유지 하기 위해. 참고: 63 X 오일 목표는 이미징 루트 머리 세포에 대 한 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 비-광학 영상
<ol>
	<li>장치 준비
	<ol>
		<li>일단 원하는 시간, 묘 종 성장</li></ol></li></ol>페 트리 접시에서 장치와 coverslip를 제거 합니다.
		<li>거꾸로 장치를 설정 하 고 부드럽게 벗 겨는 coverslip 루트 PDMS 채널 범위 내에서 유지 되도록.</li>
		<li>기판으로 PDMS 장치를 사용 하 여 높은 분해능 원자 힘 또는 스캐닝 전자 현미경 검사 법에서 루트를 진행 합니다.</li>
	
	
	<li>스캐닝 전자 현미경 검사 법
	<ol>
		<li>얇은 예금 (~ 20 nm) 루트 및 PDMS 듀얼 총 전자 빔 증발 챔버를 사용 하 여 주변에 크롬의 계층.</li>
		<li>스캐닝 전자 현미경 챔버 루트 및 PDMS 장치 전송. 참고: 특정된 응용 프로그램에 대 한 원하는 해상도 달성 하기 위해 최적화 해야 합니다 이미징 조건, 즉, 전압, 현재 및 작업 거리.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>원자 힘 현미경 (AFM)
	<ol>
		<li>AFM 견본 홀더에 PDMS 장치 루트 쪽을 탑재 합니다. 카메라에 대비 증가 하 더 쉽게는 PDMS에서 루트를 구분 (예: 운 모 금에서 코팅) 평면 반사 기판 위에 PDMS 장치를 AFM 견본 홀더에 장치를 장착 하기 전에 놓습니다.</li>
		<li>PDMS 장치 위에 액체 잘 첨부 파일 보안 및 뿌리 이미징 동안 수산화 유지에 물을 채우십시오.</li>
		<li>AFM에 견본 홀더를 로드 합니다. PDMS 장치의 두께 대 한 z 제어를 조정 하 고 지도 대 한 카메라를 사용 하 여 루트에 관심 영역을 캔틸레버를 드라이브.</li>
		<li>캔틸레버의 팁과 레이저를 맞춥니다. 최상의 결과 얻으려면 연락처 모드 영상과, 0.01 0.03 N/m의 스프링 상수와 캔틸레버를 사용 하 여 검색 하는 동안 루트에 최소한의 힘을 발휘 하.</li>
		<li>검색 메커니즘을 천천히 낮은 캔틸레버까지 그냥 접촉 하 게 샘플. 원하는 지역에 대 한 스캔 크기를 조정 하 고 줄 당 256 전압 점 1 선/s의 스캔 속도 선택 합니다. 스캔을 취득.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Pritchard, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soil+organisms+and+global+climate+change.">Soil organisms and global climate change.</a> Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).</li><li>Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-root+production+dominates+response+of+a+deciduous+forest+to+atmospheric+CO2+enrichment.">Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment.</a> Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).</li><li>McCormack, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+fine+roots+improves+understanding+of+below-ground+contributions+to+terrestrial+biosphere+processes.">Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes.</a> New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).</li><li>Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+regulation+of+polar-growth+in+plant+cells.">ROS regulation of polar-growth in plant cells.</a> Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).</li><li>Ketelaar, T., Emons, A. 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Vis. Exp. (65), (2012).</li><li>Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+chip+for+high-throughput+phenotyping+of+Arabidopsis.">Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis.</a> Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nat. 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Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).</li><li>Rigas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+gravitropism+and+root+hair+development+constitute+coupled+developmental+responses+regulated+by+auxin+homeostasis+in+the+Arabidopsis+root+apex.">Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex.</a> New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).</li><li>Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+elongation,+water+stress,+and+mechanical+impedance:+A+review+of+limiting+stresses+and+beneficial+root+tip+traits.">Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits.</a> J. 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K., Cai, X., Nebenf&#252;hr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants.">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).</li><li>Talbot, M. J., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+and+cell+outline+imaging+in+plant+tissues+using+the+backscattered+electron+detector+in+a+variable+pressure+scanning+electron+microscope.">Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope.</a> Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).</li></ol>

저자는 공개 없다.

식물-칩 플랫폼을 만들기 위한이 문서에서 설명 하는 메서드는 독특한 2 층 디자인 경계 단일 영상 평면과 플랫폼 루트 머리카락 deconstructed 수 있으며 높은 해상도 비 광학 이미징 기판으로 사용 . 고해상도 비 광학 이미징 사용 하 여 광학 이미징 혼자에서 얻어질 수 있는 식물 조직에 대 한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 예를 들어, AFM 이미지 힘 측정 개발 중 이나 특정 화학 또는 생물 학적 ?...

좋은 루트 기능 증가 물, 식물, 새로운 토양 공간을 탐험 하 고 증가 하는 전체 루트 영역에 대 한 영양소 수집. 이러한 좋은 루트 기능 회전율 지 먹이 사슬1 자극에 중요 한 역할 그리고 특정 식물 종에 잘 뿌리 수는 높은 대기 이산화탄소에서 두 배로 예상된2. 잘 뿌리는 일반적으로로 정의 그 직경, 2mm 보다 작은 비록 그들의 기능3잘 뿌리를 특성화에 대 한 새로운 정의 옹호. 많은 정밀한 뿌리 처럼 루트 머리카락 글귀와 흡수의 기능을 제공 하지만 미크론 순서 직경을 가진 많은 더 작은 공간을 차지. 그들의 소형 때문에 루트 머리 이미지에 제자리에서 하기 어려운 고 필드 규모 실험 및 모델에 전체 루트 아키텍처의 한 부분으로 수시로 간과 된다.
루트 머리 테라 전 연구, 한 천 배지에서 자란 묘 목부터 등, 세포 성장 및 전송4,5에 대 한 귀중 한 정보 과학 커뮤니티 제공. 한 천 배지는 비소와 실시간으로 이미지를 루트 시스템을 허용, 그들은 영양소, 식물 호르몬, 또는 박테리아 같은 실험적 치료의 추가 대 한 높은 환경 제어를 제공 하지 않습니다. 고해상도 이미징 동안 동적 환경 제어 affording 식물 연구를 위한 미세 플랫폼의 출현을 촉진 하는 새로운 솔루션입니다. 이러한 플랫폼 비 파괴적인 성장 및 높은 처리량 형질6,7,,89, 고립 된 화학 치료에 대 한 몇 가지 식물 종의 시각화 사용 하는 10, 힘 측정11,12, 그리고 미생물13의 추가. 미세 플랫폼 디자인 단일 오픈 스페이스 유체 레이어는 뿌리 수 전파, 허용 루트 머리카락 성장 또는 치료 하는 동안 광학 초점 밖 드리프트의 사용에 집중 했다.
여기 우리은 이전 공장에 칩 디자인 주요 루트와 같은 영상 평면에 경종 루트 머리카락을 수감 하 여 구축 하는 2 층 미세 플랫폼 사진 및 소프트-리소 그래피 방법을 사용 하 여 개발을 위한 절차를 제시. 실시간으로, 높은 해상도, 그리고 실험적인 치료 과정 전반에 걸쳐 루트 머리 개발을 추적할 수 있습니다. 우리의 자란 메서드 애기 thaliana 묘 씨 플랫폼 및 주사기 펌프 장비의 사용을 필요로 하지 않는 수산화 하 고 메 마른 환경에서 주일에 대 한 교양에서 출 아 했다 수를 수 있습니다. 시간 경과 영상 실험 결론은, 일단 여기에 제시 된 플랫폼 미세한 루트 기능 들의 위치를 방해 하지 않고 열 수 있습니다. 다른 고해상도 이미징 방법의 사용 수 있습니다. 여기 우리 제공 대표 결과 정량화와이 플랫폼에서 루트 머리 형태학의 시각화에 대 한 광학, 스캐닝 전자 현미경 (SEM), 및 원자 힘 현미경 검사 법 기술 (AFM).

<table width="810">
	<tbody>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="width:209px;height:72px;">Silicon Wafer</td>
			<td style="width:191px;">WRS Materials</td>
			<td style="width:283px;">100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos&#60;100&#62;</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="width:209px;height:32px;">Quintel Contact Aligner</td>
			<td style="width:191px;">Neutronix Quintel Corp</td>
			<td style="width:283px;">NXQ 7500 Mask Aligner</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="width:209px;height:32px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Nikon</td>
			<td style="width:283px;">Eclipse Ti-U</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="width:209px;height:30px;">laboratory tissue</td>
			<td style="width:191px;">Kimberly Clark</td>
			<td>Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Negative Photoresist Epoxy</td>
			<td style="width:191px;">Microchem</td>
			<td style="width:283px;">SU-8 2000s series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Photoresist developer</td>
			<td style="width:191px;">Microchem</td>
			<td style="width:283px;">Su-8 developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:209px;height:42px;">trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>use in chemical hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Air Plasma Cleaner</td>
			<td style="width:191px;">Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">PDMS</td>
			<td style="width:191px;">Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184 Silicone elastomer base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">PDMS curing agent</td>
			<td style="width:191px;">Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Dessicator</td>
			<td style="width:191px;">Bel-Art</td>
			<td>F42010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Scalpel</td>
			<td style="width:191px;">X-acto knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Biopsy Punch</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella</td>
			<td>15110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Adhesive tape</td>
			<td style="width:191px;">Staples</td>
			<td>Invisible Tape</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Microfuge tube</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Triton X</td>
			<td style="width:191px;">J.T.Baker XI98-07</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Bleach</td>
			<td style="width:191px;">Chlorox</td>
			<td>concentrated</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:209px;height:42px;">Plant-Based Media</td>
			<td style="width:191px;">Phyto Technology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Agar</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td>A7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Wax film</td>
			<td style="width:191px;">Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">microscope</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Keysight Technologies</td>
			<td>5500 PicoPlus AFM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Petri dish</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>7400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:209px;height:42px;">Dual Gun Electron Beam Evaporator</td>
			<td>Thermionics</td>
			<td>Custom Dual Electron Gun Evaporation System</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the root hair morphology of arabidopsis seedlings in a two-layer microfluidic platform

루트 머리카락 더 나은 물 통풍 관 및 식물에 의해 영양소 흡수에 대 한 루트 표면 영역을 증가. 왜냐하면 그들은 작은 크기와 그들의 자연 환경에 의해 종종 가려진, 루트 머리 형태 및 기능 있으며 공부 하기 어려운 식물 연구에서 종종 제외. 최근 몇 년 동안, 미세 플랫폼 이미징 시스템에 전송 하는 동안 뿌리를 방해 하지 않고 높은 해상도에서 루트 시스템을 시각화 하는 방법을 제안 했다. 미세 플랫폼 제시 여기 빌드 이전 공장 온 칩 연구에 루트 머리와 같은 광학 평면을 애기 thaliana 주요 루트를 제한 하려면 2 계층 장치를 통합 하 여. 이 디자인 수는 휴대에 루트 머리카락의 정량화 및 세포 기관이 수준 및 또한 방지 실험적 치료의 추가 동안 표류 하는 z 축. 우리는 경종에 대 한 gnotobiotic 환경을 유지 하면서 유체 펌프에 대 한 필요 없이 포함 된 및 수 화 환경에서 장치를 저장 하는 방법을 설명 합니다. 광학 이미징 실험 후 장치는 분해 고 원자 힘 또는 좋은 루트 구조를 그대로 유지 하면서 전자 현미경을 스캐닝 기판으로 사용 될 수 있습니다.

여기에 설명 된 2 층 PDMS 미세 장치는 주 애기 루트와 옆으로 성장 루트 머리카락 (그림 1A)를 제한 하려면 20 µ m 높은 상공 200 µ m 높은 채널. 이 디자인 비슷한 루트 직경을 가진 종의 식물 애기 thaliana 로 사용 될 수 있습니다. 및 다른 크기. 의 종에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 디자인 통합 공장 입구 뿐만 아니라 원하는 화학 또...

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Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

2 층 미세 플랫폼에서 애기 모종의 루트 머리 형태를 이미징

이 문서에서는 기본 루트 및 루트 머리카락 하나의 광학 평면을 제한 하는 2 층 미세 플랫폼에서 애기 thaliana 묘 문화 하는 방법을 보여줍니다. 이 플랫폼은 다른 방법으로 고해상도 영상 뿐만 아니라 좋은 루트 형태학의 실시간 광학 영상에 대 한 사용할 수 있습니다.

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

imaging-root-hair-morphology-arabidopsis-seedlings-two-layer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

8.4K 조회수.  University of Tennessee. 이 문서에서는 기본 루트 및 루트 머리카락 하나의 광학 평면을 제한 하는 2 층 미세 플랫폼에서 애기 thaliana 묘 문화 하는 방법을 보여줍니다. 이 플랫폼은 다른 방법으로 고해상도 영상 뿐만 아니라 좋은 루트 형태학의 실시간 광학 영상에 대 한 사용할 수 있습니다.

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Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but important bioinstruments capable of testing the force dependence of structural features in proteins. Scale has been a limiting parameter on how accurately researchers can peer into the nanomechanical world of molecules, such as nucleic acids, enzymes, and motor proteins that perform life-sustaining work. Atomic force microscopy (AFM) is well tuned to determine native structures of fibrous proteins with a distance resolution on par with electron microscopy. However, in AFM force studies, the forces are typically much higher than a single molecule might experience 1, 2. Optical traps (OT) are very good at determining the relative distance between the trapped beads and they can impart very small forces 3. However, they do not yield accurate absolute lengths of the molecules under study. Molecular simulations provide supportive information to such experiments, but are limited in the ability to handle the same large molecular sizes, long time frames, and convince some researchers in the absence of other supporting evidence2, 4.
The gravitational force spectrometer (GFS) fills a critical niche in the arsenal of an investigator by providing a unique combination of abilities. This instrument is capable of generating forces typically with 98% or better accuracy from the femtonewton range to the nanonewton range. The distance measurements currently are capable of resolving the absolute molecular length down to five nanometers, and relative bead pair separation distances with a precision similar to an optical trap. Also, the GFS can determine stretching or uncoiling where the force is near equilibrium, or provide a graded force to juxtapose against any measured structural changes. It is even possible to determine how many amino acid residues are involved in uncoiling events under physiological force loads 2. Unlike in other methods where there is extensive force calibration that must precede any assay, the GFS requires no such force calibration 5. By complementing the strengths of other methods, the GFS will bridge gaps in understanding the nanomechanics of vital proteins and other macromolecules.

This is a step-by step guide showing the purpose, operation, and representative results from the novel gravitational force spectrometer.

섬유 단백질을 늘이기 및 측정 소설 중력 포스 분석기의 사용을 보여주는

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

연구

생체공학

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

RootChip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 Arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

멀티 장기 칩 - 장기 멀티 조직 공 배양을위한 미세 유체 플랫폼

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 Electrotaxis 연구

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...