신생 혈관, 새로운 혈관의 생성은 정상 및 병리학 적 사건 모두에서 매우 규제 되는 과정입니다. 신생 혈관화를 더 잘 이해하려면 체외에서 자연 세포 미세 환경에서 프로세스를 재구성하는 것이 중요합니다. 우리는 미세 유체 칩과 자동 제어를 개발했습니다.
고효율 순환은 관류 마이크로 튜브를 형성하고 새로운 혈관화의 초기 이벤트에 재현하기 위해 단백질을 사용하는 시뮬레이션하기 위해 수행됩니다. 미세 유체 발아 칩은 세 개의 채널로 구성되었다. 내피 세포 배양 채널과 액체 채널은 넓은 중앙 하이드로겔 채널에 의해 분리되었다.
미세 유체 제어 시스템은 미세 사기 펌프 및 전자기 핀치 밸브로 구성되었다. 버블 트랩 칩, 미세 유체 발아 칩, 마이크로 연동 펌프 및 배양 매체 저수지. 미세 유체 시스템으로, 내피 세포는 높은 발광 전단 스트레스, 생리학적 수준의 경내 피류 및 다양한 혈관 내피 성장 인자 분포에 의해 동시에 자극될 수 있다.
파이펫 20 마이크로리터 의 125 섬유넥틴의 밀리리터 당 마이크로 그램 세포 배양 채널의 하나의 미디어 주입 포트로. 파이펫 팁을 잘라 세포 배양 채널의 포트에 가위를 넣습니다. 파이펫 팁을 세포 배양 채널의 다른 배지 주입 포트에 삽입합니다.
그런 다음, 세포 배양 채널에서 공기를 피펫하여 섬유네틴으로 채웁니다. 칩을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 세포 파종 전에, 각 배지 주입 포트에 내피 세포 배지의 파이펫 20 마이크로 리터와 30 분 동안 섭씨 37도에서 칩을 배양.
그런 다음 모든 미디어 주입 포트의 모든 미디어를 피펫합니다. 다음으로, 세포 배양 채널의 하나의 배지 주입 포트로 세포 현탁액의 파이펫 5 마이크로리터. 그런 다음 내피 세포는 차동 유수압하에서 전체 채널에 빠르게 확산됩니다.
다른 포트에 ECM 매체의 약 4~6마이크로리터를 추가하여 정압 압력을 조정하고 세포 이동을 중지합니다. 칩을 인큐베이터셀로 리모컨합니다. 그런 다음 내피 세포가 세포 배양 채널의 내부 표면 주위에 코팅 될 때까지 30 분마다 칩을 뒤집습니다.
파이펫 팁을 사용하여 사출 포트에 부착된 셀을 매우 신중하게 제거합니다. 그런 다음 4개의 가시 암컷 Luer 어댑터를 미디어 사출 포트에 삽입하고 ECM 매체로 채웁니다. 칩을 분리하여 인큐베이터에 적용하고, 12시간마다 ECM 미디어와 루어 어댑터를 변경합니다.
미세 유체 제어 시스템을 조립하려면 폴리테트라플루오로틸렌 튜브 2개, 짧은 실리콘 튜브 2개, 긴 실리콘 튜브 3개, 가시 암컷 루어 어댑터 1개, Y형 커넥터 1개, L형 커넥터 3개를 준비합니다. 주사기를 예열된 ECM 배지10밀리리터로 채웁니다. 철제 여성 루어 어댑터로 폴리테트라플루오로틸렌 튜브를 주사기에 연결합니다.
그런 다음 폴리테트라플루오로틸렌 튜브의 다른 끝을 Y 형 커넥터에 연결합니다. 다음으로, 두 개의 긴 실리콘 튜브를 Y 형 커넥터의 다른 두 단에 연결합니다. 우리는 하나의 튜브를 사용하여 저수지와 다른 튜브에 연결하여 버블 트랩 칩에 연결합니다.
또 다른 긴 실리콘 튜브를 저수지에 연결합니다. 다음으로 두 개의 짧은 실리콘 튜브를 사용하여 버블 트랩 칩의 상단 레이어에 있는 모든 입구와 콘센트 구멍을 연결합니다. 폴리테트라플루오로틸렌 튜브를 칩의 백엔드에 연결합니다.
다음으로 주사기를 마이크로시링펌프에 고정합니다. 전자기 핀치 밸브에 두 개의 긴 실리콘 튜브를 클립. 다음으로 전자기 핀치 밸브를 전환하여 주사기와 저수지 사이의 파이프라인을 엽니다.
마이크로시링펌프를 사용하여 저장소에 미디어를 주입하여 튜브의 공기를 배출합니다. 그런 다음 밸브를 다시 전환하여 주사기와 버블 트랩 칩 사이의 파이프라인을 엽니다. 거품 트랩 칩의 액체 챔버와 백 엔드 튜브를 채우기 위해 미디어를 주입합니다.
세포 인큐베이터에서 내피 발아 칩을 꺼내서 세포 배양 측의 Luer 어댑터를 제거하십시오. 미세 유체 발아 칩의 하이드로겔 사출 포트에 두 개의 파이프 플러그를 삽입합니다. 버블 트랩 칩의 백 엔드 튜브를 세포 배양 채널의 한 포트에 연결합니다.
T 형 커넥터를 다른 포트에 삽입하고 저장소와 연결된 긴 실리콘 튜브에 연결합니다. 긴 실리콘 튜브를 마이크로 연동 펌프에 잘라냅니다. 그런 다음 공기 필터를 저수지에 삽입합니다.
다음으로, 미세 유체 발아 칩을 스테이지 탑 인큐베이터에 조립합니다. 다음으로, 진공 펌프를 TPU 튜브로 버블 트랩 칩의 하단 층의 구멍에 연결합니다. 미세 주 펌프와 전자기 핀치 밸브를 동시에 제어하는 사용자 정의 프로그램에서 반대 순환 볼륨과 유량을 설정합니다.
다음으로, 마이크로 연동 펌프의 유량을 설정합니다. 마이크로 시링주 펌프를 켭니다. 이어서 순환 제어 시스템이 구축된다.
우리는 40 kDa F-I-T-C 덱스트린의 확산 투과성 계수를 측정하여 모델에서 일부 마이크로 선박의 장벽 기능을 테스트합니다. 그림에 나타난 바와 같이, 세포 안대기를 가진 정적 배양 칩의 확산 투과성 계수는 초당 0.1 플러스 또는 마이너스 0.3 마이크로미터이다. 그리고 세포 안대기없이 빈 채널의 확산 투과성 계수는 초당 5.4 플러스 또는 마이너스 0.7 마이크로미터이다.
내피 발아 분석은 내피 세포가 24 시간 의 정적 배양 후 중앙 하이드로겔로 크게 발아되는 반면 발광 정도는 발광 전단 응력의 증가와 함께 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 정량적으로, 발광 전단 응력은 발아 의 영역에서 크게 내피 발아를 감소, 평균 발아 길이, 그리고 가장 긴 새싹 길이. 우리의 시스템으로, 내피 세포에 전단 응력은 생리적 수준에 머무르는 동안 실험 도중 언제든지 선택적으로 변경될 수 있었습니다.
이 시험관 내 3D 생체 모방 모델은 neovasularization 메커니즘의 연구에 직접 적용 될 수 있으며 약물 선별 및 독성 응용 프로그램을위한 저렴한 비용 플랫폼으로서의 잠재적 인 약속을 보유합니다.
