이 작품은 연방 교육부 및 연구의 독일 막스 플랑크 협회 공동 투자 MaxSynBio 컨소시엄의 일부입니다.

저자는 공개 없다.

대칭 및 비대칭 높은 염 분 조건 하에서 위상 상태 관찰에 대 한 GUVs의 성공적인 생산
여기에 제시 된 프로토콜 구성의 광범위 한 범위에 걸쳐 청구 GUVs의 막 단계 상태에 높은 염 분 버퍼 및 솔루션 비대칭의 영향을 평가 하는 전략을 소개 합니다. 이 목표 달성으로 주요 과제 중 하나는 높은 염 분 버퍼에 충전된 GUVs의 생산을 했다.
우리가 성공적으로 예금 된 지질 영화의 사전 수 화 단계와 소포 성장 위한 하룻밤 최종 수 화 단계를 포함 한 간단한 자발적인 붓기 접근에 의해 자당 솔루션에 높은 염 분 버퍼 GUVs를 생산. 그것은 지질 증 착도 지질 unilamellar 소포를 확산 있도록 roughened PTFE 접시에 수행 해야 하는 것이 중요. 또한, 지질 영화 균질 성 및 액체 단계 상태에는 온도에 소포 준비 하는 동안 모든 단계를 수행 하려면 필수적입니다. 다른, 소포 인구 구성에서 polydisperse 수 하 고 최종 인구 단계 상태 분석 편견 수 있습니다. GUVs 수율의 자발적인 붓기 기 덩어리는 한 손으로 다시 얻기 위해 작은 볼륨에서 중단 가능성에 대 한 특정 프로토콜 소포 분산 매우 집중 하 고 다른 한편으로 비대칭 솔루션을 제공 합니다. 소포8,28의 희석을 최소화 하면서 막에 걸쳐 조건. 그것은 소포 희석 또는 외부 솔루션 중 교환, 내부 및 외부 osmolarities 유지 일치 osmolarity 불일치에 의해 발생 하는 형태 변화 유도 또는 Lo + Ld 단계 분리41 을 방지 하거나, 당뇨의 경우 필수 조건, 기 파열 될 수 있습니다.
여기, 높은 염 분 솔루션에서 electroformation 프로토콜을 최적화 하려고 PVA 기반 붓기 multilamellar 소포 굴복 하는 동안 아무 GUVs의 생산에 결과. 자발적인 여 긴 준비 시간 및 낮은 품질10,17기 일괄에서 결과, 충전된 vesicles의 성공적인 생산을 요구 하더라도 붓기는 추가적인 이점을 함께 제공 됩니다. 그것은 통계 일괄 분석에 대 한 충분 한 수익률 발생 하면서 최소의 노력을 요구 하 고, electroformation와 달리 정교한 장비 또는 최적화 필요 했다. 또한, 지질 산화에 의해 아무 오염42,43관찰 되었습니다. 문학에 따르면 소포의 지질 구성 하 고 해당 주식7,17성장 했다 그들은 사이 차이가 있다. 또한, PTFE 기판에 소포 대형 기판23에 의해 외국 분자를 도입 젤 기반 붓기 방법 달리 어떤 오염 포함 메시지가 표시 되지 않습니다. Electroformation 비대칭 솔루션 조건을 만들 때 과도 한 소포 희석에 관련 된 추가 단점이 함께 제공 됩니다. GUVs electroformation에 의해 생산은 일반적으로 (달리 자발적인 붓기 동안 덩어리의 형태로 농축된 기 정지) 균질 분산으로 존재 한다. 외부 솔루션의 어떤 희석도 소포 수를 희석 실질적으로 것 이다. 또한, 관찰이 작업의 과정을 통해 DOPG/eSM/철 GUVs 자당에서 electroformation 제작한 불안정 한 경우에 높은 염 분 버퍼에 희석 되었다. 현미경 슬라이드에 지질 패치에서 형광 표시 그들의 시각적인 검사 가능 했다 전에 소포 버스트 것 이다. 이러한 불안정 소포 자발적인 붓기10여 그에 비해 electroformation에 의해 준비의 높은 막 긴장 관찰 될 수 있습니다.
그것만 높은 분수에 쓰 신 부분 외부 솔루션 exchange 수행 소포 희석은 비대칭 우두머리 솔루션 조건을 만드는 쉽고 빠른 접근, 비록 (여기: 95%, 그림 2), 희석, 시의 흔적으로 솔루션을 붓기 남아 있게 됩니다. 외부 솔루션 exchange의 학위의 붓기 솔루션 (2 절) 함께 기 덩어리를 pipetting와 너무 많이 그것을 diluting 하지 사이 교환 이다. 따라서, 우리는 세부37 신속 하 고 완전 한 외부 솔루션 exchange 우두머리 위상 상태 관찰 하는 동안 만든 희석 단계 상태 관측을 확인 하도록 허용 하는 다른 논의 대체 미세 접근 도입 소포입니다. 위상 상태 변이 대칭에서 비대칭 솔루션 조건으로 변경 하는 경우의 관측 될 계약에 실제로 관찰 되었다. 또한, 두 가지 방법 모두 비대칭 솔루션 조건 comparably 빠른 운항 표시 (비교 참고.8)을 생성 하 고 로컬 구성 변경 (참조30,31비교)의 알려진된 위험 없이 함께 하 막 긴장 (비교 참조32), 증가 하거나 지역 난방 (비교 기준33), 다른 방법에 대해서는 소개에서 설명 합니다. 미세 트래핑 중 기 내부와 외부 사이의 삼 투 균형은 위에서 언급 한 단계 상태 유물 뿐만 아니라 마 솔루션 조건으로 인해 발생 하는 디플레이션을 피하기 위해 유일한 에센셜 슬립 갇혀 GUVs를 발생할 수 있습니다. 통해 외부 솔루션 교환 후 게시물.
도 불구 하 고 자발적인 붓기 저격총 성장에 성공적으로 적용 된 다른 경우, 비용의 부재에서에서 DOPC/eSM/철 시스템에서 소포 우두머리 개별 bilayers44 사이 반발 작용의 결과 부족 붓기 저하 될 수 있습니다. . 미리 붓기 기간을 연장 또는 부피가 큰 지질 headgroups 도입이 문제45카운터 수 있습니다. 또한, 붓기에 사용에서 다른 솔루션에서 자신의 희석 후 소포 안정성 다른 지질 작곡과 우리 여기 조사 하지 않은 희석 미디어에 대 한 달라질 수 있습니다. 우리는 또한 여기 준비 방법으로 평균 우두머리 직경 튜닝의 가능성을 탐구 하지 있다. 하지만 소포 구성과 솔루션 붓기 같은 매개 변수는 결과 영향을 미칠 가능성이 높습니다. 그러나 다른 방법46 의 응용 지질 및 여기에 사용 되는 솔루션에 대 한 더 큰 소포를 얻을 수 있습니다, 그리고, 그들은 방법으로 관련 된 다른 단점에와 함께 올 수 있습니다. 위에서 설명한 접근 대칭 및 비대칭 높은 염 분 조건에서 GUVs를 생산 하는 소포 다른 지질 구성의 구성 및 다른 매체에 있는 분산의 추가 연구에 대 한 잠재적인 도구를 제공 합니다. 마찬가지로 우리는 그 가능성을 탐험 하지 않은, 향후 재판 어떻게 일반적으로 우두머리 준비 및 희석 방법 적용 될 수 있습니다 표시 됩니다.
다양 한 온도에서 상 분리 관찰
다양 한 온도에서 GUVs 연구에 적합 한 다른 실험 설정을 존재 합니다. 이 설정을 일반적으로 문학에서 자세히 설명 하지 않습니다, 하는 동안 현재 작업 이러한 연구에 대 한 해당 기본 어셈블리를 제공 합니다.
_content "> 제어 측정 표시이 자체 설계 및 챔버의 온도 정확 하 게는 서 모스 탯에 의해 제어 챔버 내부에 온도 기울기는 실험 온도 분해능. 그것은 실험 열 조건 온도 읽기와 일치 하는 보장 됩니다.
광범위 한 온도 범위 우두머리 위상 상태 평가 기간 동안 온도 변경 된 후 관찰된 소포 equilibrated 잘은 중요 하다. 이것을 보장 하기 위해 한 가지 가능한 방법은 히스테리시스를 확인 하는 것입니다. 있으면 히스테리시스, 온도 단계를 감소 해야 합니다 및/또는 평형 시간 증가. 온도로이 작품에서 제어 방식으로 설정 됩니다 물 기반 온도, 작업 온도 범위는 0-100 ° c.에 이상적으로 제한 이 범위를 확장할 수 있습니다 다른 온도 제어 액체 오일 등을 사용 하 여 또는 다른 설정, 예를 들어 채용 하 여 Peltier 장치. 실제로, 작동 온도 또한 가능한 응축 또는 증발에 의해 제한 됩니다. 또한, 멀리 실내 온도에서 온도, 관찰 실에서 정상 상태 온도 기울기의 발생 확률이 된다. 또한, 영상 장비 극단적인 온도에 다치 지 될 수 있습니다. 지질 기 연구 (9~ 10-50 ° C7,)에 대 한 적절 한 온도 범위에 대 한 관측 장비에 손상을 고려해 야 하지만 일반적으로 예상 하지.
소포 도메인 관찰 유물
넓은 필드 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 관찰 아티팩트에 대 한 소스도 많습니다. 우선, 하나 기 위상 상태의 시각적 검사에 대 한 적용 되는 개체의 최대 해상도 r 에 따라 지질 도메인의 검출 한계를 결정 합니다 알고 있어야 합니다. 
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56034/56034eq2v2.jpg"> 여기서 λ 는 방출 파장 하 고 나는 목표의 숫자 조리개. 40 x 확대 및 녹색 방출 감지 0.6의 나 일반적인 목표 빛 약 560 nm ~0.6 µ m. 따라서, 소포 사이 다른 특정 지질 혼합물에서 만든의 위상 상태를 비교 하는 연구는 광학 해상도 도달할 것 이다 조건 같은 지질 혼합물에 대 한 동일한 목표를 사용 해야 합니다.
다른 아티팩트는 여기 빛41에 확장된 노출 때문 지질 사진-산화의 결과로 지질 도메인의 발생 이다. 사진 손상 불포화 탄화수소 지질 moieties에 우선적으로 발생합니다. 사실, 일부 지질 구성에 대 한 이러한 도메인 형성 처음 균질 vesicles의 관찰 되었다 여기 여기 빛 노출 오랜된 기간 후 (~ 30 s). 그 문제에 대응 하기 위해 여기 빛 유지 되었다 초점 보기의 한 필드에서 위상 상태 평가 대 한 몇 초. 따라서, DiIC18 우리의 목적을 위해 적당 했다. 그러나 다른 염료,, 훨씬 더 중요 한 수 있으며 낮은 자극 강렬에 및 짧은 흥분 빛의 노출 시간으로 처리 해야 할 수 있습니다.
기계적 전단 응력은 소포의 피 펫 전송에서 잠재적으로 일시적으로, 그로 인하여 왜곡 명백한 기 위상 동작 도메인 믹스. 일부 일괄 처리에 대 한 다른 소포 보여 다른 위상 동작 0 분 및 5 분 후 피 펫 현미경 coverslip에 전송. 또한 미세 장치에서 유체 흐름에 의해 유도 된 전단 응력은47혼합 도메인을 보였다. 소포 충분 한 관찰 하기 전에 평형에 대 한 시간 동안 그대로 남겨져 야 한다. 이 연구에서 소포 미세 장치에 갇혀 소포 로드 및 관찰 하기 전에 솔루션 교환 후 1 시간에 그대로 남아 있었다.
위에서 언급 한 어려움 뿐만 아니라 빛의 회절 한계, 핵 자기 공명 분광학48 또는 슈퍼 해상도 현미경 기법49 등 다른 방법에 의해 부과 된 제한 중 일부를 피하기 위해 고용 될 수 있었다.
결론 및 전망
제시 작품 막 단계 분리에 높은 염 분 대칭 및 비대칭 솔루션 조건의 영향의 분석을 허용 하는 메서드 집합을 보여 줍니다. 제시 방법의 모두는 다른 응용 프로그램에 적합 합니다. 미세 소자는 예 도메인 형성 및 솔루션 비대칭의 유도 따라 실종의 속도 론을 공부 하는 플랫폼을 제공 한다. 또한, 도메인 모양 소금 농도의 기능으로는 그런 식으로 검사 수 있습니다. 모든 방법 또한 관심의 다른 솔루션을 사용 하 여 위상 동작에 영향을 보면 사용 수 있습니다.

이후 마이크론 크기에서 도메인의 액체-액체 상 분리 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs) 형광 현미경 검사 법에 의해 관찰, GUVs로 사용 되었습니다 모델 시스템 조사 지질 뗏목 가설1,2 , 3 . 로 그들의 독립형 bilayer의 지역 생물 세포에서 그의 범위에서 그들은 가설된 뗏목을 특징으로 하는 플라즈마 세포 막의 적당 한 모방 이다. 순수한 물, 자당 또는 낮은 염 분 솔루션4,5,6,,78에 분산 된 소포와 같은 GUVs에 대 한 수많은 연구 수행 되었습니다. 그러나 셀에 대 한 조건으로이 조건은, 높은 염 분 환경 및 횡단 막 솔루션 비대칭 biomembranes의 순수 관련 노출을 반영 하지 않습니다.
이 작품에서는, 우리의 그룹9에서 이전 간행물에서 충전된 multicomponent GUVs의 위상 상태는 막에 걸쳐 소금과 솔루션 비대칭의 존재의 기능으로 시험 되었다. GUVs는 dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), 계란 sphingomyelin (eSM), 고 콜레스테롤 (철) (210 mOsm/kg의 osmolarity)와 자당 솔루션 또는 높은 염 분 버퍼 (100 m m NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5, 210의 다른 비율의 혼합물에서 준비 했다 mOsm/kg 기준)입니다. 지질 선택이 혼합6,8단계 도표에 이미 얻은 데이터에 의해 정당화 되었다.
GUVs의 준비에 대 한 메서드의 여러 문학10,,1112 에서 사용할 수 있습니다 (여기에 유의 우리 그 지질 석유 기반에서 수성 단계 전송 포함을 고려 하지 것입니다 13 , 14 단계 동작에 영향을 미칠 수 있는 막에 남아 있는 기름 잔류물의 고유한 위험 때문에). 높은 염 분 버퍼에서 GUVs의 준비는 구체적인 과제와 연결 됩니다. 낮은 이온 강도의 솔루션, electroformation 방법15,16 작은 결함10,17높은 수율에 GUVs를 준비 하는 빠른 방법을 제공 합니다. 메서드를 사용 하면 지질 층 전도성 표면 (전극)에 입금, 그들, 건조 및 AC 필드를 적용 하는 동안 그들을 용액으로 보습을 기반으로 합니다. 그러나,이 방법은 조정 경우 소금 수성 솔루션18,19에 존재 하는 필요 합니다. 그것은 electroformation에 의해 소포 성장 위한 원동력 electroosmosis16 높은 conductivities20에서 방해는 가정. 따라서, 높은 염 분 해결책에 GUVs의 electroswelling이 아니다 간단 접근 그것은 다른 소금 농도 붓기 솔루션에 대 한 최적화를 요구 한다. 젤 기반 소포21,22 붓기 더 빨리 형성 시간 electroformation에 잠재적인 대안 이다. 이 이렇게 젤 (agarose 또는 폴 리 비닐 알코올 (PVA))는 기판으로 사용 될 때 향상 된 지질 영화 화에 만듭니다. 그러나 이러한 접근, agarose 기반 붓기23 / 온도 제한 PVA 기반 붓기의 경우 경우 막 오염의 위험으로 온다. 마찬가지로, GUVs 셀 루 로스 종이 기판에 성장 하는 프로토콜 최근 설립된24되었습니다입니다. 이 방법의 일반적인 문제는 기판 순도 제어의 부족 뿐만 아니라 많은 양의 지질 사용 합니다. 이 작품에서 소개 하 고 우두머리 준비, 즉 자발적인 붓기 방법25,26에 대 한 가장 전통적인 방법의 장점을 제공 합니다 우리. 그것은 건조-수증기 분위기, 그리고 원하는 붓기 솔루션 이후 붓기에 하이드레이팅 lipophobic 기판에 지질 층의 구성 ( 그림 1 및 프로토콜 섹션에서 세부 정보 참조). 이 방법은 소포 크기 배포 제어를 제공 하지 않습니다와 생산 전기 분야에 의해 원조 된다 하는 방법에 비해 전반적으로 더 작은 소포 폴리머 기판 또는 미세 결과. 그러나, 소포 품질과 크기는 여기 탐험으로 막 단계 상태 검사 적합 합니다.
소포 막에 걸쳐 솔루션 사이의 불균형을 만들기 뿐만 아니라 특정 과제와 연결 됩니다. 일반적으로 사용 되는 한 가지 방법은 원하는 외부 솔루션27,28기 서 스 펜 션의 직접 희석입니다. 그러나,이 또한 기 분포 밀도를 줄인다. 또 다른 전략 천천히 GUVs 솔루션에 대 한 허용-흐름 셀의 하단에 정착 주위 외부 솔루션을 교환 하는 것입니다 그리고 outflux. 방해 또는 심지어 흐름 소포를 잃고을 피하기 위해, 낮은 흐름 요금은 적용된8,이 이렇게 비효율적인 시간을 렌더링 합니다. 또한, 이러한 방법의 전체 외부 솔루션 교환을 보장합니다. 외부 솔루션 교환 하는 동안 그들을 잃고 피하기 위하여 소포를 무력화 하는 확실 한 해결책이입니다. 예를 들어, biotinylated GUVs streptavidin 입히는 표면29에 곁에 있을 수 있습니다. 그러나,이 접근에는 준수 작곡 유사 이어질 수 있습니다 그리고 그러므로 비 준수 막30,31세그먼트. 자석의 응용 프로그램 또는 전기 분야를 부과 하는 막에 소포 결과 트랩 긴장32. 핸들 하는 데 필요한 함정에 기 하 광학 핀셋 채용 광 들 것을 사용 하 여 지역 난방33를 포함 수 있습니다 (즉, 구슬), 연결 된. GUVs의 트래핑 최종 분리34없이 백 금 철사에 그들을 성장 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나 이것 얇은 지질 관 (밧줄)에 의해 소포는 격리 하 고 철사에 일반적으로 연결 되는 또는 다른 소포를 생성 합니다.
제시 일 상기 한계를 극복 하는 전략을 강조 한다. 우리는 먼저 적응 하 고 높은 염 분 버퍼에서 GUVs의 생산을 위한 최적화 된 자발적인 붓기 방법에 대 한 자세한 설명을 제시. 다음 효율적으로 간단한 희석 또는 미세 소자의 활용에 의해 비대칭 솔루션 상태를 만드는 두 가지 방법을 소개 합니다. 우리의 목표는 다른 솔루션 조건에서 GUVs의 막 단계 상태 분석, 때문에 성공적인 통계 분석에 대 한 기준 및 피 잘못 된 분류를 위한 현재 힌트 후속 섹션에 설명 합니다.
분석은 등온 조건에서 뿐만 아니라 다양 한 온도에서 수행 했다. 동안 온도 control 일반적으로 고용, 실험 온도-제어 약 실에 대 한 정보는 거의 설명. 여기, 다양 한 온도 조건에서 GUVs를 관찰 하는 자체 내장된 설치 제공 됩니다.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol), sodium salt</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475C</td><td>abbreviated as DOPG in the text</td></tr><tr><td>chicken egg sphingomyelin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860061</td><td>abbreviated as eSM</td></tr><tr><td>cholesterol (ovine wool, &gt; 98 %)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>abbreviated as Chol</td></tr><tr><td>1,1&#039;-dioctadecyl-3,3,3&#039;,3&#039;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td><td>Molecular Probes</td><td>D-282</td><td>abbreviated as DiIC&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Chloroform, HPLC grade (&amp;ge; 99.8 %)</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (&gt; 99.8 %)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (37 %)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (&amp;ge; 99.9 %)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (&amp;ge; 99.5 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Threaded vial 45x27 mm, 15 mL</td><td>Kimble</td><td></td><td>Soda flat bottom, white screw cap</td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>MP220</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat030</td><td></td></tr><tr><td>Epi-fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer D1</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Objective 40x, 0.6 NA</td><td>Zeiss</td><td>LD Achroplan</td><td></td></tr><tr><td>Objective 40x, 0.75 NA</td><td>Leica</td><td>506174</td><td></td></tr><tr><td>Objective 63x, 0.9 NA</td><td>Leica</td><td>506148</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 &amp;plusmn; 0.01 mm</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover slip, 22x22 mm, 0.17 &amp;plusmn; 0.01 mm</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;aser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Bremix Flexible Packaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringes, 5 mL, 10 mL</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m syringe filter</td><td>GVS North America</td><td>Cameo 25AS, 1213723</td><td>Acetate, sterile</td></tr></tbody></table>

phase behavior of charged vesicles under symmetric and asymmetric solution conditions monitored with fluorescence microscopy

거 대 한 unilamellar 단계 구분 된 소포 (GUVs) 공존 전시 액체 주문 하 고 액체 난잡 도메인은 지질 뗏목 가설을 조사 하는 일반적인 생물 도구. 그러나 다 수의 연구,, 생리 솔루션 조건의 영향을 게을리. 해당 계정에서 현재 작업 충전된 GUVs dioleylphosphatidylglycerol, 계란 sphingomyelin, 및 콜레스테롤에서 성장에 액체-액체 상 분리에 높은 염 분 버퍼와 트랜스 막 솔루션 비대칭의 효과 제공 합니다. 효과 등온 및 다양 한 온도 조건 하에서 공부 했다.
우리는 장비 및 실험 전략 대칭 및 비대칭 높은 염 분 솔루션 조건에서 충전된 소포에 공존 액체 도메인의 안정성 모니터링에 대 한 적용을 설명 합니다. 높은 온도에서 높은 염 분 버퍼에 충전된 multicomponent GUVs를 준비 하는 접근 방식을 포함 됩니다. 프로토콜 옵션을 소포 희석을 최소화 하면서 외부 솔루션의 부분 교환 간단한 희석 단계 수행을 수반 한다. 다른 접근은 완벽 한 외부 솔루션 교환을 허용 하는 미세 장치를 활용 하 여 제공 됩니다. 단계 분리에 솔루션 효과 또한 다양 한 온도에서 공부 했다. 이 위해, 우리는 기본 설계 및 유틸리티는 자체 내장된 온도 제어 챔버의 제시. 또한, 우리 우두머리 위상 상태 평가에 반영 함정 연관 그것과 그들을 회피 하는 방법.

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Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

단계 구분 된 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs)에 대 한 실험은 자주 생리 솔루션 조건 게을리. 이 작품 횡단 막 솔루션 비대칭 및 온도 기능으로 충전된 multicomponent GUVs에서 액체-액체 상 분리에 높은 염 분 버퍼의 효과 연구에 접근을 제공 합니다.

형광 현미경 검사 법으로 모니터링 하는 대칭 및 비대칭 솔루션 조건에서 충전된 Vesicles의 위상 동작

Phase-separated giant unilamellar vesicles (GUVs) exhibiting coexisting liquid-ordered and liquid-disordered domains are a common biophysical tool to ...

phase-behavior-charged-vesicles-under-symmetric-asymmetric-solution

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.1K 조회수.  Max Planck Institute of Colloids and Interfaces. 단계 구분 된 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs)에 대 한 실험은 자주 생리 솔루션 조건 게을리. 이 작품 횡단 막 솔루션 비대칭 및 온도 기능으로 충전된 multicomponent GUVs에서 액체-액체 상 분리에 높은 염 분 버퍼의 효과 연구에 접근을 제공 합니다.

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Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

연구

생화학

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

막 거 대 한 소포 지역화 된 칼슘 이온 기울기에 대 한 응답에서의 개장

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

화학

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

생체공학

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main common features required for this activity resulted from the interactions of CPPs with the plasma membrane (lipids) and more particularly with components of the extracellular matrix of the membrane itself (heparan sulphate). Indeed, independent of the direct translocation or the endocytosis-dependent internalization, lipid bilayers are involved in the internalization process both at the level of the plasma membrane and at the level of intracellular traffic (endosomal vesicles). In this article, we present a detailed protocol describing the different steps of a large unilamellar vesicles (LUVs) formulation, purification, characterization, and application in fluorescence leakage assay in order to detect possible CPP-membrane destabilization/interaction and to address their role in the internalization mechanism. LUVs with a lipid composition reflecting the plasma membrane content are generated in order to encapsulate both a fluorescent dye and a quencher. The addition of peptides in the extravesicular medium and the induction of peptide-membrane interactions on the LUVs might thus induce in a dose-dependent manner a significant increase in fluorescence revealing a leakage. Examples are provided here with the recently developed tryptophan (W)- and arginine (R)-rich Amphipathic Peptides (WRAPs), which showed a rapid and efficient siRNA delivery in various cell lines. Finally, the nature of these interactions and the affinity for lipids are discussed to understand and to improve the membrane translocation and/or the endosomal escape.

The fluorescence leakage assay is a simple method that enables the investigation of peptide/membrane interactions in order to understand their involvement in several biological processes and especially the ability of cell-penetrating peptides to disturb phospholipids bilayers during a direct cellular translocation process.

세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 조사하기 위한 형광 누설 분석

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

신경과학

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

생물학

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...