이 작품은 (NO. 0,312,040 부여) 막스 플랑크 협회, 독일 암 연구 센터, 튀빙겐 대학과 Bundesministerium 대 Bildung 놀이 Forschung에 의해 지원되었다. 우리는 우리가이 원고의주의 독서의 힘 곡선 데이터와 박사 야콥 Suckale의 분석을 자동화 도와 에드워드 헤르만 감사합니다.

지원 지질 이중층 1. 준비 (SLB) 11,12,21 <ol><li> 지질 혼합 및 다중 층 소포 현탁액의 준비 <ol><li> 사전에 다음과 같은 버퍼를 준비합니다. <ol><li> 2.7 mM의 KCl을, 농도의 PBS 완충액을 준비가 1.5mm KH 2 PO 4, 8 mM의 나 2 HPO 4, 및 137 mM의 염화나트륨, pH가 7.2. </li><li> 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 HEPES, 산도 7.4의 농도에서 SLB (지원 지질 이중층) 버퍼를 준비합니다. </li><li> 1 M 염화칼슘 (2)의 솔루션을 준비합니다. </li></ol></li><li> 원하는 농도의 클로로포름에 녹인 다음 지질 : 예를 들어, 디 - 올레 일 포스파티딜콜린 10 ㎎ / ㎖의 25 ㎎ / ㎖ 및 콜레스테롤 (Chol을) 25 ㎎ / ㎖, 스 핑고 미엘린 (SM)의 (DOPC). </li><li> 2 : 1 DOPC : SM : Chol을 몰 비율이 총 지질의 1 mg을 가진 솔루션을 만들기 위해 DOPC의 18.38 μL, SM의 17.10 μL 및 Chol을의 11.30 μl를 가져 가라. conce을 기반으로 그에 따라 볼륨을 변화1.1.2에서 제조 지질 ntrations. 2 : 1 DOPC : SM : Chol을, 멤브레인 (25)의 위상 특성을 변경한다 몰비를 변화하지만, 2의 몰비를 유지한다. </li><li> 텍싱에 의해 완전히 솔루션을 섞는다. 하나는 형광 현미경에 의해 이중층를 시각화하고자하는 경우는 0.05 몰 %로 지질 형광 염료를 추가한다. 주 : 장쇄 dialkylcarbocyanines의 가족,처럼, DII 및 DIO는 넓은 파장 범위에 걸쳐 이상적으로 지질막 라벨을 사용할 수있다. 대안 적으로, 로다 포스파티딜 BODIPY 또는 콜레스테롤과 같은 형광 표지 된 지질을 사용할 수있다. 어떤 경우에, 염료의 농도는 지질에 결합 된 형광은 고농도의 지질 동작 (19)을 변경할 수 있다는 것을 염두에두고, 현미경 설정에 따라 최적화되어야한다. </li><li> N 2 가스를 사용하여 클로로포름 (또는 사용 가능한 불활성 가스 Ar과 같은 그분을) 떨어져 건조. </li><li> 또한 건조 T그는 적어도 1 시간 동안 진공 하에서 혼합 지질. 주 :이 지질 혼합물을 저장하는 경우, 불활성 가스 (N 2 나 Ar 그는)에 공기를 제거하고 -20 ℃에서 저장. 작은 갈색 유리 병에 여분의 지질 -에 - 클로로포름 나누어지는. -20 ℃에서 불활성 가스 (N 2에 Ar 또는 He)와 저장소 공기를 변위, 지질 혼합물과 유사한 방식으로 그것들을 건조시킨다. </li><li> 10 ㎎ / ㎖의 농도로 PBS 완충액 건조 지질을 녹인다. </li><li> 소용돌이 1 분에 약 20 초 동안 적극적으로 혼합물 다중 층 소포를 포함, 흐린 서스펜션을 얻을 수 있습니다. 이 병의 측면에 집착에는 지질 필름이 없는지 확인합니다. </li><li> 10 μL 씩 (지질의 1 mg을 10 분취한다)에이 현탁액을 배포합니다. </li><li> 더 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 단일 층 소포의 준비 주 : 단층 라멜라 소포의 각종 크기는 초음파 법 또는 압출 법을 이용하여 제조 될 수있다. 초음파는 S를 사용운드, 에너지는 혼합물을 교반 및 다중 층 현탁액의 분액. 이는 불투명 한 현탁액까지 취소하여 표시됩니다. 압출 한정된 기공 크기의 멤브레인 필터를 통과 다중 층 소포를 강제. <ol><li> 초음파 방법 <ol><li> 다중 층 지질 현탁액의 10 μl를 타고 SLB 버퍼의 150 μl를 추가합니다. </li><li> 작은 (2 mL)에 덮인 유리 바이알에 옮기고, 혼합물을 파라 필름으로 밀봉. </li><li> 10 분 동안하거나 (직경 50 nm의 아래의 SUVs) 소형 단일 층 소포를 수득 선명해질 때까지 욕조 초음파 처리기에서 실온에서 혼합물을 초음파 처리. </li></ol></li><li> 압출 방법 <ol><li> 다중 층 지질 현탁액의 10 μl를 타고 SLB 버퍼의 150 μl를 추가합니다. </li><li> 극저온 튜브로 현탁액을 전송합니다. </li><li> 액체 질소에 몇 초 동안 극저온 튜브를 침지하여 지질 현탁액을 동결. </li><li> 해동몇 분 동안 물을 실온에서 욕조 또는 37 ° C에서 극저온 튜브를 침지하여 지질 현탁액. 동결 해동 단계 적어도 10 번 반복합니다. </li><li> 지질 현탁액을 압출하기 위해서, 200 nm의 기공 크기를 갖는 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용하여 상업적 압출 장치 (26) (다른 기공 크기가 100 나노 미터 또는 400 나노 미터 등을 사용할 수있다). 참고 : 현재, 두 개의 압출기 장치는 상업적으로 사용할 수있다 : 수동 압출기 작은 볼륨 (몇 ml를 200 μL)에 사용할 수 있습니다. 이 경우, 샘플은 수동 두 주사기 사이에 앞뒤로 현탁액 밀어 막을 통해 압출된다. 제조사에 따라, 지질 분취 량 세트의 최대 최소 체적에 도달하기 위해 결합 될 필요가있을 것이다. 더 큰 볼륨의 경우 (50 ml)을 더 정교한 장치가 사용되는 서스펜션은 압축 가스를 이용하여 폴리 카보네이트 막을 통해 강제된다. 설정 및 압출 조건에 따라 모드 변경엘. 사용하기 전에 제조업체의 지침을 참조하십시오. 이 프로토콜은 작은 볼륨에 대한 설명서를 압출기를 의미한다. </li><li> 압출기를 통해 물을 통과시켜 물에 압출기 평형. 물 속에서 막 빠져. </li><li> 두 개의 피스톤 사이에 막 배치 장치를 조립 한 주사기로부터 다른 압출기​​를 통해 버퍼를 통과시킴으로써, 평형 완충액. 이 단계는 추가적으로 시스템 leakiness 테스트를 허용한다. 이 묻은 경우, 분해하고 다시 멤브레인을 변경 재 조립. </li><li> 압출기의 하나 주사기 ( &#39;더러운면을&#39;)를 사용하여 지질 서스펜션을 가져 가라. </li><li> 하나의 챔버에 지질 서스펜션과 반대 실의 빈 주사기가 들어있는 주사기를 연결합니다. </li><li> 한쪽 끝에서 주사기를 밀어 넣습니다. 막 통해 반대 주사기에 솔루션을 전달합니다. 이것은 1 차 패스입니다. </li><li> 31 회 등 총 멤브레인 통해 합격이 솔루션은 반대 주사기 ( &#39;깨끗한 편&#39;)에 끝나는 것을. 참고 : 압출 후 멤브레인을 확인합니다. 이 파손 되었다면, 압출 공정은 성공적이지 반복 될 필요가있다. </li><li> 작은 튜브에 주사기를 비 웁니다. 4 ℃에서 보관하는 경우 큰 단일 층 소포 (LUVs)는 1~2일에 대한 안정적이다. </li></ol></li></ol></li><li> 운모 및 Coverslips는의 준비 <ol><li> 세척은 에탄올에 먼저 물에 다음 된 커버. 공기 건조. </li><li> 운모 디스크를 취하여 접착 테이프를 사용하여 외부 층을 벗겨. </li><li> 커버 슬립에 운모 디스크를 연결합니다. 하나는 형광 현미경으로 이중층을 확인할 수 있도록 투명한 광학 접착제는 최적이다. </li><li> 광학 접착제 / 그리스를 사용하여 플라스틱 실린더 (2.5 cm 외경, 2cm 내부 직경 0.5 cm의 높이)를 연결합니다. 모든 밀봉되어 있고 누수가 없는지 확인합니다. 이들은 쉽게 번째로부터 분리 될 수있는 실린더를 다시 사용하고자 할 때 그리스를 사용전자 coverslip에 세척. 플라스틱 실린더 사이즈 AFM 캔틸레버 홀더의 크기에 의존하고 그에 따라 조정되어야한다. </li></ol></li><li> 고체 지지체에 단일 층 소포의 증착 <ol><li> 피펫 운모에 직접 전체 리포좀 솔루션입니다. 300 μL의 볼륨에 도달하기 위해 더 많은 SLB 버퍼를 추가합니다. </li><li> 3 mM의 칼슘 이온의 최종 농도에 도달하기 위해 1 M 염화칼슘 용액 0.9 μL를 추가한다. </li><li> 2 분 후, 적어도 10 분 동안 65 ° C에서 37 ° C에서 인큐베이션. 항상 버퍼 이중층 커버. 공기와 공기 거품 연락을 파괴 할 것이다. 필요한 경우 배양하는 동안, 높은 온도에서 배양 특히, 더 많은 버퍼를 추가합니다. 참고 : 배양 온도가 필요한 지질 혼합물 및 단계에 따라 다릅니다. 적어도 10 분의 배양 시간은 지원 이중층을 형성 할 필요가 있지만, 온도 및 조성에 따라, 이상이 될 수있다. </li><li> 빨래고온 (65 ℃에서)와 이중층 SLB 버퍼 15 ~ 20 시간은 칼슘과 융합 소포를 제거합니다. 버퍼에서 이중층을 유지하기 위해 세척 단계에서 좀 더주의를 기울여 부드럽게 이중층을 파괴 방지하기 위해 세척 용액을 피펫. </li><li> AFM 측정 전에 실온으로 냉각 지원 이중층. 이는 멤브레인의 상이한 위상을 형성뿐만 아니라 기기의 열적 드리프트를 최소화 할 필요가있다. </li></ol></li></ol> 2. 원자 힘 현미경 측정 (11, 12) <ol><li> 영상 참고 : 접촉 모드 또는 모드를 도청에서 원자 힘 현미경 이미징을 수행합니다. 솔루션의 이미지 지원 이중층; 이 이중층을 파괴하므로 용액이 완전히 증발 할 수 없습니다. 하나의 버퍼로 작동 될 때, 어떤 AFM 부분은 액체 유출로부터 보호되어 있는지 확인하기에 안전주의 사항을 준수하십시오. <ol><li> 부드러운 캔틸레버를 선택 (0.2 N / M의 스프링 상수가 좋습니다 이하) 및 T로 마운트그는 AFM. 캔틸레버의 강성 력 선택 분광법 더 중요하다 (이는 나중에 설명 될 것이다). </li><li> AFM 무대에서 샘플을 마운트하고 모든 진동 절연 모듈이 켜져 있는지 확인하십시오. 평형 시스템의 온도 편차를 줄이기 위해 최소 15 분 동안 기다립니다. AFM 세트 업에 따라, 조정 및 이미징 사양이 다를 수 있습니다. 제조업체의 지침서를 참조하십시오. </li><li> 접촉까지 AFM 팁과 샘플을 접근. </li><li> 지질 이중층은 일반적으로 높이가 4 나노 미터이기 때문에, (예 : 1.5 μm의 경우) 가장 높은 Z-해상도를 제공합니다 악기의 Z 범위를 사용합니다. </li><li> 이미지 영역을 선택합니다. 지질 이중층의 개요, × 25 μm의 지역 이미지에 좋은 출발점이 될 것입니다 50 μm의 × 50 μm의 25 μm의를 얻으려면. 작은 기능이 들어 오면 작은 영역에서 하나의 캔 이미지 (10 μm의 × 10 μm의, 또는 2 μm의 × 2 μm의). 촬상 영역의 선택은 또한 작업 R에 의존압전 스캐너의 플랜지. 이 용 장비 설명서를 참조하시기 바랍니다. </li><li> 이중층 매우 깨지기대로, 샘플과의 접촉을 유지하면서, 열 드리프트 최소 힘 및 정확한 영상을 유지하는 동안 AFM 팁의 세트 포인트를 조절한다. 접촉 모드에서, 세트 포인트를 최소화한다. 탭핑 모드에서, 상기 세트 포인트를 최대화. </li><li> 다항식 레벨링 기능에 대한 각각의 스캔 라인 피팅으로 프로세스 이미지. AFM 제조 회사의 전용 소프트웨어를 사용하여 막과 접촉을 잃는 스캔 라인에 대해 제거를 수행한다. </li></ol></li><li> 힘 분광학 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 지침에 따라 캔틸레버를 보정합니다. 교정은 포토 다이오드 힘 (그림 1B)의 전기 신호의 변환을 할 수 있습니다. <ol><li> 볼트의 팁의 감도 (길이의 단위) Z-압전 운동으로 변형을 측정하는 대신에 전기 신호를 보정합니다. <bR /&gt; 주 : AFM은 레이저를 이용하여 캔틸레버의 변형의 변화는 캔틸레버의 배면에서 반사를 검출한다. 레이저는 공간적으로 레이저 스폿의 위치를​​ 검출 할 수있는 포토 다이오드에 도달한다. 이 시료와 접촉시 굽혀 같이 캔틸레버의 휨의 변화는 &quot;수직 편향&quot;등이 포토 다이오드에 의해 검출되고, 이는 전압의 단위이다. 캔틸레버가 Z-피에조 의해 이동되기 때문에, 수직 편향은 Z-피에조에서 운동에 관한 것이다. 수직 편향 및 z-운동의 비율은 감도라는 거리에 전압을 변환한다. </li><li> 일반적으로 AFM 소프트웨어에 통합 열 잡음 주파수 방식을 사용 캔틸레버 스프링 상수를 계산한다. 이 방법에서, 전력 스펙트럼 밀도 플롯을 생성 발진 주파수에 따른 소음 진동의 진폭을 플롯. 이 그래프는 공진 주파수 주변의 피크를 보여줍니다. 여기서 주파수 진폭 I큰 s의 것은 공진 주파수이다. 소프트웨어에 의해 자동으로 스프링 정수를 산출하는 피크 주위 로렌츠 함수를 장착한다. 열 잡음 방법의 이론에 대한 몇 가지 유용한 리소스를 참조 27-30에 나와있다. </li></ol></li><li> 이중층의 영역을 묘화 한 후, 힘 분광법을 수행하는 이중층으로는 5㎛ × 5 ㎛의 영역을 선택한다. </li><li> 그것은 그 지역의 16 × 16 격자에 힘 곡선을 취하도록 AFM을 설정합니다. 이 지역 당 256 힘 곡선을 초래한다. 이웃하는 두 점 사이의 공간은 막 면적은 다음 점과 일치 한 것 포인트 프로빙되는 것을 방지하기에 충분해야한다. 이 팁 반경에 따라 달라집니다. 두 점 사이의 100 nm의 거리가 이상적 일 것이다. 16 × 16 격자에 5 μm의 X 5 μm의 영역을 나눈다. 위상의 크기에 따라 하나 또는 더 작은 영역을 선택하고 그에 따라 격자 크기를 조정할 수있다. </li><li> 로 설정 Z-압전 변위400 nm의. 이 Z-피에조의 움직임의 최대 범위를 결정합니다. 그것은 캔틸레버가 완전히 측정 사이에 샘플에서 멀리 후퇴 있는지 확인하기 위해 충분히 커야한다. </li><li> 800 나노 미터 / 초에 접근 속도를 설정하고 200 nm의 / 초의 속도를 철회. 이중층 조성 및 지질 상 -6,16-를 공부하기에 따라 6,000 나노 미터 / 초 400 사이의 접근 속도를 사용합니다. </li><li> 모든 파라미터를 설정 한 후, AFM 소프트웨어의 &quot;실행&quot;버튼을 누르면, 힘 곡선을 취득. </li><li> 신장 곡선 대 세력으로 힘 곡선 (Z-피에조 이동 계수)를 저장한다. 이 때 시료와 접촉 계정에 캔틸레버의 굽힘을지지 않습니다. 데이터 처리 단계에서, 소프트웨어는 AFM 이중층 두께에 대한 적절한 값을 제공 할 것이다 팁 - 샘플 분리 곡선 (도 1C), 대 힘을 얻기 위해, 캔틸레버 벤딩에 대한 보정을 허용한다. 보정 값은 일반적으로 캘리 브레이션에 인용각각의 힘 곡선과 함께 저장됩니다 ATION. 주어진 지점에서 압전 운동에서 수직 편향을 뺀 팁 샘플 분리를 계산합니다. 주 : 접근 력 곡선 피크 (력 수치 아래 캔틸레버 운동 방식주기 정지하더라도 간다) 멤브레인의 침투 력 인 반면,이 피크의 위치와 시점의 위치의 차이 힘이 위로 상승하기 시작 위치를 다시 막의 두께를 제공한다. </li><li> 좋은 통계를 얻기 위해 각각의 조건에 대해 최소 500 힘 곡선을 획득. 기원 또는 매트랩 같은 프로그램을 이용하여 값의 히스토그램을 플롯 및 분포의 피크 폭을 얻기 위해 가우시안 분포 히스토그램을 장착한다. </li></ol></li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+future+of+scanning+probe+microscopy:+Combining+atomic+force+microscopy+with+other+surface-sensitive+techniques,+optical+microscopy+and+fluorescence+techniques.">The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques.</a> Nanoscale. 1, 40-49 (2009).</li><li>Simons, K., Vaz, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+Systems,+Lipid+Rafts,+and+Cell+Membranes1.">Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1.</a> Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).</li><li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafts+defined:+a+report+on+the+Keystone+symposium+on+lipid+rafts+and+cell+function.">Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function.</a> The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).</li><li>Kahya, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Lipid+Mobility+of+Raft-exhibiting+Model+Membranes+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy.">Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome:+classification,+preparation+and+applications.">Liposome: classification, preparation and applications.</a> Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).</li><li>Butt, H. -. J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+thermal+noise+in+atomic+force+microscopy.">Calculation of thermal noise in atomic force microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li><li>Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids.">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).</li><li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).</li><li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).</li><li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging.">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li><li>Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides.">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li><li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration.">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li><li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes.">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li><li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration.">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li><li>Rigaud, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

DOPC 이루어지는 SLB 수 : SM : Chol을 (2 : 2 : 1) 염화 칼슘에 의한 소포 ​​흡착 및 파열 후에 운모 상에 형성 하였다. 이 지질 조성물 L D와 L 오 상으로 분리 하였다. L 오 단계는 스 핑고 마이 엘린과 콜레스테롤이 풍부한과 L의 D 단계 (11)보다 적은 유체 / 점성 (그림 1A)이다. L의 D 단계에서 L 오의 분리 주변 (그림 1B, C) ?...

원자 힘 현미경 (AFM)은 매우 날카로운 팁 (1)과 캔틸레버를 사용하여 샘플의 영역에 걸쳐 주사함으로써 표면의 화상을 생성한다. 캔틸레버의 이동은 시료의 표면 토폴로지를 프로빙. 액체 2-5에 공기 또는 거의 원시 상태에서 고정 된 샘플을 분석하는 그 다양성 때문에, 단백질, DNA와 세포막을 포함하여 - AFM 널리 생체 분자에 적용되었습니다. 외에 나노 미터 범위에서의 고해상도 영상화 능력에서, AFM 캔틸레버는 작용 힘 (부착 및 반발력) 및 샘플 5,6의 기계적 특성을 조사하기 위해 스프링 역할을한다. 이것은 힘 분광법으로 알려져있다. 이 모드에서, 프로브는 먼저 샘플 (도 1a)과 접촉을 상실 할 때까지 후퇴되고, 시료에 접근하고 그것에 힘을 발휘한다. 생성 된 곡선은 앱 모두 캔틸레버의 거리의 함수로서 힘을 보여바퀴벌레과 후퇴. 탄성률 등 여러 가지 특성은 재료의 강성을 측정하고, 접착력이 유도 될 수있다. 지원 지질 이중층은 고체 지지체 위에 누워 생물학적 모델 막이다 - 보통 운모, 붕 규산염 유리, 용융 실리카, 또는 실리콘 산화 7. 이들은 소포 증착과 같은 다양한 기술을 사용하여 제조되며, 랭 뮤어 - 블로 젯 방법 및 8,9 스핀 코팅. AFM 영상이 지원 이중층 (10)의 형성을 수행하고, 상이한 조성 11-15의 멤브레인에 의해 형성된 상이한 구조를 조사하기 위해 사용되었다. 접근 곡선의 피크에서 지원 이중층 결과에 힘 분광법을 수행. 이 피크는 이중층을 관통하기 위해 필요한 힘을 나타내고, 획기적인 힘이라고 부른다. 이중층의 두께는도 6 힘 곡선을 사용하여 측정 될 수있다. 이중층의 전형적인 획기적인 힘1-50 사이의 범위 윈 6. 이러한 특성은 지질 포장 (액체 또는 젤 상)과 구조 (아실 체인 길이와 불포화도)과 막 활성제 (16)에 의해 변경에 따라 달라집니다. 파열 배후 이론은 17을 설명했지만 이러한 캔틸레버 부드러움, 팁 반경 및 접근 속도와 같은 다른 변수는 실험 15, 16, 18 획기적인 힘에 영향을 미친다. 포스 분광법은 막 (21)의 안정성, 다른 지질 상 11,19, 펩티드 등 조성 의존성 12,20 변화뿐만 아니라, 다른 생 분자의 효과의 특성을 분석하기 위해 사용되어왔다. 지원 이중층의 평면 방향은보다 구조 및 막의 성질을 특성화하기 위해 이러한 표면 플라즈몬 공명 (22) 및 형광 현미경 11,19 같은 다른 방법으로 결합 AFM 유리하다. 이 자세한 영상 프로토COL은 소포 증착을 사용하여 지원 된 지질 이중층을 준비하고 AFM 힘 분광기로 분석하도록 구성된다. 다양한 크기의 소포는 이중층을 제조하는데 사용될 수 있지만,이 프로토콜은 소형 및 대형 단층 라멜라 소포에 초점을 맞춘다. 상 액체 주문 (패 O) 및 액체 무질서 (패 D) 단계로 분리 지원 이중층은 11, 15을 특징으로했다. 2 : 1의 비율로 막 2에 디 - 올레 일 포스파티딜콜린 (DOPC), 스 핑고 미엘린 (SM), 및 콜레스테롤 (Chol을)로 구성된다. 이 구성 모델 단백질 인신 매매 및 정렬, 세포 신호 및 다른 세포 과정 (23, 24)에 대한 중요한 플랫폼으로 작동하도록 제안 지질 뗏목,.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850375P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>860062P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C.&#160; For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>700000P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C.&#160; For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl), 99.8%</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl), 88%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), &#62;99%</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, molecular biology grade</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, 24x60 mm, 1mm thickness</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>2355036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica blocks</td>
			<td>NSC Mica Exports Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.&#160; Always handle mica with gloves or tweezers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch and Die Set</td>
			<td>Precision Brand Products, Inc</td>
			<td>40105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA 88</td>
			<td>Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Equipment Grease</td>
			<td>Borer Chemie AG</td>
			<td>Glisseal N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome Extruder</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>LiposoFast-Basic</td>
			<td>As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Bandelin Sonorex Digitec</td>
			<td>DT-31</td>
			<td>No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Nitride AFM Cantilever&#160;</td>
			<td>Bruker AFM Probes</td>
			<td>DNP-10</td>
			<td>Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>JPK</td>
			<td>JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

DOPC 이루어지는 지원 지질 이중층 : SM : Chol을 (2 : 2 : 1) AFM 이미지화 하였다 (도 2 AC). 때문에 지질 조성물, SM / Chol을 풍부 L의 O 및 DOPC 풍부한 L d 개의 상을 관찰 하였다. AFM 영상에서 높이 프로파일은 막 구조에 대한 중요한 정보를 제공 할 수있다. 높이 프로파일을 조사하여 이중층 두께를 제공 할 수있는 막 (도 2b) 또는 L의 O / L의 d 개의 상...

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Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.5K 조회수.  Interfaculty Institute for Biochemistry. We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

원자 힘 현미경에 의해 영상에 대한 세균 고정

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

연구

생체공학

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

원자 힘 현미경을 사용하여 재조합 DNA와 단백질 단지의 시각화

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

루게릭 병에 TDP-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 Biopanning

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

레퍼런스 프리 견인력 현미경 플랫폼 제작 및 구현

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

조기 골관절염을 검출하기 위한 원자력 현미경 검사법 적용

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...