Name: single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers
Uploaded: 2015-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers at JoVE.com

석사 재정 및 행정 지원을위한 오스트리아 과학 기금 (FWF, J3086-B11) 및 감사의 슈뢰딩거의 교제 막스 플랑크 협회에 의해 지원되었다. GS는 비엔나 과학 기술 기금 (WWTF, LS13-030)에 의해 지원되었다. JH 비엔나 과학 기술 기금 (WWTF, LS14-031)에 의해 지원되었다.

1. 생성 및 평면 SLB 수의 기능화 <ol><li> 지질의 혼합 <ol><li> 10 %의 Ni-NTA DGS / 90 % POPC 지질 조성에 도달하도록하는 250 mL의 둥근 바닥 플라스크에 클로로포름 POPC와 6.9 mg의 DGS의 Ni-NTA 45 mg을 용해. 다음 단계에서 클로로포름을 증발시켜 낮은 (단지 몇 ㎖)의 부피를 유지한다. 1 % DGS NTA - 니켈 / 99 % POPC 지질 조성물 49.5 mg을 POPC 및 0.69 mg의 DGS NTA - 니켈을 사용합니다. </li><li> 천천히 회전 증발기를 사용하여 클로로포름을 제거 - 주위 온도 이상 증가하는 것은 필요하지 않다. 대안 적으로, 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 기체의 스트림으로 화학 후드 안쪽을 날려. 이러는 동안 끊임없이 둥근 바닥 플라스크의 하반부에 건조 된 지질의 동등한 증착을 허용하도록 회전 플라스크. </li><li> 클로로포름의 대부분이 증발되면, 정량적으로 클로로포름을 제거하는 O / N 진공 플라스크를 연결합니다. 참고 :이 단계는 오염을 방지하는 것이 중요합니다나중 단계에서 독성 클로로포름으로 단백질과 세포의 지질 이중층 유동성을 보장합니다. </li></ol></li><li> 건조 지질에서 작은 단일 층 소포 (SUV의)의 생성 주 : 소형 단일 층 소포 (SUV 차량)는 직경이 20 nm 내지 100 nm의 사이에 용이하게 목욕 초음파에 의해 제조 할 수있다. 지질 압출, 대안적인 방법은, 압출 성형에 적용하는 필터의 세공 크기에 따라 SUV 차량을 야기 할 수 있으며, 또한 큰 단일 층 소포 (LUVs), 크기가 100 내지 1,000 nm의 어느. 그러나, 포드 SUV는 SLB 수 형성에 가장 적합하다. <ol><li> 목욕을 통해 초음파 SUV 차량 (비디오에 도시) : <ol><li> Degass PBS. 10 ㎖ 둥근 바닥 플라스크를 PBS 탈기 250ml를 건조 지질 혼합물을 중지. </li><li> , 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 가스로 채워 플라스크 마개를 닫은 후, 오토 클레이브 테이프 플라스크를 밀봉. </li><li> 목욕 초음파기로 밀봉 된 플라스크를 놓고 지질 현탁액을 초음파 처리T (120) 170 W로는 일반 설정 될 때까지. 이 30 사이에 60 분 소요됩니다. </li><li> 소포 형성 분광 광도 측정의 진행 상황을 모니터 : PBS에 비해 희석 유제의 흡수 (지질 농도에 대한 대략적인 지표로서) 234 nm에서 일정하게 유지하면서도 인해 비아 감소 빛 산란 (550 nm에서 현저히 떨어질 것을 찾다 큰 입자). </li><li> 연속 SLB의 형성을 방해 무거운 아닌 단일 층 소포를, 펠릿, 288,000 XG, 4 ℃에서 8 시간 동안 물을 25 ℃에서 1 시간 동안 150,000 XG에서 원심 분리에 의해 소포 현탁액을 펠릿. </li><li> 0.2 ㎛의 공경 주사기 필터를 통해 상청액을 필터. </li><li> 소포 제제의 명확성과 지질 좌측의 양을 모니터링하는 234 nm 내지 550 nm에서의 OD를 측정한다. </li><li> 아르곤 또는 질소 하에서 4 ° C에서 소포를 저장합니다. 선택적으로, 이중층 소포 제조 현탁액을 사용몇 개월. </li></ol></li><li> 지질 압출을 통해 포드 SUV : <ol><li> 요컨대, 0.1 ㎛의 세공 크기를 갖는 필터를 통해 지질 현탁액을 여러 번 통과한다. 에 관계없이 제조 방법의 두 번 소포 현탁액을 원심 분리 (1H, 150,000g, 25 ° C, 다음 8 시간, 4 ℃, 288,000g)을 무거워 아닌 단일 층 소포를 펠렛. 주 : 불활성 가스 하에서 4 ℃에서 저장 될 때, 소포는 수개월 이중층 제조에 사용될 수있다. </li></ol></li></ol></li><li> SLB의 형성과 단백질 충전 <ol><li> 30 분 동안 진한 황산 1 혼합물 30 % 과산화수소 : 3 24 X 50mm # 1.5 유리 슬라이드를 치료. 참고 : 비디오에서와 같이 혼합물의 적극적인 성격으로 인해 것은 특별한주의를 기울여야, 즉 실험실 코트와 안전 고글을 착용! </li><li> 물총 병에서 DDH 2 O의 스트림에서 유리 슬라이드를 씻어. 테프론 스탠드에 배치하고 건조하게10 ~ 30 분. </li><li> 8 또는 16 잘 챔버의 바닥 유리 슬라이드를 제거 에폭시 접착제로 바닥을 채우고 조심스럽게 접착제 덮인 실 바닥에 깨끗하고 건조한 유리 슬라이드를 놓습니다. 약 10 분 동안 경화 접착제를 보자. 바닥에서 여분의 접착제를 제거합니다. 주 : 유리 슬라이드와 챔버 사이의 기밀 밀봉은 또한 용이하게는 10 내지 30 분 이내에 경화 치과 이성 실리콘 모델링 페이스트의 사용에 의해 달성 될 수있다. 이 도장은 에폭시 접착제로 회사가 아니라 규칙적인 신체 부담을 견딜 수 있습니다. 실험 후 용이 미래 실험 후 재사용 챔버로부터 제거 될 수있다. </li><li> 8 (16)의 각 웰에 10 배 희석 PBS 지질 현탁액 120 μL 피펫 (60μl) - 20 분 동안하자 이중층 형태 (상기 기술 된 바와 같이 제조) 웰 챔버. 조심스럽게 15 ml의 PBS로 두 번 이중층을 씻어. 이중층이 형성되면, 그것은 항상 버퍼에 빠져들해야하며 공기에 노출되지 않습니다. </리&gt; <li> 330μl (8 웰 챔버) 또는 165μl (16 웰 챔버) 이륙 후, PBS로 각 웰 모든 방법을 채 웁니다. 잘 남아 350μl (175μl)가있다. 각 웰 (400 또는 200 μL 최종)에 PBS에 희석 그의 - 태그 단백질을 포함하는 칵테일의 50μl를 (25μL)을 추가하고 어둠 속에서 60 분 동안 실온에서 품어. 표면 단백질 농도는이 배양 단계 동안 단백질 농도를 변화시킴으로써 조절 될 수있다. </li><li> 15 ml의 PBS로 각 웰에 두 번을 씻어. 참고 : 일반적으로, SLB 수는 단백질과 충전 후 더 이상 6 시간 이상의 실험에 사용 될 수 없습니다. 이 기간 동안, 광표백 후 형광 복구는 95 %까지 유지하고 이중층 회합 단백질의 손실은 검출 될 수 없다. 단백질 밀도는 (아래 참조) 실험 이전에 결정되어야한다. </li><li> 옵션 단계 : SLB를 포함하는 단백질 DGS NTA - 니켈의 비 특이 적 결합을 테스트하기 위해, PBS 300 mM의 이미 다졸을 함유 한 번 SLB을 씻는다. 프로TEIN은 완전히 벗겨한다. </li></ol></li></ol> 2. 현미경 설정 <ol><li> 하나의 형광 색소의 형광을 검출 할 수있는 현미경 시스템을 구축하기위한 도입에 명시된 권고 사항을 참조하십시오. </li></ol> 3. 전력 측정 주 : 형광 발색단을 쉽게 초과 여기 광으로 포화 될 수있다. 이 방출에 더 이상의 이득 photobleaching에 가속화하고, 따라서 피해야한다. 여기 전력 밀도는 시료에서 직접적으로 측정되어야 샘플 조명을 최적화하기. 이러한 측정은 또한 미래의 실험에 대한 기준 역할을 할 수 있습니다. 광 이미징 시스템에서 손실된다 평가할 때 또한, 입력 및 출력 레이저 파워 사이의 비율을 아는 것은 유용하다. <ol><li> 이 90 ° 각도에서 대물 잎되도록 직립 위치로 여기 빔을 이동. </li><li> 상단 O의 전원 미터의 머리를 배치빔 F와 빔 (= P)의 힘을 측정한다. 결과를 문서화하십시오. </li><li> 잠망경을 사용하여 TIRF 위치와 이미지 그대로 균일 한 형광 이중층으로 빔을 켭니다. 감광 (ND)이 여기 광 경로로 2 내지 3의 광학 밀도 (OD)가 필터링 표백 및 CCD 신호의 포화를 피하기 위해 장소. <ol><li> 전체 조명 분야의 통합 계수 (= 나는 총)을 측정한다. 또한, 조명 영역 (= 총)의 크기를 측정한다. 통합 카운트를 측정 (= I 센터) 극대 조명 스폿의 중심뿐만 아니라 스폿의 크기는 (A 센터 =). </li></ol></li><li> 화소 당 배경 신호를 측정 (= B) 중 하나 또는 외부 조명 영역 샘플 조명없이. </li><li> 3. 측정 결과)로부터의 배경 신호를 뺀다. 배경으로 질문 (전체 조명 영역 또는 중앙 지점)의 영역의 픽셀 수를 곱하여이 작업을 수행픽셀 당 계산합니다. (- 총 .B을 나는 센터 - = 나는 총 센터 .B을). </li><li> 나누는 집적 및 배경 조명의 전체 필드의 통합 및 배경 보정 된 신호에 의해 중심 스폿의 신호를 보정. 참고 : 결과는 중앙 지점 (= (I 센터 - 센터 .B) / (내가 총 - 총 .B))에 위치한 총 전력의 비율을 나타냅니다. 빛이 중심 자리를 조명의 힘 2) 결과에서 측정 된 전력 P와이 결과의 곱셈. </li><li> 그 자리 μm²에서 센터의 크기를 결정합니다. 이 목적의 배율에 의해 μm의 카메라 화소 크기를 분할 들어, 픽셀 당 μm² 같은 결과의 제곱을 취. <ol><li> 대안 현미경에 배치 마이크로 슬라이드의 사용과 이미지 내의 픽셀 크기를 측정하고, 화소 당 면적으로서 결과의 제곱을 취. 배수iply 중앙 지점에 위치한 픽셀의 수에 의해이 값은 조명 스팟 지역에 도착합니다. </li></ol></li><li> 당 2 μm의 조명 세기를 계산하도록 μm², 중앙 센터의 스폿 크기가 중앙 지점을 조명 전력 P 나눈다. 예는 그림 6에 제시되어있다. </li><li> 비 TIRF 조명에서 측정 된 전력 밀도 값은 또한, 레이저 광이 전반사되는 정확한 각도에 의존하는 TIRF 조명 (13)에 존재하는 것과, 일반적으로보다 낮다. TIRF 조명 아래 현재 전력 밀도에 도달하기 위해, 이미지가 아닌 TIRF와 TIRF 모두 0.1 ㎛ 직경의 형광 구슬을 조정. TIRF 비 TIRF 모드로 측정 한 비드의 형광 강도의 비는 TIRF 조명 (수학 식 1)에 그 효과 하에서 측정 된 전력 밀도 값의 변환을 허용하는 변환 계수 C에 달한다. 전력 밀도 </eM&gt; TIRF = C • 전력 밀도 비 TIRF (식 1) C와 = 비드 강도 T IRF / 비드 강도 비 TIRF </li></ol> 4. 밀도 측정 <ol><li> 이중층에있는 각각의 형광체의 평균 신호를 결정합니다. 형광 펩타이드로드 이중층 부착 MHC 분자는 단백질 이후 이러한 목적을 위해 이상적입니다 : 레이블 화학 양론이 정확히 하나입니다. 필요한 표백제는 모든 시야에서 이중층에 라벨과는 형광 하나의 형광을 시각화하기 위해 복구 할 수 있도록합니다. <ol><li> 빠른 연속 기록 이미지 (예 : 스트리밍 획득 프로토콜을 적용) 및 여러 프레임에 걸쳐 단일 분자에게 이동성을 모니터링 할 수 있습니다. 자세한 내용은 그림 7을 참조하십시오. </li></ol></li><lI&gt; 마크 투자 수익 (ROI)과 이중층 내 중앙 조명 자리. ROI를 측정 (형광 강도에 비례한다), 조명 전력 밀도의 편차는 15 %보다 적이어야한다. <ol><li> 만이 투자 수익 (ROI) 내에서 단일 분자 및 대량 형광을 결정합니다. 단일 이미 터의 점 확산 함수의 99 % 이상을 포착하기에 충분히 큰 ROI의 신호를 통합하고있다. 16 ~ 20 ㎛의 화소 크기를 가진 카메라를 이용하는 경우 100 배의 배율과 동일하거나 또는 1.45보다 큰 개구 수를 가지는 대물 렌즈가 7 픽셀 (7)의 영역을, (제조사의 카메라 사양에 명시) 광장의 중심에 위치하고 강도 피크. </li><li> 배경 신호를 확인하려면 형광 신호를 포함하지 않는 이웃 (7) (7)에 의해 픽셀의 사각형의 수를 통합 할 수 있습니다. 단일 분자 불소위한 보정 값을 결정하기 위해 단일 ​​분자 신호로부터 배경 빼기escence. 여전히 다음 프레임에서 볼 수 있습니다 만 신호를 선택합니다. </li></ol></li><li> 수백 번 단계를 반복 4.2 오십. 배경 보정 신호를 평균. 원하는 경우, 히스토그램으로 단일 분자 세기 값을 플롯. 선택적 : 오픈 소스 소프트웨어 패키지의 적절한 플러그인 (예 ImageJ에)을 활용 또는 상업적 소프트웨어 (예 MetaMorph로부터, 분자 장치)를 사용하여 데이터를 처리한다. 숙련 된 사용자는 matlab에 또는 유사한 소프트웨어 패키지에서 자신의 분석 프로그램을 작성할 수 있습니다. </li><li> 여기 경로에 2 이상의 감광 필터를 놓고 동일한 형광 물질로 표지 된 단백질을 포함하는 이중층의 형광 화상을 받아. 단일 분자 세기 측정에 사용 된 것과 동일한 ROI 내의 평균 픽셀 강도를 기록한다. 벌크 형광 측정의 노출 시간을 기록한다. 배경 공제에 대한 조명없이 같은 자리를 측정한다. </li><li> BI 내의 단백질 농도를 결정층 평방 미크론 당 픽셀 (예 41.5), (100)에 의해 (2 OD와 ND 필터를 채용 한 경우) 또는 1,000의 수 (만약에 의해 단계 4에서 결정된 배경 보정 벌크 형광 평균 픽셀 강도를 곱 ND (3)의 OD와 필터 사용되었다)과 노광 시간이 2 단계에 사용하고, 단계 3에서 결정된 평균 단일 분자 신호로 나누면, 노광 시간이 2 단계에서 사용되는 단백질 당 형광체의 수. </li></ol> 5. 시험 이중층의 무결성 <ol><li> 형광 이중층을 준비하고 전술 한 바와 같이 현미경 스테이지에 배치합니다. </li><li> 초점을 조절하고 TIRF 모드에서 이중층의 이미지를 촬영. 작은 디스크 모양의 투자 수익 (ROI) 내에서 형광을 브레이션 비 TIRF 모드에서 짧지 만 강렬한 표백제 펄스를 적용합니다. </li><li> 즉시 표백 후 낮은 강도 TIRF 모드 이중층의 이미지를 촬영 한 후 매 5 초 10까지 형광 회복 속도를 모니터링. </li><li> 모이중층의 다른 영역으로했습니다 단계 2와 3은 표백제 펄스 후 낮은 강도 TIRF 모드에서 5 분을 다른 이미지를 가지고 따릅니다. I는 표백제 영역에 표백제를 게시하고 다음 (IF) 부동 분획을 계산하도록 (더 표백이 발생하지 않은한다) 실험의 처음에 I 0 표백 이전 강도와 비교 강도를 판정 : 움직이지 분율 (%) = IF (I 0 - 나는 표백제를 게시) / (I 0 - 배경) × 100 배경 = 아니오 여기 광과 투자 수익 (ROI) 내에서 측정 된 강도 적용 IF는 10 % 이하 (이상적으로는 5 % 이하) 여야한다. </li></ol>

<ol>
	<li>Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do-it-yourself+guide:+how+to+use+the+modern+single-molecule+toolkit.">Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit.</a> Nat Methods. 5, 475-489 (2008).</li><li>Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+with+single+molecules.">Super-resolution fluorescence imaging with single molecules.</a> Current opinion in structural biology. 23, 778-787 (2013).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster.">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li><li>Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells.">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 104, 20296-20301 (2007).</li><li>Wilson, B. S., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Gaudet, E. A., Oliver, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+mapping+of+mast+cell+membranes+reveals+primary+and+secondary+domains+of+Fc(epsilon)RI+and+LAT.">High resolution mapping of mast cell membranes reveals primary and secondary domains of Fc(epsilon)RI and LAT.</a> The Journal of cell biology. 154, 645-658 (2001).</li><li>Lillemeier, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+and+Lat+are+expressed+on+separate+protein+islands+on+T+cell+membranes+and+concatenate+during+activation.">TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation.</a> Nat Immunol. 11, 90-96 (2010).</li><li>Woof, J. M., Burton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody-Fc+receptor+interactions+illuminated+by+crystal+structures.">Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures.</a> Nature reviews. Immunology. 4, 89-99 (2004).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7:+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods in cell biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Un)confined+diffusion+of+CD59+in+the+plasma+membrane+determined+by+high-resolution+single+molecule+microscopy.">(Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy.</a> Biophys J. 92, 3719-3728 (2007).</li><li>Huang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+nanoscopy+using+sCMOS+camera-specific+single-molecule+localization+algorithms.">Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms.</a> Nat Methods. 10, 653-658 (2013).</li><li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys J. 16, 1055-1069 (1976).</li><li>Axelrod, D., Burghardt, T. P., Thompson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence.">Total Internal Reflection Fluorescence.</a> Ann. Rev. Biophys. Bioeng.. 13, 247-268 (1984).</li><li>Huse, M., Quann, E. J., Shouts Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whispers+and+the+kiss+of+death:+directional+secretion+in+T+cells.">Whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells.</a> Nat Immunol. 9, 1105-1111 (2008).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3, 793-795 (2006).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+ligation+induces+the+formation+of+dynamically+regulated+signaling+assemblies.">T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies.</a> J Cell Biol. 158, 1263-1275 (2002).</li><li>Sherman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+nanoscale+organization+of+signaling+molecules+downstream+of+the+T+cell+antigen+receptor.">Functional nanoscale organization of signaling molecules downstream of the T cell antigen receptor.</a> Immunity. 35, 705-720 (2011).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li><li>Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+TCR-pMHC+binding+using+a+FRET-based+microscopy+assay.">Measuring TCR-pMHC binding using a FRET-based microscopy assay.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Lillemeier, B. F., Schuetz, G. J., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane-associated+proteins+are+clustered+into+islands+attached+to+the+cytoskeleton.">Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 103, 18992-18997 (2006).</li><li>Natkanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+use+mechanical+energy+to+discriminate+antigen+affinities.">B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities.</a> Science. 340, 1587-1590 (2013).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금융 관심이 없다는 것을 선언합니다.

단일 분자 현미경은 원시 세포 환경 내에서 단백질의 행동을 연구하는 독특한 기회를 제공합니다. 분자 영상은 광범위한 과학계에 따라서 점점 더 매력적인되고, 아직 많은 생명 과학자는 여전히 멀리 기술과 전문 지식의 초기 투자 기피. 자신의 이미징 시스템의 조립으로 인한 주요 장점은 용이하게 사람의 특정 필요로 조절 될 수 있다는 것이다. 본 명세서에 제안 된 것과 같은 비 TIRF 여기 빔 쉽게 기존 TIRF 광로 이외에 구현 될 수 있고, 형광 물질과 리간드의 신속하고 정의 포토 블리치 (또는 -activation)가 필요한 경우, 예를 수행하는 FRAP 또는 리간드 uncaging 실험 14 . 방사 빔 스플리터의 도입은 적어도 2 개의 동시 녹화 및 형광 네 개 채널 일부 경우에 허용한다. 확장 기능의 목록은에 의해 제한 본질에자신의 상상력. 예를 들어, 배출 경로에 전동식 발광 필터 휠 구현은 최대 10 개의 서로 다른 형광 채널 간의 신속한 스위칭을 허용한다. 두 모터 발광 필터 휠 (18)을 조합 한 경우의 형광 채널을 판독 할 수 있고, 직렬로 (각 10 슬롯 필터 장착). TIRF 기반 이미징은 칼슘 이동 측정 및 제논 또는 수성 여기 램프 경로의 통합 후 간섭 반사 현미경 (IRM)로 보완 할 수있다. IRM은 세포가 유리 표면 또는 SLB 부착되고 TIRF 기반 이미징 데이터를 해석 할 때, 따라서 중요한 정보를 제공 할 수있는 정도를 시각화하는 선택 방법이다. 간단한 다이크로 익 미러를 사용하고 photoactivati​​on 현지화 현미경 (PALM) 또는 확률 적 광학 재구성 현미경 (STORM)를 도통 허용 내지 405의 추가 레이저, 즉 두 superresolut으로 넓어진 여기 빔을 수립가시 광선 (15, 16)의 회절 한계 이하의 위치 정밀도와 이온 방법. 그러나, 실험의 성공뿐만 아니라 해당 하드웨어의 문제이다. 잡음 감소 TIRF 기반 이미징을 충분히 활용하기 위해, 세포는 세포 표면 상에 제약을 부과 또는 그들의 세포막의 생리를 방해하지 않는 방식으로 표면에 접촉한다. SLB 수는 모든 SLB 매립 리간드 측 방향 이동과 결합하고 분리 역학 수용체에 응답하여 이중층 내에서 횡 방향 위치를 조정하기 때문에 세포 접착에 적합한 단백질은 이러한 목적에 적합 초과되는 작용 화. 재생 가능한 방식으로 SLB 수를 제조하기 위해서는 고순도의 SUV 차량으로 시작하는 것이 가장 좋습니다. 본원에 기재된 바와 같이, 이들 두 I로서 초 원심 분리 단계에서, 또한, 초음파 처리시에 발생되는 다중 층 소포를 제거하는 것이 중요높은 유동성을 갖춘 연속 SLB 수의 형성과 nterfere. 깨끗한 유리 표면에 고품질의 형태의 SLB 수. 한번 세정 된 유리 슬라이드를 즉시 사용 또는 진공에 저장되어야한다. 중요한 것은, SLB 수는 혼란으로 이어질 것이로 공기에 노출해서는 안됩니다. SLB 세척 이것이 저장할뿐만 아니라, 시간을 절약 할뿐만 아니라 절차로서, 버퍼 혈청 피펫을 사용하여 세정, 도시 된 바와 같이, 포함한다. SLB 상주 단백질 수확 및 정제 동안 세제의 사용은 피해야한다. 이는 세제 때에도 본 미량 크게 단백질의 이동성을 감소시킬 것이기 때문이다. 모두 함께 세제의 필요성을 회피하기 위해 분비되는 폴리 히스티딘 태그 장착 된 리간드의 수용성 발현은 포유 동물 또는 곤충 세포에 좋습니다. 대장균 봉입체로부터 폴딩 것이 필요한 경우주의 및 그 계량 대 폴딩 전에 봉입체로부터 효과적으로 세제를 제거하기 위해 적용되어야. 구체적으로는 세포 활성화 및 세포 유착에 대한 주어진 수용체 - 리간드 상호 작용의 역할을 절개 할 수 있도록 모듈화 및 reconstitutive 사이트, SLB 수로부터 결과를 이용하는 주요 장점. 이 점에있어서 그 DGS NTA-ni는 NI-NTA 결합 부위에 대해 경쟁하는 단백질을 방지하기 위해 SLB 내의 10 % 존재한다라고 언급하는 것은 중요하다. 1 % 2 % DGS NTA - 니켈, 주어진 폴리 히스티딘 - 태그 된 단백질 종의 협회의 감소를 은닉 SLB 수를 이용하는 경우 미발표 (특히 초 폴리 히스티딘 태그가 부착 된 단백질 종의 양을 증가 공동 배양하면 알 수있다 관찰). 10 % DGS NTA - 니켈을 갖춘 SLB 수로 작업 할 때 이러한 현상은 관찰되지 않는다. 우리가 DGS NTA - 니켈을 함유 SLB 수 테스트 폴리 히스티딘 태그가 어떤 단백질의 비특이적 결합이 관찰되지 못한 반면 처음 단백질을 도입 할 때,이 가능성을 테스트해야이를 위해 우리는 DGS NTA - 니켈 (단백질이 결합 안)없는 SLB 수의 사용을 권장합니다. DGS의 Ni-NTA를 함유 SLB를 사용하는 경우 둘째, 단백질은 PBS 300 mM의 이미 다졸을 함유하는 SLB 세척 후 완전히 이탈한다. SLB 수를 이용하는 또 다른 중요한 장점은 과도 상호 작용 및 신호 전달 사건이 향상된 시공간 해상도 17-19 모니터링 할 수 있다는 점이다. 입체 결합 공정은 본질적으로 특히 잡음 감쇄 TIRF 모드로 촬영을 할 때, 두 영상 사이즈로 축소되기 때문 적어도 일부이다. SLB 수의 사용은 단일 분자 신호 검출, 광 활성화 지역화 현미경 (PALM) 또는 확률 적 광학 재구성 ​​현미경 (STORM)의 전제 조건, 회절 한계 15,16 아래 해상도 즉 수퍼 해상도 현미경과 호환 가능하다. 이러한 특수 영상 방식은 단일 분자 포스터 공명 에너지 트라 가능nsfer 실험 시냅스 환경 (20)에서 개개의 단백질 - 단백질 상호 작용을 가시화하도록 설계. 이 방법은 &quot;측정 TCR-pMHC FRET 기반의 현미경 분석하여 결합&quot;(21)라고 조브 책에서 상당한 상세하게 설명한다. SLB 기반 실험을 해석 할 때 하나는 항상 살아있는 세포의 세포막의 모든 특성이 SLB 수에 의해 추천을 명심해야하며, 누락 된 특성의 일부는 조사중인 생리에 영향을 미칠 수있다. 결국, SLB-포함 된 단백질은 자유롭게 확산과 휴대 대응의 대부분은 5,6,22을 그대로 막 마이크로 도메인으로 구성되어 있지 않습니다. 어느 정도는 살아있는 세포의 세포막 구조를 보존 부착 세포로부터 유도 된 세포막 고정화 시트는 성공적 B 림프구 (23)에 의해 막 - 삽입에서 항원 흡수를 연구하기 위해 사용되었다. 그러나, 이러한멤브레인은 매우 역동적 인 세포 골격과 상호 작용하고 그들이 단단한 유리 표면에 의해 지원되는 어떠한 유연성을 특징으로하지 않습니다. 이러한 차이의 관점에서 조정 유연성의 표면 또는 로컬로 적용되는 광 펄스에 대한 응답으로 자신의 강성을 변경 표면에 의해 지원되는 정의 된 방식으로 단백질을 구획하는 수단을 제공하고 엔지니어링 SLB 수, 대한 요구가 분명히 존재한다.

행동의 자신의 모드는 종종 기존의 생화학 적 방법에 의해 감지하고 평가하기 어려운 선호도가 낮은 상호 작용에 의해 정의되기 때문에 막 단백질들은 세포 기능을 수행하는 메커니즘을 이해하는 것은 종종 어려운 작업이 될 수 있습니다. 막 단백질은 또한 고도로 원칙적 그들의 생물학적 활성 (7)을 변경할 수 특정 멤브레인 도메인 또는 5,6- 동적 고차 구조를 형성하고, 농축 될 수있다. 비 침습적 레이저를 이용한 단일 분자 형광 현미경은 이렇게 복잡한 세포 환경에서 단백질의 행동을 연구하는 선택의 방법이되고있다. 이러한 원리는 잡음 감소 전체 내부 반사 (TIRF) 모드에서 모니터링 될 수있다 이것은 특히 세포막에서 일어나는 생화학 적 과정 마찬가지이다. 여기에 샘플 조명 유리 SU 가까이에서 200 nm의 얇은 조각에 최대로 제한됩니다또한 형광 신호 강도 8,9 상당한 증가에 의한 소멸 여기 광의 특성, 셀룰러 백그라운드에서 상당한 손실을 초래하고 rface. 단일 분자 검출에 높은 위치 및 시간 해상도를 목표로 할 때 두 가지 측면이 중요하다. 평면 SLB 수는 TIRF 현미경과 호환되지 않습니다. 적절한 리간드와 함께 작용 화하면 그들은 또한 면역 세포 또는 다른 세포에서 발생하는 세포 - 세포 인식 분자 역학 연구에 직접 액세스를 제공한다. 그들은 또한 단순히 세포 매우 바람직하다 TIRF 조명에 이미징 될 수 있도록 유리 슬라이드에 충분히 가까이 운동성 달리 비 부착 세포를 위치 시키는데 이용 될 수있을 때 하나의 분자 추적 또는 단일 분자 기반 수퍼 해상력 관련된 도통 실험. 이를 위해 단백질은 고도로 이동 SLB에로드되어야한다. 사용 된 리튬의 고유의 장점<html> PID를 전혀 단백질에는 비특이적 결합이 없다고한다. 또한, SLB 수는 자체 치유 고유 용량 이차원 액체로서 간주 될 수있다; 유리 지지체 내의 요철을 어느 정도까지 보상된다. 단계별로 단계 프로토콜은 관심의 단백질과 충전이 높은 모바일 이중층을 생성하기 위해 제공된다. 평면 SLB 수의 형성은 주성분 (90~99%)과 합성 1- 팔미 토일 -2- 올레 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 (POPC)를 포함하는, 기재 및 지질을 1,2- dioleoyl-을 관능 -glycero SN-3 - {[N (5- 아미노 -1- 카르복시) 이미 노디 아세트산] 숙시} 니켈 염 낮은 풍부 (1~10%)에서 (DGS NTA-NI). POPC 한 포화 지방산 모노 - 및 하나의 불포화 지방산을 수행하고 RT에서조차 높은 유동성의 지질 이중층을 형성한다. DGS NTA-NI는 폴리 히스티딘 꼬리에 그것의 헤드 그룹과 결합과 선택의 폴리 히스티딘 태그 단백질 (그림 1)에 대한 앵커 역할을합니다. &quot;&gt; 중요한 것은, 현미경 하드웨어가 제공하는 정보 및 광학 및 레이저 물리학 몇 가지 기본 지식을 바탕으로, 모든 생물은 하나의 분자 이미징 설정을 구축 할 수 있어야한다. 아래에 설명되어 주변의 수를 포함해야합니다. 샘플 여기 이상적으로해야한다 총 내부 반사 (TIRF) 모드에서 거꾸로 현미경에서 수행이 요법은이를 위해 특별 TIRF 지원 목적 (아래 참조). 가짜 가볍고 휴대 자동 형광 9 일부터, 그렇지 않으면 결과 과도한 배경을 줄이고 레이저 조명이 필요할 때. 일부 실험은 밀리 초 범위 내에서 조명 시간을 필요로하고 빠르게 연속적으로 동작한다. 조명 시간을 저장하거나 2 개 이상의 분광 채널들로 방출 된 광을 분할 종종 유용 반복적 조명으로 인한 불필요한 표백하지 않도록. 이것은 동시 판독을 허용 conduc 때 중요한 요소가 될 수있는 두 개 이상의 발광 프로파일의포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 포함 팅 실험. 여기서 하나의 여기 광 펄스에 의한 발광은 모두 FRET 도너로부터 기록 (감응 방출로) 수용체를 FRET 수있다. 카메라는 조명 시간 동안 하나의 형광을 시각화하기 위해 충분히 낮은 배경으로 충분한 광자를 포착해야한다. 컴퓨터 소프트웨어는 여기 종료 및 이미지 수집을 동기화하는 작업까지해야합니다. 포괄적 인 개요는 아래 그림 2에 제시되어있다 : TIRF 가능 목적 : 대물 기반 TIRF 조명용 대물의 개구 수 (NA)가 동일하거나 또는 표준 유리 슬라이드를 사용하여 1.4보다 커야한다 (N = 1.515) 9. 배율은 150 배에 60 배 사이의 범위 수 있습니다. 목적은 색채 다른 형광 이미징 때 confocality 수 있도록 수정해야합니다. 레이저 : 자료 LASE의 수R 옵션이 상당히 지난 년 동안 증가했다. 전자적으로 조절 가능한 현대 연속파 레이저 다이오드는 비용 효율적이고 전례 주파수 속도로 동작 될 수있다. 더 비싼 가스 이온 레이저는 레이저 빔 품질이 탁월하지만, 냉각 외부 셧 (아래 참조) 종종 광범위한 (물)이 필요합니다. 여기 셔터 : 음향 광학 변조기 (AOM)을 연속으로 빠르게 10 빠른 셧 할 수 있습니다. 꽉 기계적 셔터와 AOM의 조합을 종료하는 것이 좋습니다. 때문에 연속 빛 노출에 AOM의이 방법은 광범위한 가열 피할 및 오프 위치에서 AOM에서 새는 빛이 상쇄된다. 렌즈는 레이저 빔을 확대하고, 대물의 초점면에 그들을 집중하기 위해 사용된다. 이렇게하면, 여기 광은 TIRF의 조명에 필요한 평행 광속 (도 3)와 같은 목적을 남긴다샘플. 대물 렌즈의 외주에 중심으로부터 초점면 내에 초점을 이동하는 것은 상기 빔이 상기 대물 잎되는 각도를 변경하지만, 함수 시료에 레이저 스폿의 위치 (도 3),하지되는 것 전체 빔 형상. TIRF 조명은 대물 렌즈의 초점면 내에서의 레이저의 초점을 번역 할 잠망경로서 기능하는 거울들의 세트를 사용하여 조절 될 수 임계각에서 계속된다. 렌즈 색도 보정되어야하며 두 개 또는 3 개의 렌즈의 집합으로 사용될 수있다. 세 렌즈계 대물 (도 4)의 후 초점면으로 넓어진 광을 집중하는 레이저 빔 (따라서 시료에서의 조명 스폿) 및 제 3 렌즈를 넓히는 망원경 역할 개의 렌즈로 구성된다. 두 함수 (망원경 초점)도 두 개의 렌즈의 조합에 의해 달성 될 수있다 (도 4 참조). 거울은 레이저 광의 손실을 방지하기 위해 적어도 95 % 반사되어야한다. 두 거울들의 세트는 일반적으로 이러한 구성으로 적용되는 각 빔 조정을 정확하게 레이저 빔의 각도와 위치를 조정하기에 충분하다. 다이크로 익 오버레이 반영 및 다른 특정 파장의 빛을 전송 및 중첩 또는 두 개의 레이저 빔을 분할하는 데 사용됩니다. Polychroic 필터 이색 필터보다 더 복잡하고 수신 된 여기 광을 반사하고 표본으로부터 발광 광을 출사 전송하는데 필요하다. 이들은 목적 및 현미경 튜브 렌즈 사이 필터 큐브에 배치된다. 필터 청소 : 레이저 직원당 D 레이저의 종류에 따라서는 레이저 잎 직후 레이저 빔을 배치해야 좁은 전송 대역폭으로 필터를 청소. 노치 필터효과적으로 좁은 대역폭을 갖는 레이저 광을 흡수하고 다른 모든 광을 전송하도록 설계된다. 이들은 임의의 스퓨리어스 레이저 여기 광을 필터링 방출 경로 내에 배치된다. 그러나, 노치 필터는 0 ° 들어오는 각도에서만 작동합니다. 노치 필터의 밴드 폭이 매우 날카로운 경우, 상이한 수신 각도는 더 이상 반영되지 않을 수있다. 시준 된 레이저 레이저 광의 차단은 영향을받지 않고, 후방 산란 광을 효율적 카메라 도달 방해해서는 안된다. 비율 계량을위한 크세논이나 수은 아크 램프의 전면에 배치 할 때 적절한 필터 휠이 장착 동력 필터 휠은 쉽게 여기 및 방출 경로에 넣고 다른 빛의 강도 (ND 필터를 장착하는 경우) 또는 형광 채널 (사이의 간단한 전환을 허용 할 수있다 칼슘 이미징 또는 카메라 앞에서)는 발광 형광을 위해 선택합니다. 50:50 큐브 빔 스플리터 C두 개의 분리 된 여기 빔 경로에 레이저 빔을 분할하기 위해 사용될 수 있으며 잠망경 앞에 그들을 결합. 빔 스플리터 (배출 경로) : 물리적 필터 변경 필요없이 빠른 이미지 수집의 경우, 방출 빔은 이동 - 청색과 적색 편이 채널로 분할된다. 원칙적으로, 빔 스플리터는 웨지 또는 이색 거울들의 집합 및 파장 - 의존성 방식으로 방출 된 빔을 분리하기 위해 이색 거울을 이용하여 구축 할 수있다. 두 방출 필터는 방출 채널을 정리하는 데 필요하다. 공간 필터 : 여기 빔의 공간 필터링은 때때로 낮은 품질의 레이저 빔으로부터 방출 비평 행 광선을 제거하기 위해 필요하다. 공간 필터는 모두 렌즈의 초점 위치에 정확하게 배치 작은 핀홀이있는 2 망원경 렌즈로 구성된다. 레이저 빔의 평행하지 않은 부분에 의한 방법이 스퓨리어스 광은 효율적으로 차단된다. 스와TIRF 기반 현미경을 설정할 때 채널 조건이 충족되어야합니다. 초점으로하고, 제 1 렌즈의 초점 거리보다 작은 위치 시키도록 더 어려운 작은 핀홀과 공간적 필터링 증가. 렌즈 수차에 의한 영향을 줄이기 위해 대신 간단한 렌즈 저배율 (10 배 또는 20 배) 높은 품질과 무한 보정 현미경 목표를 사용하는 것이 유리하다. 잠망경 : 잠망경 설치 목적, TIRF 이미징을위한 전제 조건의 초점면에서 포커스 된 레이저 빔을 번역 할 필요가있다. 이는 용이하게 2 개의 2 인치 미러, 제 1 미러 및 넓히고 현미경에 여기 빔을 집중 (도 5)를 반영하기 위해 2 미러를 위치시키는 포스트를 조정하기위한 병진 스테이지로부터 구축 할 수있다. 카메라 : 후면 조명 전자 - 배가 전하 결합 장치 (EMCCD)는 일상적으로 사용됩니다단일 분자 신호의 기록. 이는 높은 양자 효율의 높은 취득 속도 (95 %까지) (최대 30 메가 헤르츠)와 비교적 낮은 소음입니다. -80 ℃까지 냉각하여 열 잡음을 감소시키고, 현재 EMCCD 카메라들에 의해지지된다. EMCCD 기술의 한계는 카메라 노이즈 카메라 이득 모두 선형으로 증가시키고, 신호가 포착되고 있다는 점이다. 이는 sCMOS 칩의 특별한 구조에 훨씬 빨리 EMCCD 카메라보다 훨씬 저렴하고 동작 과학적 CMOS (sCMOS) 카메라와 그렇지 않다. 각각의 픽셀은 서로 다른 검출 감도를 갖추고 있기 때문에 CMOS 기술과 관련된 문제, 즉 화상 취득이 여전히 단일 분자 수준에서 정량적 판독 어느 정도의 결여이다. 원칙적으로이 화소를 통해 정규화 보상 될 수 있지만,이 절차는 11 사소한 것은 아니다. 이것은 우리가 아직 다시 주저 이유단일 분자 현미경 sCMOS 카메라 칭찬하지만,이 기술의 급속한 발전에 비추어, sCMOS 카메라는 즉시 선택 될 수도 카메라. 느린 스캔 CCD 카메라 카메라는 모두 함께 증폭 및 관련 잡음 화소 분산을 방지하고 이들이 소위 &quot;운동&quot;모드에서 동작 할 수있는 경우 빠른 획득 속도를 지원한다. 이 모드는 관심 영역 (ROI)의 영역을 제외하고 전체 카메라 칩 가능 저장 장치로 칩 자체를 채용 할 수있는, 마스크된다. ROI가 처음으로 노출 된 후, 생성 된 전하를 상기 화상 노광으로부터 보호되는 픽셀 라인에 의해 칩 픽셀 라인의 마스킹 영역으로 시프트된다. 마스킹 영역에 ROI의 모든 라인의 시프 팅 (서브 밀리 초 범위 내에서)이 완료되면, ROI 자체는 다음의 노광을위한 준비이다. CCD 칩의 모든 화소 라인이 충전 될 때까지이 사이클을 반복한다. 이 칩은 크게 redu 천천히 판독CED 판독 잡음. 1000 X 1300 픽셀 칩에 예를 들어, 50 × 50 픽셀의 20 개의 ROI가 연속해서 기록 될 수있다. 화상이 판독되기 전에 상당한 시간 동안 칩 상에 남아 있기 때문에, 과도한 열 잡음을 감소시키는 수단으로서 (액체 질소 등) 고품질 마스킹을 보장하고 카메라를 냉각하는 것이 중요하다. 일부 EMCCD 카메라는 또한 운동 모드를 지원한다. 소프트웨어 : 레이저, 셔터, 버튼 확장 박스 (AOM) 및 카메라 노출의 타이밍뿐만 아니라 적절한 이미지 저장이 성공적인 영상 실험에 필수적이다. 원칙적으로 많은 정의 동작은 카메라와 함께 사용 가능한 소프트웨어 패키지를 사용하여 프로그래밍 될 수있다. 상용 소프트웨어 패키지는 작은 노하우 기술로 구현 될 수있는 하드웨어 주변의 큰 수를 지원한다. 펄스 발생기는 데이터 수집 (DAQ) (아날로그 및 디지털 출력 채널) 보드와 오실로스코프 : 펄스 발생기는탁월한 선택 정의 된 시간과 전압의 펄스에 트리거 펄스를 변환합니다. 이 방법 레이저는 정확하게 출력 전력에 대한 제어 및 서브 밀리 초 범위 밀리 초에서 시간이 초과 될 수있다. 아날로그 출력 보드와 DAQ는이를 쉽게 달성 PCI 슬롯을 통해 컴퓨터의 마더 보드에 통합된다. 펄스 지속 시간, 진폭과 주파수는 오실로스코프로 확인됩니다. 전체 여기 빔 경로의 인클로저 : 인해 전체 여기 빔 경로는 실험실 환경에서 감싸 야 공기 대류에 여진 프로파일의 변동을 방지 할 수 있습니다. TIRF 현미경을 수행 할 때이 법안은 특히 중요합니다. 광학 부품은 먼지와 레이저 광선에서 인간의 눈으로부터 보호됩니다. 인클로저 쉽게 예술 공급 상점에서 구입하실 수 있습니다 블랙 카드 보드에서 구축 할 수 있습니다. Photobleac 후 SLB 형광 복구의 유동성을 확인하려면힝 (FRAP) 측정 (12)가 수행된다. FRAP 두 여기 빔 경로의 존재는 (도 3 참조) 것이 바람직하다. 제 1 빔의 경로 상에 이중층의 형광을 설계된다. 이 TIRF 구성과 낮은 조명 강도로 수행 할 수 있습니다. 이 광축을 따라 대물 잎되도록 제 2 빔 경로는 짧지 만 강렬 표백제 펄스 허용되어야하고 비 TIRF 모드로 구성되어야한다. 둥근 구멍이 여기 빔 경로에 배치 될 수있다 정의 가장자리 동그란 표백제 프로파일을 돌출 (도 8 참조). 화상하기 위해 물체면에이 개구는, 최적의 위치는 (도 3 참조)를 렌즈 (3)의 초점면에있을 것. 개구가 약간 시프트 된 위치에 배치되는 경우에는,이 때문에 렌즈의 장 초점 거리로, 충분한 품질의 화상 개구도 생성 될 수있다. 수행 (T)를 한 후그 원시 데이터가 적절하게 해석되어야 실험 촬상. 여러 단계별 프로토콜 데이터를 수집하고 분석하기 기본 설정 (예를 들어 조명 전력 및 시간, TIRF 각도)의 조정을 포함하는, 제공된다.

<table><tbody><tr><td>#1.5 glass slides</td><td>VWR</td><td>631-0853</td><td></td></tr><tr><td>250ml round bottom flask</td><td>VWR</td><td>201-1357</td><td></td></tr><tr><td>50:50 beam splitter cubes</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td></td></tr><tr><td>Acousto-opitcal modulator C1205-2</td><td>Isomet</td><td>-</td><td>only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20009</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>autoclave tape</td><td>VWR</td><td>489-1312</td><td>or any other heat-stable sticky tabe</td></tr><tr><td>Avanti Mini-Extruder</td><td>Avanti Lipids</td><td>610000</td><td>alternative to the bath sonicator</td></tr><tr><td>bath sonicator QSONICA Q700</td><td>QSONICA</td><td>Q700</td><td></td></tr><tr><td>beam splitter</td><td>Cairn</td><td>P280/210/MLS</td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chi rotary evaporator</td><td>VWR</td><td>531-0837</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td>see manuscript text for alternatives</td></tr><tr><td>concentarted hydrogenperoxide</td><td>Roth</td><td>9683.1</td><td></td></tr><tr><td>concentrated sulfuric acid</td><td>Roth</td><td>X944.2</td><td></td></tr><tr><td>epoxy glue</td><td>Uhu</td><td>45705</td><td>Uhu plus sofortfest 2min</td></tr><tr><td>filter wheel</td><td>Sutter instruments</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>LabTek chambers</td><td>VWR</td><td>734-2062</td><td></td></tr><tr><td>laser&amp;nbsp;</td><td>Toptica</td><td>-</td><td>different variants (wavelengths 375 - 785 nm) are available</td></tr><tr><td>lens</td><td>Thorlabs, Newport</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DGS NTA-Ni (lipid)</td><td>Avanti Lipids</td><td>790404C</td><td>already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended</td></tr><tr><td>POPC (lipid)</td><td>Avanti Lipids</td><td>850457C</td><td>already in Choroform-solved delivered version is recommended</td></tr><tr><td>microscope Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>mirrors</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>optical filters</td><td>AHF, Chroma, Semrock</td><td>-</td><td>filter sets are available for many different combinations of dyes</td></tr><tr><td>oscilloscope</td><td>BK Precision&amp;nbsp;</td><td>2120C</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136</td><td>degas before usage</td></tr><tr><td>periscope</td><td>Thorlabs</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>picodent twinsil 22</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>alternative to the epoxy glue</td></tr><tr><td>power meter Lasermate-Q</td><td>Coherent</td><td>-</td><td>any powermeter sensitive in the used spectral range will do</td></tr><tr><td>pulse generator</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SRS DG535&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>spatial filter</td><td>Thorlabs</td><td>KT310/M</td><td></td></tr><tr><td>syringe filter 0.2&amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46</td><td>Zeiss</td><td>440782-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>trichloromethane/chloroform</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>45237</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>RC M150GX</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge rotor</td><td>Thermo Fisher</td><td>S120-AT2</td><td></td></tr><tr><td>UV spectrophotometer Nanodrop 2000c</td><td>Thermo Fisher</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>vacuum pump</td><td>VWR</td><td>181-0248</td><td></td></tr></tbody></table>

single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

단일 분자 형광 현미경 시스템의 구조는도 2에서 상당히 상세 개략되어있다. 그러한 광학 구성 요소들 및 다른 하드웨어 구성 요소와 같은 개별 부품은 서론에서 설명된다. TIRF 비 TIRF 조명에 정의 된 방식으로 발생시키는 광 여기 빔 경로는, 도시 및도 5 내지도 3에 설명되어있다.에 위치하는 제 잠망경 거울 앞 50:50 빔 스플리터의 위치를주의 마이크로 미터 번역 단계 (그림 5). 이 빔 스플리터 (녹색 표시) 이미징에 사용되는 TIRF 빔 (빨간색 표시) 비 TIRF 빔 (그림 3에 설명 된대로) 표백 또는 로컬 조리개 정의 빛을 매개 샘플 활성화에 사용되는 중첩. (오렌지색으로 나타낸도 5)가 결합 된 광 통로의 MICR 반전 포트에 다시 초 잠망경 미러를 통해 반사된다oscope. 도 4에서 설명되고도 2에서 설명한 바와 같이, 2 또는 3 개의 볼록 렌즈의 구현은 레이저 빔 프로파일을 넓히고 TIRF에서 샘플을 조명 개의 평행 빔을 야기 할 목적의 초점면 상에 레이저 빔을 집중하고 각각의 비 TIRF. 시험편의 전력 밀도를 계산에 필요한 측정 된 강도 값에 대한 예는도 6에 도시되어있다. 평균 배경 신호 (촬상 사용됨) 조명과 중앙 영역에서 측정 된 강도로부터 감산하는, 내부 영역 판정 레이저 빔 (여기에 7089 카운트)에 의해 조명되지 않은보기의 필드. 조명 (1684 카운트)의 백그라운드 보정 된 평균 강도 및 중앙 영역 (4830 카운트)를 통합 한 다음에 강도 상승 (1.471주고 해당 영역 크기 곱조명 영역에 대한 × 10 (8) 수와 중앙 지역에 대한 3.424 × 10 7 카운트). 중앙 및 조명 된 영역 내에 통합 강도의 비는 중앙 영역 (0.23 또는 23 %)를 조명하는 전체 전력의 비율을 산출한다. 영화에 도시 된 바와 같이, 전체 전력이 아닌 TIRF 조명 모드에서 파워 미터의 사용과 대물에서 결정되어야한다. 우리의 예에서는 따라서 중앙 지역에서 5 mW의 X 0.23 = 1.15 mW의의 전력 상승을주고, 5 mW의 조정됩니다. 1 ㎛ 내지 2 예에서 41.5 픽셀 량 때문에, 중앙 영역은 7089 픽셀 /41.5 μm의 화소 × 2 = 170.8 ㎛의 (2)의 크기를 갖는다. 이 영역 (170.8 ㎛의 2)에 의해 중앙 영역 (1.15 Mw)이 조명하는 광의 전력을 나누면 평균 전력을 산출중부 지역에서 0.7의 kW / cm (2)의 밀도. 그림 7은 이미지와 빠른 연속 획득 한 형광의 대응 강도 결과를 (10 밀리의 시간 프레임 즉, 초당 100 프레임)이 있습니다. 강도 정량 형광 신호를 커버 칠 (= 49) 화소의 일곱 의해 직사각형 영역의 평균 신호가 결정된다. 또한 배경의 평균 신호는 단일 분자 신호의 근접한 픽셀 일곱 일곱의 사각형 영역 내에 결정된다. 배경 보정 된 평균 신호 (굵게 표시) 단일 분자 신호를 야기하는 영역 (= 49) 내의 픽셀들의 개수에 의해 곱해진다. SLB-관련된 형광 표지 된 단백질의 이동도를 평가하기위한 대표적인 실험 FRAP는도 8에 도시되어있다.도 8a repeti 참고낮은 강도 넓어 촬상 빔보다 좁은 제의 단일 사용의 용도적인 제로 초 시점에서 신속 형광 색소 박리 용 고강도 빔 조리개 정의. 표백제 펄스에 앞서 초기 평균 강도 값에 의해 정규화 된 노란색 원 내의 배경 감산 된 평균 강도를, 속도 및 정도 형광 회복을 기록하는 시각에 대하여도 8b에 그려진다. 도시 된 바와 같이, 초기 강도의 이중층 (녹색 선으로 표시)이 90 % 이상은 형광 색소 절제 다음 75 초 이내에 회복. 결과적으로 도시 SLB에 매립 단백질의 10 % 이하가 움직이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig1.jpg" /> SLB 시스템의 도식 개요를 그림. (A)는 SLB 수 POPC (90-99%) 및 지질 합성 DGS NTA-N 이루어지는I (1-10%). 깨끗한 유리 표면이 해당 지질로 구성된 포드 SUV로 충전 할 때 그들은 자발적으로 형성한다. (B) 일단 형성되면,이 SLB 수 쉽게 어느 한쪽 C- 또는 (12H를 열두 히스티딘을 포함하는 N- 말단 태그에 대한 확장 수용성 단백질로 장식 할 수 있습니다 예를 공동 자극 분자 B7-1 및 접착 분자 ICAM-1) 또는 단백질 이량 체는 두 개의 태그 예 αβMHC 클래스 II 이량 체).에 대한 각 (2x6H 여섯 히스티딘을 포함하는 확장 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig1large.jpg" target="_blank">이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig2.jpg" /> 도 2 여기 및 발광 빔 경로의 개요. 가스 이온 레이저 (예를 들면 아르곤 또는 Kr을 + +), 음향 광학 (MO)의 사용과 함께 신속한 셧 동작 될 수있다<html> dulators. 레이저 다이오드는 여러 파장에서 현재 사용할 수 있으며, 그들은 전자 마이크로 분노 변조 할 수있는 훌륭한 대안을 나타냅니다. 레이저 빔이 용이하게 두 (이색) 거울 및 분할로 조정하고 두 개 이상의 빔 경로를 야기 할 수있는 간단한 빔 스플리터의 사용과 결합 될 수 있다는 점에 유의하라. 이 예에서 TIRF 영상 빔 (이벤트를 모니터링하기 위해) 및 표백제 빔 (표백 형광 또는 중 하나에 사진이 활성화 구경 정의 방식으로 갇힌 분자하는) 사용됩니다. 두 자극 경로는 추가의 셔터를 사용하여 서로 독립적으로 조작 될 수있다. 잠망경 시료 TIRF 조명을 생성하는 목적의 초점면 내에 집속 된 레이저 빔을 변환을 허용한다. 형광 이미지는 스펙트럼 초 고감도 카메라 (예 EM-CCD 또는 CMOS 카메라 과학)의 사용으로 획득하기 전에 발광 빔 스플리터를 이용하여 분할 될 수있다..COM / 파일 / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig3.jpg" /> 도 3 목적의 초점면 내에 집속 된 빔을 변환하여 TIRF 조명을 조정하는 단계를 포함한다. 상기 레이저 빔의 초점 위치를 도시하는 바와 같이 빔의 전좌를 통해 주위로 중심으로부터 목적의 초점면 내에 시프트 (잠망경 미러 배열을 사용). 임계각은 전반사의 발생에 도달 할 때까지 그 결과는 평행 광 조명으로 기울어 목적을 남긴다. 산장은 전반사가 발생 유리 - 미디어 인터페이스에서 발생한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig3large.jpg" target="_blank">이 파이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a><html> gure. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig4.jpg" /> 도 4 간단한 광학 시스템은 대물 렌즈의 초점면에 레이저 빔을 집중시키기 위해. 어느 세 개의 렌즈는 레이저 빔을 확대하고 TIRF 대물 렌즈의 초점면에 집중할 필요가있다. 두 렌즈 시스템은 세 개의 렌즈 시스템보다 적은 렌즈 관련된 오류를 포함하고 TIRF 촬상 된 빔을 생성하기위한 더 적합 할 수도있다. 정의 빔 확대와 날카로운 모서리와 조명 지점을 목표로 할 때 사진을 활성화 또는 -bleaching을 사용하는 연구에 필요한 것 3 개의 렌즈가 바람직 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> /53158fig5.jpg &quot;/&gt; 도 5는 형광 현미경의 뒤에 빔 경로의 사진에 주석. 이미 쉽게 두 여기 빔 TIRF 한 (녹색 표시) 비 TIRF 모드에서 다른 구현도 2 하나 지팡이에 설명 된 바와 같이 (표시된 빨간색). 이들은 50:50 빔 스플리터 (BS)를 이용하여 중첩된다. 볼록 렌즈 (L1 및 L2)은 대물의 초점면 상에 그들 각각의 초점 빔으로 위치된다 (도시하지 않음). 두 개의 거울 (M1 및 M2)로 구성된 잠망경은 현미경으로 항목의 포트를 통해 두 빔을 안내합니다. 제 1 미러 (M1)는 TIRF 위치로 빔 중 하나를 이동 (표시된 바와 같이 마이크로 미터 나사를 돌려서) 변환 스테이지 (TS)를 이용하여 이동 될 수있다. TIRF가 설정되면 (여기서는 적색으로 표시된 광 표백 또는 -activati​​on, 사용됨) 제 2 빔은 비 TIRF에 목적을두고 독립적 TIRF 빔을 조정할 수있다모드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig6.jpg" /> 조명 스폿의 중심 영역 내에서 전력을 측정하는도 6. 배경을 반영 관심 해당 영역을 선택 나타낸 바와 같이, 전체 조명 영역 (IA) 및 이벤트 후 기록한다 중앙 영역 (CA). IA 및 CA에 대해 이러한 배경으로부터 값을 빼고 각 영역 (= 집적 강도) 내에 존재하는 픽셀들의 수의 수정 평균 강도를 승산하여 강도를 통합. (: 23 %이 예에서) CA를 조명 빔 전력의 비율에 도착 IA의에 의해 CA의 통합 강도를 나눈다. 여기서 전체 빔 파워 (곱하여 CA 조명 광의 전력을 결정 : 5m을0.23) : 여기에 CA를 (조명 비율이 W). (1 / 41.5 μm의 2 화소 여기 -1), 화소 간 영역 크기 변환 인자 (여기 7089 화소) 영역을 곱 중앙 영역의 크기를 결정한다. CA의 크기에 의해 (1.15 mW의 여기에) 힘을 분할, CA를 조명 여기 빛의 평균 전력 밀도에 도달 할 수 있습니다. (여기를 : 170.8 μm의 2) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig7.jpg" /> 단일 분자 신호 그림 7. 정량. (A) SLB에 하나의 형광의 시간 코스. 관심 (ROI, 노란색)의 7 × 7 픽셀 크기의 영역은 정량에 대한 신호 주위에 배치된다. 배경은 이웃 7 × 7 픽셀에서 결정된다ROI (녹색). (B)의 정량화 된 평균 픽셀 강도가 나열됩니다. 단일 분자 신호를 결정하기 위해, 배경 값 (녹색 ROI)은 하나의 단일 분자 형광 강도를 시간에 대해 도시된다 신호 값 (옐로우 ROI)으로부터 감산 및 49 (C)에 의해 곱해진다. 형광 표백하는 과정에서와 같이 90 밀리 초 시점이 생략되어 있음을 유의하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig8.jpg" /> SLB의 무결성을 확인합니다 (FRAP) 분석을 광표백 후 8 형광 복구 그림. (A)는 FRAP 실험마다 10 화상이 도시되어 IEK / MCC-647 알렉사 형석 운반 이중층에서 수행 하였다. 실험에 도시의 (B) FRAP 정량 (A). 값이 표백 전 초기 강도 (I 오)로 나눈 값 (A)에 도시 황색 ROI 내의 평균 세기 (I)를 나타낸다. 레드 데이터 포인트는 (A)에 표시되며, 녹색 선은 원래 강도의 0.9 복구를 의미한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

single-molecule-fluorescence-microscopy-on-planar-supported-bilayers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K 조회수.  Vienna University of Technology. Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution. 

비디오: Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging is an important tool for understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the spatial and temporal heterogeneity of molecular behaviors that underlie cellular biology 1-4. To image an individual molecule of interest, it is typically conjugated to a fluorescent tag (dye, protein, bead, or quantum dot) and observed with epifluorescence or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. While dyes and fluorescent proteins have been the mainstay of fluorescence imaging for decades, their fluorescence is unstable under high photon fluxes necessary to observe individual molecules, yielding only a few seconds of observation before complete loss of signal. Latex beads and dye-labeled beads provide improved signal stability but at the expense of drastically larger hydrodynamic size, which can deleteriously alter the diffusion and behavior of the molecule under study.
Quantum dots (QDs) offer a balance between these two problematic regimes. These nanoparticles are composed of semiconductor materials and can be engineered with a hydrodynamically compact size with exceptional resistance to photodegradation 5. Thus in recent years QDs have been instrumental in enabling long-term observation of complex macromolecular behavior on the single molecule level. However these particles have still been found to exhibit impaired diffusion in crowded molecular environments such as the cellular cytoplasm and the neuronal synaptic cleft, where their sizes are still too large 4,6,7.
Recently we have engineered the cores and surface coatings of QDs for minimized hydrodynamic size, while balancing offsets to colloidal stability, photostability, brightness, and nonspecific binding that have hindered the utility of compact QDs in the past 8,9. The goal of this article is to demonstrate the synthesis, modification, and characterization of these optimized nanocrystals, composed of an alloyed HgxCd1-xSe core coated with an insulating CdyZn1-yS shell, further coated with a multidentate polymer ligand modified with short polyethylene glycol (PEG) chains (Figure 1). Compared with conventional CdSe nanocrystals, HgxCd1-xSe alloys offer greater quantum yields of fluorescence, fluorescence at red and near-infrared wavelengths for enhanced signal-to-noise in cells, and excitation at non-cytotoxic visible wavelengths. Multidentate polymer coatings bind to the nanocrystal surface in a closed and flat conformation to minimize hydrodynamic size, and PEG neutralizes the surface charge to minimize nonspecific binding to cells and biomolecules. The end result is a brightly fluorescent nanocrystal with emission between 550-800 nm and a total hydrodynamic size near 12 nm. This is in the same size range as many soluble globular proteins in cells, and substantially smaller than conventional PEGylated QDs (25-35 nm).

We describe the preparation of colloidal quantum dots with minimized hydrodynamic size for single-molecule fluorescence imaging. Compared to conventional quantum dots, these nanoparticles are similar in size to globular proteins and are optimized for single-molecule brightness, stability against photodegradation, and resistance to nonspecific binding to proteins and cells.

단일 분자 이미징을위한 소형 양자 점

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

연구

공학

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

생물학

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

생체공학

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

생화학

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient association of pore-forming and auxiliary subunits, lateral diffusion, and clustering with other proteins. However, the relationship between lateral diffusion and function is poorly understood. To approach this problem, we describe how lateral mobility and activity of individual channels in supported lipid membranes can be monitored and correlated using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Membranes are fabricated on an ultrathin hydrogel substrate using the droplet interface bilayer (DIB) technique. Compared to other types of model membranes, these membranes have the advantage of being mechanically robust and suitable for highly sensitive analytical techniques. This protocol measures Ca2+ ion flux through single channels by observing the fluorescence emission of a Ca2+-sensitive dye in close proximity to the membrane. In contrast to classical single-molecule tracking approaches, no fluorescent fusion proteins or labels, which can interfere with lateral movement and function in the membrane, are required. Possible changes in ion flux associated with conformational changes of the protein are only due to protein lateral motion in the membrane. Representative results are shown using the mitochondrial protein translocation channel TOM-CC and the bacterial channel OmpF. In contrast to OmpF, the gating of TOM-CC is very sensitive to molecular confinement and the nature of lateral diffusion. Hence, supported droplet-interface bilayers are a powerful tool to characterize the link between lateral diffusion and the function of ion channels.

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol describes how to use TIRF microscopy to track individual ion channels and determine their activity in supported lipid membranes, thereby defining the interplay between lateral membrane movement and channel function. It describes how to prepare the membranes, record the data, and analyze the results.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

신경과학

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...