저자는 기꺼이이 모델의 이전 반복의 개발에 그들의 중요 한 역할에 대 한 교수 윌리엄 뮬러 박사 클레어 Westhorpe의 작품을 인정합니다. 저자 또한 monocyte의 정렬에 대 한 AMREP Flow Cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다 하위 집합 및 알프레드 병원 감염 질병 단위 임상 연구 일부 연구에 대 한 HIV + 개인의 채용에 대 한 간호사. 저자는 기꺼이 버넷 연구소를 받은 빅토리아 운영 인프라 지원 프로그램의이 작품에 기여를 인정 합니다. TAA는 RMIT 대학 담당-장관의 박사 장학금에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 NHMRC 프로젝트 그랜트가 아에 게 수 여 하는 1108792에 의해 지원 되었다. TK에 의해 지원 됩니다 NIH 부여 NIH K08AI08272, NIH/NCATS 그랜트 # UL1TR000124.

참고: 인간의 생물 학적 샘플을 사용 하 여 모든 실험 윤리 승인 알프레드 병원 인간의 윤리 위원회, 멜버른에서에서 수행 되었습니다. 지정 하지 않으면 모든 실험은 클래스 II Biosafety 캐비닛에 수행 했다. &#34; Prewarmed &#34;는 waterbath에서 37 ° C로 예 열 하는 약을 말합니다.
 1. 준비의 유형 I 섬유 콜라겐 젤: 1 일 <ol><li>준비 순차적으로 추가 하 고 혼합 35.7 m m NaOH에 의해 콜라겐 젤 생산, 0.71 x M199, 4.58 m m 초 산 및 1.71 mg/mL 유형 I 섬유 콜라겐 5 mL 폴리스 티 렌으로 표 1에 의하여 관. 
	참고: 콜라겐은 콜라겐의 형성을 중지 하기 위해서는 5 번 위아래로 부드럽게 pipetting으로 잘 혼합 되도록 &#39; 주머니 &#39; 젤 혼합물에서. 현미경 검사 법에 대 한 테스트 조건 당 4-6 젤 또는 cytometry에 대 한 테스트 조건 당 15 젤 준비.</li>
	<li>한번 메 마른 플랫 96-잘 조직 배양 플레이트의 각 음에 콜라겐 젤 혼합물의 혼합, aliquot 50 µ L을 잘. 외부 행 및 열, 사용 하지 않지만 이러한 200 µ L 1의 채우기 x Dubecco &#39; s 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 건조에서는 젤을 보호 하기 위해. 유해를 콜라겐 수 있도록 2 h 37 °C/5% CO 2 접시를 품 어. 
	참고: 위 판 직접도 열 분포를 보장 하기 위해 인큐베이터에서 깨끗 한 금속 선반.</li>
	<li>인큐베이션, 다음 오버레이 보충된 M199 x 1의 150 µ L로 젤 (재료의 표 참조) 사용까지 5 일 동안 품 어와.</li>
</ol> 2. 확장 저장 HUVEC: 하루 1 <ol><li>라벨 코트 10 cm 직경 50 µ g/mL fibronectin의 1 mL를 페 트리 접시 1 x PBS에 희석 하 고 10 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
	<li>해 동 aliquots cryopreserved 주 인간의 탯 줄의 정 맥 내 피 세포 (HUVEC, 1.0 x 10 6 셀) 10 ml M20. 
	참고: 이전 21을 설명 하 고 낮은 통로에 사용 준비 되어야 한다 HUVEC (&#60; 4 구절). HUVEC 여기 인간의 관상 동맥 내 피 세포로 대체 될 수 있습니다.</li>
	<li>10 ml M20 HUVEC resuspend 및 fibronectin 코팅 접시, 3 일에 미디어 대체 셀, 그리고 문화에 합류 (약 5 일)의 추가 전에 초과 fibronectin 발음 추가.</li>
</ol> 3. 콜라겐 젤에 HUVEC 단층 배양: 하루 5 <ol><li>날 5, HUVEC 문화는 배양 접시에서 표면에 뜨는 발음 하 분리 혈 청 무료 M199의 10 mL와 함께 혈 청에 포함 된 미디어를 멀리 세척.</li>
	<li>M199에 HUVEC 5 mL 0.05 %trypsin / 0.53 EDTA를 추가 하 고 셀 분리 될 때까지 부드럽게 흔들어, 실내 온도에 1-2 분 동안 품 어.</li>
	<li>분리, 일단 신속 하 게 5 mL M20 페 트리 접시를 헹 구 고 10 mL 튜브에 세포를 포함 하는 미디어 전송.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기 샘플 상쾌한 발음, M20의 200 µ L 셀 resuspend 및는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>는 M20에서 10 5 셀/mL x 2.0 셀 resuspend, 96 잘 접시 (1.3 단계)에서 젤에 M199 발음 하 고 추가의 resuspended HUVEC (2.0 x 10 4 셀) 100 µ L 각 콜라겐 젤 (1.2 단계) 위의 준비. 추가 3 일 37 °C/5% CO 2 격판덮개 문화. 
	참고: HUVEC 단층의 무결성 수 수 3 일 후에 의해 확인 실버 질산염이이 단계에서 22 또는 꽉 접합 단백질 23 immunohistochemistry 얼룩. 이 목적에 대 한 추가 젤을 준비 해야 합니다.</li>
</ol> 4. HUVEC 단층와 환생에 대 한 Monocytes의 절연/정품 인증: 하루 8 <ol><li>하루 8에는 M20 발음 monocytes의 추가 하기 전에 각 HUVEC 단층 활성화 미디어는 젤을 오버레이 및 100 µ L 10 ng/mL의 추가 M20 젤 당에 인간 TNFα입니다. 37 °C/5%에서 품 어 공동 2 4 h. 
	참고: 비-활성화 HUVEC 조건 또한 포함 될 수 있습니다 컨트롤으로 필요한 경우.</li>
	<li>동안 4 h HUVEC 활성화 단계, 격리 monocytes PBMCs 자석 사용 하 여에서 구슬 제조 업체 마다 셀에 대 한 부정적인 선택 기법 &#39; s 지시. 10 6 PBMCs x 6.5의 최소 monocytes는 일반적으로 PBMCs의 대략 10-15%에 대 한 계정으로 한 조건에 필요한 10 5 monocytes x 3.0을 안정적으로 복구 하려면이 단계에서 사용 해야 합니다. 
	참고: monocyte 환생 및 거품 세포 형성 이전 monocyte 활성화의 효과 평가 하려면 monocytes는이 단계에서 활성화할 수 있습니다. Monocytes는 해 동된 PBMCs (즉, 저장 된 환자 샘플) 필요한 경우 격리 될 수 있습니다. FACS 정렬 하 여 격리 하는 monocyte 하위 집합 추가 젤 (그림 1)를 위해 준비 될 수 있다.</li>
</ol> 5. 기본 인간 Monocytes의 환생: 하루 8 <ol><li>monocyte 환생을 측정, TNFα 포함 된 미디어를 제거 하 고 세척 젤 100 µ L로 두 번을 추가 하 고 미디어를 제거 하 여 M199. 2.0 x 10을 추가 다음 세척, 5 갓 절연 또는 재개 되 고 씻어 cryopreserved PBMCs 또는 10 4 갓 절연 monocytes x 5.0 또는 정화를 100 µ L에서 HUVEC monolayers 하위 집합 monocyte M20. 젤으로 monocytes의 앞으로 환생 있도록 37 ° C, 5% CO 2에서 1 시간에 품 어. 그것은 모든 실험 조건 검사에 대 한 6 우물 수 있도록 최고의. 
	참고: 환생 및 거품 세포 형성에 헌 혈 청의 효과 평가 하려면 품 어 셀 M20 열 비활성화 기증자 혈 청의 원하는 농도 포함 하 고 조건에 풀링된 인간의 혈 청 제어 됩니다. Monocytes 이외의 백혈구는이 단계에서 추가할 수 있습니다. 특정 지질/지질 종 (예를 들어, HDL, oxHDL)의 영향을 조사 하는 경우 20-50 µ g/mL 지질을 포함 하는 혈 청 자유로운 미디어와 모든 다음 단계를 수행.</li>
	<li>앞으로 환생의 h 1 후 젤 prewarmed 1mm 1 x PBS에 EGTA 100 µ L로 두 번 그리고 한 번 100 µ L를 세척 하 여 비 transmigrated 세포를 수집 M199 (같은 원심 조건), 같은 각 우물에서 supernatants 풀링 얼음에 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 실험 상태 (일반적으로 6 우물). 4 ° C, 5 분에 대 한 300 x g에서 비 transmigrated 세포를 원심과 30 µ L 1 x PBS에서 resuspend.</li>
	<li>셀에서 앞으로 transmigrated 셀의 수를 확인 하는 상쾌한 수집.</li>
	<li>앞으로 transmigrated 셀의 백분율은 다음과 같이 결정 됩니다: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq1.jpg" /> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq2.jpg" /> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq3.jpg" /></li> <li>는 씻어 커버 transmigrated 셀 100 µ L 포함 하는 젤 M20 및 추가 48 헤에 대 한 품 어</li>
	<li>후 48 h는 상쾌한 수집과 100 µ L로 두 번 세척 비 transmigrated 셀 prewarmed 1mm EGTA/PBS, 수집 및 풀링 단계 5.2와 같이 각 조건에서 상쾌한. 
	참고: 이러한 셀 f에 테스트 수 있습니다 역방향 transmigrated 세포의 표현 형ollowing 표준 cytometry 프로토콜을 얼룩이 지.</li>
	<li>4 ° c, 5 분에 대 한 300 x g 세포를 원심 및 셀 30 µ L 1 x PBS에 resuspend. 셀 하 고 trypan 푸른 얼룩 통해 생존 능력 결정.</li>
	<li>다음과 같은 방정식을 사용 하 여 역방향 transmigrated 세포의 비율 결정: 
	<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq4.jpg" /> 참고: 될 것입니다 가능성 앞으로 환생은 앞으로 transmigrated 세포의 총 수 역 환생의 더 정확한 표시를 제공에 대 한 회계 100%.</li>
	<li>분석 현미경, 각 잘을 100 µ L 2% 포름알데히드 (최종 농도)를 추가 하 여는 젤을 수정에 대 한 알루미늄에서 플레이트 커버 호 일 및 분석까지 4 ° C에서 저장. Cytometry에 대 한이 단계에서 셀을 해결 하지 않습니다. 현미경 검사 법 (단원 6) 또는 교류 cytometry (섹션 7) 분석에 대 한 아래 프로토콜 참조. 
	주의: 포름알데히드는 유독 하 고 부식성; 개인 보호 장비 (PPE)를 사용 합니다. 그러나 주의 해야 포름알데히드를 추가할 때,,이 단계 사용 하는 낮은 농도 때문에 증기 두건에서 필요 하지 않습니다.</li>
</ol> 6. 거품 세포와 대 식 세포 (기름 빨간 O 얼룩) 현미경 검사 법에 의해 정량 <ol><li>는 포름알데히드를 제거 하 고 5 분 동안 50% (v/v) 메탄올과 15 분에 대 한 다음 100 µ L 78% (v/v) 메탄올의 100 µ L로 젤을 씻어 
	참고: 실험실 벤치에와 클래스 II 생물 캐비닛 안에 수행 될 수 있습니다 얼룩 단계.</li>
	<li>지질 방울 갓 0.2%의 추가 100 µ L에 의해 (w/v) 기름 빨간 O (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료를 참조) 실 온에서 1 시간을 위한 얼룩.</li>
	<li>4 젤을 세척 하 여 제거 초과 얼룩 100 µ L의 78% (v/v) 메탄올, 발음 및 각 워시 후 상쾌한 삭제 된 시간</li>
	<li>Giemsa, 100 µ L로 실 온에서 15 분 증류수에 1시 10분 희석에 대 한 counterstain.</li>
	<li>Giemsa 얼룩을 발음 하 고 젤 물으로 한번 씻어.</li>
	<li>접시에서 젤을 분리, rim 21 G 바늘을 사용 하 여 바깥쪽, 젤의 가장자리 주위에 직면 하는 경사와 우물.</li>
	<li>현미경 슬라이드에는 젤을 탑재 펀치 양면 테이프의 2.54 cm x 1.5 cm 스트립에 두 구멍 (6.35 m m 직경). 표준 현미경 쪽으로 테이프를 수정 하 고 위에서 보호 코팅 제거.
	<ol><li>추가 전송 피 펫을 사용 하 여 테이프에 구멍에 물 한 방울. 핀셋을 사용 하 여, 부드럽게 전송 젤 크기 1.5 유리 coverslip 커버 테이프에 구멍을. 테이프에 그것을 준수 하는 coverslip을 살짝 누릅니다.</li>
	</ol></li> <li>40 X 목표는 거꾸로 한 현미경에 사용 하는 미분 간섭 명암 밝은 분야 현미경 검사 법으로 검사.
	<ol><li>가져와 40 X에 초점으로 HUVEC 단층 확대 및 스크롤 &#39;으로 &#39; 젤, 젤의 전체 깊이 걸쳐 세포/거품 세포를 계산. 세 가지 필드 보기 가능한 가장자리 효과 최소화 하기 위해 젤의 가장자리에서 비슷한 거리에 있는 반복 합니다. 이렇게 하면 젤 깊이 세 지역 사이 일관. 
		참고: 점수 젤 셀으로 어느 거품 세포 (포함 된 셀으로 정의 된 &#62; 1/3의 기름 빨간 O로 그들의 세포질 지질 방울 스테인드) 또는 슬라이드 ( 그림 2)에 장착의 2 시간 내 대 식 세포. 거품 세포 형성 마이그레이션된 셀의 총 수를 기준으로 거품 세포의 백분율로 표시 하 고 보기의 3 분야에서 중간 계산 조건, 당 6 젤에 대 한 검사 조건 당 18 측정의 중간값 따라서 표현 된다. 전형적인 실험에서 원시 세포의 예는 표 2에 표시 됩니다. 
		참고: 셀 폼 셀 vs macrophage 현미경 검사 법에 의해 분류 주관적 이며 따라서 탐정 종속 될 수 있습니다. 임상 연구에서 어디 실험 시간의 연장된 기간 동안 수행 됩니다, 단일 수 사관에 의해 멀게 수행 될 모든 계산에 대 한 중요 하다. 거품 세포와 젤에서 세포의 예는 그림 2에 제공 됩니다.</li>
	</ol></li></ol> 7. Flow Cytometry 셀 Transmigrated 분석 <ol><li>phenotypically 거품 세포와 대 식 세포 transendothelial 마이그레이션 다음 특성, prewarmed는 37 ° C 1 mg/mL 콜라에 M199에 희석 D의 100 µ L을 추가 하 여에서 젤 소화 고 37 °C/5% CO 2에서 20 분 동안 품 어 각. 
	참고:도 열 분포를 보장 하기 위해 인큐베이터에서 깨끗 한 금속 선반에 직접 96 잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>인큐베이션, macerate 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 젤 하 고 37 °C/5% CO 2에 추가 20 분 동안 품 어.</li>
	<li>한번 완벽 하 게 소화, 35 µ m 나일론을 통해 소화 복제 젤 얼음에 뒤덮인된 FACS 튜브 메쉬 필터 및 수영장 세척 한 번 FACS와 세척 (재료의 표 참조) 4 ° C에서, 300 x g. Resuspend FACS의 100 µ L 셀 워시</li>
	<li>CD45, 라이브/죽은 세포 마커 및 표준 흐름 cytometry 프로토콜을 사용 하 여 관심사의 표면/세포내 phenotypic 또는 기능 마커 fluorophore 활용 된 항 체 특정 결과 셀을 품 어. 
	참고: 컨트롤 준비 적절 한 fluorophores Ig 보상 비즈를 사용 하 여 보상에 대 한 관. 또한 cytospinning에 의해 추출 된 세포 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 유리 슬라이드에 수집 수 있습니다. 또는, 우리는 성공적으로이 프로토콜을 사용 하 여 이미징 cytometry 통해 평가 대 한 셀을 수집.</li>
	<li>교류 cytometer를 사용 하 여 셀을 습득 하 고 수행 하는 필요에 따라 보상. 
	참고: 거품 세포/세포 가벼운 살포 속성을 사용 하 여 개별 인구를 형성 하지 않을 수 있습니다 하 고 크기와 모양에 상당히 다를 수 있습니다, 설정 자유 앞으로 분산형 (FSC)와 측면 살포 (SSC) 빌 게이츠와 같이 모든 마이그레이션된 셀을 캡처 < 강력한 클래스 "xfig" = > 그림 3A.</li>
	<li>수집, 다음 흐름 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 데이터 분석을 수행. 마이그레이션된 셀을 확인 하려면 먼저 그림 3B와 같이 라이브/죽은 표식에 대 한 부정으로 셀을 선택 합니다. 그런 다음 단일 셀 차별 SSC-지역 대 SSC 높이에 표시 된 셀 주위에 꽉 게이트를 만들어서 수행.</li>
	<li>CD45 선택 + 세포와 세포/거품 세포 이들은 FSC/SSC 플롯에 마이그레이션된 셀의 주요 인구 문.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Napoli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+streak+formation+occurs+in+human+fetal+aortas+and+is+greatly+enhanced+by+maternal+hypercholesterolemia.+Intimal+accumulation+of+low+density+lipoprotein+and+its+oxidation+precede+monocyte+recruitment+into+early+atherosclerotic+lesions.">Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).</li><li>Woollard, K. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HIV-1+infection+in+vitro+on+transendothelial+migration+by+monocytes+and+monocyte-derived+macrophages.">Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages.</a> J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).</li><li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current.">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).</li><li>M&#252;ller, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Endothelial+Markers+PECAM-1,+vWf,+and+CD34+in+Vivo+and+in+Vitro.">Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro.</a> Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).</li><li>Kelesidis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+impaired+HDL+function+in+HIV-1+infected+compared+to+uninfected+individuals.">Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+heterogeneity+in+obesity+and+subclinical+atherosclerosis.">Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis.</a> European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).</li><li>Gacka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+and+atherogenic+activity+of+monocytes+in+Type+2+diabetes.">Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes.</a> J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++CD16++monocytes+and+cardiovascular+outcome+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease.</a> Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 프로토콜 monocyte 환생 및 거품 세포 형성을 결합 하 여 인간의 임상 동료에서 monocytes의 atherogenicity를 평가 하기 위한 다양 하 고 생리 적으로 관련 된 방법을 제공 합니다. 이 모델은 거품 세포 형성에 monocyte 환생의 효과 고려 하 고 이외에 고유의 역 환생6 의 측정을 허용 한다 거품 세포 형성의 다른 방법을 통해 장점을 제공합니다 버 외 인 요인의 존재 여부에 거?...

Monocyte 환생은 혈전 증, 뇌졸중과 심근 경색으로 이어질 수 있는 동맥 경 화성 플 라크의 개발에 중요 한 단계 이다. 동맥 경 화성 플 라크 지방 줄무늬, 일반적으로 현재의 낮은 진동 혈액 흐름의 사이트에서 중간에 큰 동맥, 예금 된 지질 내 피 활성화에 기여 하 고 염증1지역화에에서 개발. Monocytes는 monocyte 혈 단백질 (CCL2) 등을 통해 지방 줄무늬에 내 피 세포를 보충 하 고 intima2로 transmigrate. 환생, 다음 monocytes 지질 통풍 관, 지질 합성, 콜레스테롤 경과의 다운 레 귤 레이 션 또는 위 요인의 조합 결과로 거품 세포 라고 하는 atherogenic, 지질-라덴 세포 형성 수 있습니다. Monocytes 또한 순환에 있는 지질 축적 하 고 아마도 predisposing 세포 거품 세포 형성3,4에 대 한 '거품' 표현 형을가지고 수 있습니다. 거품 세포는 지방 줄무늬와 초기 단계의 동맥 경 화성 플 라크의 정의 기능 그리고 그들의 대형은 지질과 염증 성 중재자5에 의해 영향을. 또는, monocytes는 반대로 수 동맥에서 혈 류6, intima 동맥의 건강을 유지 하는 행동에서 지질 제거로 transmigrate.
하는 monocytes의 성향을 결정 동맥 내 피에 걸쳐 transmigrate 및 양식 폼 셀은 intima에 또는 반대로 transmigrate 그리고 플 라크에서 지질, 증가에 monocyte 활성화의 역할을 이해 하기 위한 주요 요구 사항 동맥 경 화성 위험입니다. 동맥 경화 증 마우스 모델 CADs의 지방 조 흔/동맥 경 화성 플 라크 개발에 대 한 정보 실시간 vivo에서 elucidating에 중요 하다. 그러나, 이러한 모델 (ApoE-/-서 부 타입 다이어트 모델) 등 다이어트7,8, 과감 한 변경와 일반적으로 결합 하는, 이러한 동물의 능력을 처리 하는 자연 콜레스테롤의 유전 변경 필요 어떤 드라이브 패 개발을 레벨 지질 순환의 비 생리 적 축적을 유도 합니다. 이러한 모델 만성 염증 성 인간의 조건 HIV 감염 등 콜레스테롤 저밀도 지단백 (LDL) 수치를 순환 증가와 연결 되지 않은 관련을 제한 수 있습니다. 또한, 차이 monocyte 생물학 인간과 쥐 monocytes의 부분 모집단의 관련성에 대 한 면역 질문 테스트 확인 (등 중간 monocytes (CD14+CD16 ++))9 어려운. 이 때 중요 한 심혈 관 질환으로 중간 monocyte 건의 심장 혈관 사건의10,11를 독립적으로 예측 운전 메커니즘을 공부. 분석 실험 순차적으로 격리에서 하거나 monocyte 환생 또는 거품 세포 형성을 측정 하기 위해 존재, 임상 동료에서 동일한 셀을 사용 하 여 초기 atherogenesis의 두 측면을 측정을 위한 생체 외에서 시험 검증 않았습니다. Transwell 모델에 의하여 셀 상단 챔버로 로드 되 고 다공성 플라스틱 방 벽 또는 셀 단층으로 일반적으로 chemoattractant12 미디어를 포함 하는 낮은 챔버 transmigrate 수정된 Boyden 2 챔버 시스템을 활용 , 13. 백혈구 환생의 분석을 위해 널리 이용 된다, 하는 동안 이러한 일반적으로 intima, 솔루션으로 마이그레이션 transmigrated 셀에 결과 나타내는 레이어를 포함 하지 않는 모델과 거품 세포의 측정에 대 한 허용 하지 않습니다 형성 또는 동일한 셀의 반전 환생입니다. 반대로, 거품 세포 형성의 모델 monocytes 또는 거품 세포 형성14을 알려져 있다 내 피 활성화의 효과를 유도 transmigratory 변경에 대 한 계정을 하지 않습니다. 또한, 이러한 시스템 유도 거품 세포 형성 세포에서 세포 배양 배지 exogenous 산화 저밀도 지 단백질 (oxLDL)15,16, 키 유도의 농도 포화의 추가 의해 준수 거품 세포 형성. LDL이이 모델에 사용 되는 종종 산화 CuSO4 치료17, 같은 비-순수-관련 프로세스에 따라서, 이러한 모델을 사용 하 여 연구의 생리 적인 중요성을 심문.
여기 우리가 따라서 거품 세포 형성에 monocytes의 역할을 잘 모델링 monocyte 환생과 외 인 oxLDL의 추가 요구 하지 않는 동일한 세포의 거품 세포 형성을 단정 하는 분석 결과 설명 합니다. 이 교수 윌리엄 뮬러 (노스웨스턴 대학교, 시카고)18에 의해 원래 개발 되었다 모델과 비보 전 비 활성화에서 격리 하는 monocytes의 atherogenicity 평가 하기 위해 우리의 실험실에 더 세련 된 개인 기본 염증 성 조건20노화 뿐만 아니라 HIV 감염19 질병을 동반, 그 조건은 동맥 경화 증의 위험 증가와 관련. 이 모델 또한 폼 거품 세포20, 거품 세포 형성14에 TNF 같은 cytokines에 의해 내 피 활성화의 영향을 다른 monocyte 하위 집합의 성향에 관한 기본적인 생물학 질문에 응답 하기 위한 플랫폼을 제공 합니다. , 깊이 등 monocytes의 철새 속성과 젤19에 환생의 속도 및. 또한, monocyte 환생 및 거품 세포 형성 표준 현미경을 사용 하 여 측정할 수 있습니다, 그리고 라이브 셀 이미징, flow cytometry 및 이미징 cytometry, 따라서, atherogenesis에 monocytes의 역할을 평가 하는 다양 한 방법을 제공.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1187">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Gel preparation reagents</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465-500G</td>
			<td>0.1 M NaOH diluted in H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">10X M199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">M0650</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">AcCOOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092-100ML</td>
			<td>20 mM Acetic acid diluted in H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cultrex Bovine Collagen I</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3442-050-01</td>
			<td>Type I Fibrous Collagen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M199</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11150-059</td>
			<td style="width:595px;">M199 media containing Earle&#39;s salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. 
			Media supplemented with 100 &#181;g/mL L-glutamine&#160; and 100 U/mL penicillin/streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:595px;">Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. 
			Individual lipid species such as LDL can be added to M199.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">HUVEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:595px;">Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human coronary artery endothelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:595px;">Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>BDH Merck</td>
			<td>10093.5V</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889-500G</td>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 &#181;g/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">New born calf serum</td>
			<td style="width:128px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">16010-142</td>
			<td style="width:595px;">New born calf serum: New Zealand origin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056-1MG</td>
			<td>Fibronectin - 50 &#181;g/mL aliquots prepared and stored</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">PBS (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.1% TNF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC3015</td>
			<td>Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 &#181;g/mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Low-density lipoprotein</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>LP2-2MG</td>
			<td>Low-density lipoprotein (LDL)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscopy</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1 or 2% formaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>4018</td>
			<td>1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">50% and 78% methanol</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>318-2.5L GL</td>
			<td>50% or 78% v/v methanol, diluted with H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil Red O stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides</td>
			<td>Mikro-Glass</td>
			<td>S41104AMK</td>
			<td style="width:595px;">Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slips</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td>MENCS224015GP</td>
			<td>22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Double-sided tape</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td>4011</td>
			<td>Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Giemsa stain</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.09204.0500</td>
			<td>Giemsa&#39;s azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hole punch</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;">Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flow cytometry</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase D</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11088858001</td>
			<td>Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 &#181;m nylon mesh capped polystyrene FACS tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh capped polystyrene FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34959</td>
			<td>Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">FACS wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plasticware</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate</td>
			<td>Nunclon</td>
			<td>167008</td>
			<td>Delta surface flat-bottomed 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 cm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Sterile 10 cm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td>Eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfer pipette</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>222-20S</td>
			<td>Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of monocyte transmigration and foam cell formation from individuals with chronic inflammatory conditions

관상 동맥 질환 (CAD)는 병 적 상태와 사망률 전세계의 주요 원인입니다. 동맥 경화, 선도적인 CAD의 원인, 예금 된 지질 이라는 큰 동맥에 동맥 벽의 중간에 있는 지방 줄무늬의 염증 성 사이트에 타고 난 면역 monocytes의 환생에 의해 시작 됩니다. 병 변은 동맥 경화 증의 초기 단계에서의 주요 병원 성 특징은 거품 세포 또는 세포 지질 라덴 형태로 동맥으로 마이그레이션하는 monocytes의 성숙 이다. 상당한 증거 지원 일반적인 노화 뿐 아니라 류 마티스 관절염 및 HIV, 질병을 동반 하는 만성 염증 성 조건에 의해 동맥 경화 증의 위험이 증가 하 고이 위험 monocyte에 의해 예측 가설 활성화입니다. 마우스 모델 vivo에서atherogenesis에 monocytes의 역할을 조사 하는 좋은 플랫폼을 제공, 그들은 자연 콜레스테롤 물질 대사의 유전 변경 및 일반 마우스 다이어트의 과감 한 변경 요구 및 적합성에 대 한 제한 인간의 comorbid 질병의 atherogenic 영향 연구. 이 모델을 인간의 생체 외에서 정의 된 질병 국가와 개인 으로부터 격리 하는 monocytes의 atherogenic 잠재력 측정을 개발 동기. 현재, 인간의 생체 외에서 모델은 격리에 monocyte 환생 및 거품 세포 형성 평가을 제한 하 고 있다. 여기 우리는 프로토콜 설명 monocytes 환자의 혈액에서 분리 된 1 형 콜라겐 매트릭스로 인간의 내 피 세포에서 transmigrate 그리고 그들의 성향 외 인 지질의 유무에 거품 세포로 성숙 하는 측정. 프로토콜에서 HIV 감염을 가진 개인 및 노인 HIV 감염 되지 않은 개인 정화 인간 monocytes의 사용에 대 한 확인 되었습니다. 이 모델은 다목적 monocyte 환생과 거품 세포 형성 중 현미경을 사용 하 여 계산 될 수 있습니다 또는 atherogenic 요인의 평가 허용 뿐만 아니라 cytometry 혈 청 또는 혈장에 존재.

Monocyte 환생을 측정
Monocytes는 그림 1에 설명 된 대로 모델에 추가 되 고 6 젤 각 조건에 대 한 준비가. Monocytes 기증자 당 6 젤에 대 한 (즉, 젤 6 젤 당 104 monocytes x 5.0 = 기부자 당 105 monocytes x 3.0) 포함 하는 필요한 혈 청/절연 지질 M199 미디어의 600 µ L의 최종 볼륨을 resuspende...

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Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

우리 인간의 내 피 monolayers에 걸쳐 monocytes에 의해 환생 및 거품 세포로 그들의 후속 성숙 측정 프로토콜을 설명 합니다. 이 혈액이 경향이 향상 시킬 수 있는 요인을 평가 하 고 다른 질병 조건 가진 사람에서 격리 하는 monocytes의 atherogenic 속성을 평가 하기 위해 다양 한 메서드를 제공 합니다.

Monocyte 환생 및 개인 만성 염증 성 조건에서 거품 세포 형성의 정량화

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

quantification-monocyte-transmigration-foam-cell-formation-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K 조회수.  Burnet Institute. 우리 인간의 내 피 monolayers에 걸쳐 monocytes에 의해 환생 및 거품 세포로 그들의 후속 성숙 측정 프로토콜을 설명 합니다. 이 혈액이 경향이 향상 시킬 수 있는 요인을 평가 하 고 다른 질병 조건 가진 사람에서 격리 하는 monocytes의 atherogenic 속성을 평가 하기 위해 다양 한 메서드를 제공 합니다.

비디오: Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

연구

면역학 및 감염병학

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

마우스에서 차 간세포 문화에 염증 반응의 유도

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

쥐 폐의 기관지 폐포 세척은 염증성 세포의 침윤을 분석하는

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

생체 내에서 단핵구 화학 적 활동의 정량화 및 혈액 단핵구 유래 대식세포의 특성화

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin injury, inflammation, and/or sensitization. The goal of this study is to describe an epidermal-dermal separation protocol using thermolysin, a proteinase that is active at 4 &deg;C. To illustrate this procedure, Sprague Dawley rats are anesthetized, and right hind paws are injected with carrageenan. Six and twelve hours after injection, rats with inflammation and na&iuml;ve rats are euthanized, and a piece of hind paw, glabrous skin is placed in cold Dulbecco's Modified Eagle Medium. The epidermis is then separated at the basement membrane from the dermis by thermolysin in PBS with calcium chloride. Next, the dermis is secured by microdissection forceps, and the epidermis is gently teased away. Toluidine blue staining of tissue sections show that the epidermis is separated cleanly from the dermis at the basement membrane. All keratinocyte cell layers remain intact, and the epidermal rete ridges along with indentations from dermal papillae are clearly observed. Qualitative and real-time RT-PCR is used to determine nerve growth factor and interleukin-6 expression levels. Western blotting and immunohistochemistry are finally performed to detect amounts of nerve growth factor. This report illustrates that cold thermolysin digestion is an effective method to separate epidermis from dermis for evaluation of mRNA and protein alterations during inflammation.

Presented here is a protocol for the separation of epidermis from dermis to evaluate inflammatory mediator production. Following inflammation, rat hind paw epidermis is separated from the dermis by thermolysin at 4 &#176;C. The epidermis is then used for mRNA analysis by RT-PCR and protein evaluation by western blot and immunohistochemistry.

부위별 염증성 mRNA 및 단백질을 검출하기 위해 열립신과 쥐 표피 및 진피의 분리

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.