이 방법론은 살아있는 동물에서 혈액 단세포의 화학 적 활성을 정량화하고 단세포 기능과 기본 메커니즘에 대한 가난한 식단의 효과를 연구 할 수 있게합니다. 단세포 유래 대식세포는 마우스 모델에서 혈액 단화 부위의 건강스냅샷을 제공하는 단일 세포 및 오믹스 기술을 포함한 다양한 접근법을 사용하여 분리 및 분석될 수 있다. 오늘의 절차는 내 실험실에서 조교수 안영주 박사와 내 실험실의 후의사 인 루시 왕 박사가 진행합니다.
시술을 시작하기 전에 세포 배양 후드를 소독제로 청소하고 얼음에 대한 성장 인자 감소 지하 막 유래 용액을 완전히 해동합니다. 개별 멸균 1 밀리 리터 주사기를 26 게이지 바늘로 장착하고 바늘을 얼음위에 놓습니다. 용액이 해동되면, 각 밀리리터 주사기에 화학 요법 유인제의 유무에 보충 된 500 마이크로 리터의 용액을로드하기 전에 알코올 면봉으로 지하 막 유래 용액 유리병의 상단을 닦아.
그런 다음 균일 한 플러그 형성을 보장하기 위해 지하 멤브레인 파생 솔루션로드 주사기에서 기포를 제거합니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, MCP-1을 초당 약 100 마이크로 리터에 첨가하지 않고 지하 막 유래 용액의 전체 부피를 천천히 주입하여 마취 마우스의 오른쪽 측면에 피하한다. 그리고 전체 500 마이크로 리터의 지하 막 유래 용액은 동물의 왼쪽 측면에 MCP-1로 보충.
주사기를 주입 후 20~30초 동안 제자리에 고정하여 용액의 누출을 방지하고 완전한 회복까지 모니터링할 때까지 워밍업 패드에 마우스를 놓기 전에 단일 매끄러운 젤 플러그가 형성되도록 합니다. 주입 후 3 일, 플러그인 주입 동물에서 등쪽 머리를 제거하고 아래 흉부와 상부 요추 척추 주위의 피부를 파악하기 위해 집게를 사용합니다. 피부에 2 밀리미터 길이의 절개를 하고 자궁 경부 척추에서 마우스 뒤쪽의 중간선을 따라 코들 척추 접합부의 1센티미터까지 잘라냅니다.
피부를 근육 층과 분리하고 폴리스티렌 폼 플랫폼에서 피부를 고정하십시오. 다음으로, 해부 현미경의 밑에, 조심스럽게 지하 막 유래 젤 플러그를 포함하는 섬유질 캡슐을 잡고 섬유질 캡슐을 제거하기 위하여 미세한 집게를 이용합니다. 그런 다음 미세 가위를 사용하여 플러그를 청소하십시오.
그런 다음 세척된 지하 멤브레인 유래 젤 플러그를 적절히 표지되고 무게가 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 전달합니다. 튜브의 무게를 재측정하여 지하 멤브레인 유래 젤 플러그의 중량을 계산합니다. 지하 멤브레인 유래 젤 플러그 소화의 경우 깨끗한 미세 가위를 사용하여 각 마이크로 원심 분리기 튜브에 지하 멤브레인 유래 젤 플러그를 다진 다음 플러그에 800 마이크로 리터의 변위를 추가하십시오.
10초 동안 최대 속도로 소용돌이가 플러그를 방해하고 마이크로 원심분리기 튜브를 분당 1400회전의 열믹서에 2시간 동안 섭씨 37도에 배치하여 지하 막 유래 젤 플러그를 완전히 녹입니다. 인큐베이션의 끝에서, 플러그 조각을 원심분리에 의해 두 번 퇴적시키고 PBS의 300 마이크로리터에서 펠릿을 재일시 중단한다. 각 세포 현탁액의 50 마이크로리터를 새로운 마이크로 원심분리튜브로 옮기고 0.5 마이크로리터의 칼신으로 새로운 튜브에 세포를 라벨을 붙입니다.
이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 10분 동안 배양한 후, 자동 세포 카운터에서 살아있는 녹색 형광세포의 수와 비형광세포의 수를 계산합니다. 단일 셀 웨스턴 블롯 해석의 경우 10센티미터 페트리 접시의 하단에 재수화 된 단일 셀 웨스턴 블롯 칩에 희석 된 단일 셀 서스펜션 1 밀리리터를 추가하십시오. 5-15 분 후, 밝은 필드 현미경 검사에서 칩을 검사합니다.
마이크로 웰의 약 15~20%는 단일 세포에 의해 점유되어야 하며 우물의 2% 미만은 2개 이상의 세포를 포함해야 한다. 칩이 제대로 로드된 경우 접시를 45도 기울여 서스펜션 버퍼로 칩을 세 번 씻어 캡처되지 않은 셀을 제거합니다. 마지막 세척 후, 칩을 단일 셀 웨스턴 악기의 전기 전지 세포에 조심스럽게 로드하고 겔 측 위로, 용해 실행 버퍼로 전체 단일 셀 웨스턴 블롯 칩을 덮는다.
셀 리시스를 시작하고 적절한 실험 매개 변수에 따라 계측기를 실행합니다. 실행이 끝나면 실온에서 세척당 신선한 세척 버퍼로 10 분 동안 세척 하는 두 개의 칩을 헹구는. 두 번째 세척 후, 항체 프로빙 챔버에 관심있는 1 차 항체 용액의 80 마이크로 리터를 추가하고 칩 겔 측을 아래로 낮추어 항체 용액이 칩을 가로 질러 심지 되도록합니다.
실온에서 2 시간 후, 세척 버퍼에 칩을 세 번 세척하고 셰이커에 물에 한 번 세척. 빛으로부터 보호되는 실온에서 1시간 동안 적절한 이차 항체로 칩을 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 세척 버퍼로 칩을 세 번 씻고 슬라이드 스피너에 칩을 회전하여 남은 세척 버퍼를 제거합니다.
단일 셀 웨스턴 블롯 칩을 제거하려면 랙 위에 1센티미터 높이의 물과 함께 섭씨 60도의 수조에 15 밀리리터 튜브 랙을 놓습니다. 연기 후드에 40 밀리리터의 스트리핑 버퍼와 320 마이크로리터의 베타 모셉타 에탄올을 캐니스터에 넣습니다. 칩을 10센티미터 페트리 접시에 캐니스터 안에 놓고 파라필름으로 캐니스터를 밀봉합니다.
그런 다음 튜브 랙 안에 캐니스터를 수조에 놓습니다. 90분 후, 칩을 새로운 페트리 접시에 조심스럽게 옮기고 워시 버퍼로 칩을 한 번 간략하게 씻은 후 15 밀리리터의 신선한 세척 버퍼를 페트리 접시에 넣고 셰이커에서 15분간 세척합니다. 이 대표적인 실험에서, 각 플러그로 모집된 세포는 주입 후 1, 3, 5일 후에 계산되었다.
MCP-1 로드 플러그의 셀 수로부터 차량 로드 플러그의 셀 수를 빼서 화학 요법 에 대한 응답으로 구체적으로 모집된 셀 수를 계산하였다. 가속 된 MCP-1 특이모집 및 세포의 축적은 5 일 동안 관찰되었으며, 주사 후 하루 에 31, 000 세포에서 하루 에 최대 136, 000 세포, 주사 후 5 일 동안 증가하였다. 단세포 서양 얼룩 분석은 관심있는 특정 면역 세포 마커의 표현에 따라 지하 막 유래 플러그에 모집된 상이한 세포 모형을 확인하기 위하여 그 때 이용되었다.
예를 들어, MCP-1 장전 지하 멤브레인 겔 플러그 내의 단핵구 의 비율은 첫날에 낮았고 5일째에 다시 떨어지기 전에 3일째에 정점을 찍은 반면, 대식세포 수는 연구 기간 내내 꾸준히 증가하였다. MCP-1 장전 플러그의 경우, 격리된 세포 집단 내의 단핵구 와 대식세포의 비율이 3일째에 가장 높았으며, 이는 3일 후에 MCP-1 의존화학증에 의해 모집된 세포의 대다수가 단세포및 대식세포였다는 것을 나타낸다. 3일째에 비해 5일째에 총 모노사이클과 대식세포가 더 높지만, 3일째의 세포 수는 단핵혈소및 모집의 말초 혈액을 보다 정확하게 반영하므로 지하 막 직접 플러그 분석에 3일째가 권장됩니다.
다운스트림 분석을 위한 단일 셀을 성공적으로 획득하는 것은 주입의 정확성과 플러그의 완전한 제거에 달려 있습니다. 유동 세포종법, 단세포 서양 블로팅, 벌크, 또는 단세포 RNA 시퀀싱 및 기타 omics 절차는 모집된 단세포 및 단세포 유래 대식세포의 특성및 표현형을 평가하는 데 사용될 수 있다.
