The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

호중구는 동의서에 서명 한 건강한 지원자에서 고립되었다. 연구는 인간의 복지에 대한 제도적 및 국가의 지침에 따라 수행되었습니다. 1 도금 및 인간 제대 정맥 내피 세포의 유지 보수 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 문화 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를). 피브로넥틴에 HUVECs를 성장 (FN)이 미디어를 사용하여 (순수에 용해 10 μg / ㎖) 요리를 코팅 처리 (내피 성장 중간 (EGM-2) singlequots 보충 내피 기초 중간 (EBM-2) 중). 실험 4-8 통로 사이에 세포 배양을 사용합니다. </li><li> 1 일 : 37 ° C에서 최소 2 시간 동안 피브로넥틴 100 ㎕ (PBS에서 10 μg이 / ㎖) 및 5 % CO 2와 코트 흐름 챔버. </li><li> 주 2 : 세포가 80-90% 합류에 도달하면, RT 인산염 완충 생리 식염수에주의 세탁 후 세포를 Trypsinize (PBS)의 pH 7.4, 미디어를 사용하여 800,000 세포 / ml에서 800 XG에 원심 분리기를 Resuspend. 플레이트 80,000 FN 코팅 흐름 챔버의 모든 단일 채널에서 세포와 부드럽게 위아래로 세포 현탁액을 피펫. 37 ° C에서 인큐베이터, 5 % CO 2 문화 O / N. </li><li> 일 3 : 부드럽게 45 ° 각도로 슬라이드를 기울여 흐름 챔버 슬라이드에서 용지를 새로 고칩니다. (그림 1A 참조). 주 : 만 저수지가 아닌 채널 자체가 미디어를 제거하는 것이 좋습니다. 채널 미디어의 제거로 인해 피펫으로 인한 미디어의 드래그 힘 내피 세포 손실 및 사망을 초래할 수 있습니다. </li><li> 내피 세포는 단층 (즉, 100 % 합류)을 형성 한 경우 위상차 현미경으로 확인합니다. 세포가 100 % 합치하지 않은 경우가 100 % 합류점에 도달 할 때까지, 일 미디어 두 번 변경. </li><li> 세포 포화 상태에 도달 한 후, (단계 참조 미디어 세포를 자극1.1) 염증 매개체 (TNF-α (10 ng의 / ㎖)을 함유). , 내피 세포의 염증 표현형에서 TNF-α의 결과 HUVECs를 O / N (즉, 12 시간), 즉 자극., 상향 조절 등 ICAM-1 및 VCAM-1 (13)과 같은 세포 부착 분자. </li></ol> 퍼콜 그라디언트를 사용하여 2 다형 백혈구 분리 <ol><li> 다형 핵 백혈구 (PMN)를 분리하기 전에 : N-2-히드 록시 에틸-N&#39;-2-에탄 술폰산 (흐름 버퍼 이하라고 함) (HEPES) -buffer 준비합니다. 플로우 버퍼는 격리 된 백혈구를 세척하는 데 사용되는 흐름 분석에서 버퍼로. 흐름 버퍼를 준비하려면 : 7.72 g의 NaCl (132 밀리미터), 4.76 g의 HEPES (20 밀리미터), 0.45 g의 KCl (6 밀리미터), 0.25 g의 황산 • 7H 2 O (1 ㎜), K 2 HPO 4 • 3H 희석 이 O 순수의 1 L에 (1.2 mM)을 (이 주식이 몇 주 동안 4 ° C로 유지 될 수있다) pH를 7.4로 조정한다. </li><li> 신선한 100 ㎕의 1 M 염화칼슘이 &amp; # 추가160 (1 ㎜), 2.5 ml의 200g / L의 스톡 농도 100 mL에 (0.5 % v / v)로 0.1 g 포도당 인간 알부민 (w 0.1 % / v)의 흐름 버퍼. 다음에, 0.45 μm의 필터를 사용하여 유동 완충액을 필터. 참고 :이 흐름 버퍼가 모든 실험에 대한 신선한 준비 할 필요가있다. </li><li> 이전 PMN의 분리로, PBS, pH가 7.4에서 10 % 트리 소듐 시트 레이트 (TNC) 솔루션을 준비합니다. </li><li> 건강한 지원자에서 나트륨 heparine의 vacuettes에서 전체 혈액의 20 ML를 수집합니다. 50 ml의 튜브에 10 % PBS / TNC로 1 피펫 20 ㎖를 ((g / ㎖ 1.130의 밀도가 물에 콜로이드 용액) w / w 23 %) 12.5 퍼콜 ml의에 신중하게 혈액을 희석 : 전체 혈액 1을 희석 새로운 50ml의 튜브. 조심스럽게 원심 분리기에서 튜브를 배치하고 800 낮은 가속 XG와 RT로 설정없이 휴식 20 분 동안 회전. 참고 : 퍼콜에 희석 된 혈액을 추가 할 때, 45 ° 각도에서 퍼콜 함유 튜브를 기울여 부드럽게 튜브 재치에 희석 된 혈액을 피펫시간 느린 피펫 소년 설정입니다. </li><li> 모든 액체를 제거하고 이후 500 mL에 얼음처럼 차가운 적혈구 용해 버퍼 (4.15 g NH 4 염소 [0.155 M], 0.5 g의 KHCO 3 [0.01 M] 18.5 mg을 EDTA (삼중 III) [0.1 밀리미터]와 튜브를 채우기 ) 얼음처럼 차가운 H 2 O의 적혈구를 용해한다. 서스펜션이 사용 바꿈 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리 500 XG에 이어 진한 빨간색을, 될 때까지, 때때로 반전 튜브, 얼음에 튜브를 둡니다. 참고 : 펠렛 부분은 적혈구와 함께 백혈구 (호중구, 호산구, 호염기구)가 포함되어 있습니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에 얼음처럼 차가운 용해 버퍼에 두 번 펠렛을 씻는다. </li><li> RT에서 유동 완충액으로 펠렛을 재현 탁하고 세포 또는 자동 혈구 계수기를 사용하여 백혈구 농도를 결정한다. 1 × 10 6 세포 / ml에서 흐름 버퍼의 백혈구를 일시 중단하고 실온에서 보관하십시오. </li></ol> 내피 분기점의 3 라벨링알은 VE-cadherin의 및 PECAM-1 <ol><li> 1에서 PECAM 알렉사 플 루어 647 항체 (클론 WM59)를 추가 : 1:50 희석 HUVEC에 배지 100 희석 칼슘 독립적 인 VE-cadherin의-FITC 항체 (클론 55-7H1), (단계 1.1 참조) 전에 생리 유동 조건 하에서 호중구 윤회 중에 내피 세포의 접합부 역학을 가시화 유동 실험을 시작하여 30 분 동안 배양한다. NOTE : 유동 챔버로 직접 표지 된 항체를 첨가하기 전에, 각 채널의 볼륨을 100 ㎕를 초과하지 않도록. 이것은 가능한 한 낮은 항체 비용을 유지할 수. </li></ol> 4 PMN TEM 분석에서 흐름 <ol><li> 이전 흐름 시스템으로 그들을 주입에 37 ° C에서 15 분 동안 물을 욕조에 백혈구를 놓습니다. </li><li> 일을 설정할 때 빈 흐름 챔버에 튜브를 연결하고 형성 방지하기 위해 (예를 들어, 37 ° C) 흐름 버퍼 따뜻한 (단계 참조 4.3) 채우기 공기 - 거품전자 흐름 시스템. </li><li> 20 ㎖ 주사기를 함유하는 실리콘 튜빙을 사용하여 주사기 펌프 유동 시스템에 빈 유동 챔버의 일측을 연결하고 현미경 스테이지로 유동 챔버 넣어. </li><li> 37 ° C의 흐름 버퍼 (그림 1B)로 가득 저수지 플라스크에 빈 흐름 챔버의 다른 쪽을 연결하고 흐름 버퍼 모든 튜브를 작성하기 위해 주사기 펌프를 시작합니다. 펌프는 주사기로 유동 챔버를 통해 저장조로부터 유출 버퍼를 당길 것이다. NOTE :이 튜브는 또한 흐름을 중지하고 기포를 생성하지 않고 백혈구가 실행 실험에 바늘로 주입 될 수있는 줄 루어 주입 포트를 포함한다. </li><li> TNF-α 처리 HUVEC를 포함하는 흐름 챔버와 빈 흐름 챔버를 교체 흐름 버퍼 함유 튜브를 연결하고 현미경 단계 (그림 1C)에 배치합니다. 분리했다 다시 연결하기 전에 튜브를 꼬집어핀치 오프하지 같이, HUVECs를 함유 챔버 m은 배관 및 / 또는 유동 챔버 내부에 기포의 형성을 초래할 수있다. </li><li> 후 모세관 세정맥에서의 생리 학적 유동 속도에 따라, 1 DYN / cm 2 흐름 속도를 조정 (1-5 DYN / cm 2). </li><li> 기록 미분 간섭 대비 (DIC), FITC (488 나노 미터)와 알렉사 플 루어 647 (647 나노 미터)을 동시에 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용. </li><li> 백혈구 1 ㎖의 주사기를 이용하여 인 - 라인 루어 주입구 (도 1D)을 통해 천천히 유동 시스템 (단계 4.1)을 주입한다. </li><li> 몇 분 후, 백혈구을 준수하고, transmigrate, 나타납니다. 흐름 챔버로 흐름 챔버와 피펫 정착액 (PBS에서 3.7 % 포름 알데히드)에서 튜브를 분리하여 원하는 순간에 실험을 중지합니다. 10 분 동안 고정을 허용, PBS로 세척 하였다. 데이터는 이미징 소프트웨어 (재료 및 장비 표 참조)를 사용하여 분석한다. NOTE : 37 ° C, 5 % CO 2에서 항온과 기후 챔버를 구비 한 공 초점 레이저 주사 현미경, 63X 및 실험에 사용한 그 시일 링 목적을 수행한다. </li></ol>

<ol>
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The authors have no competing financial interests.

이것은 세포 자멸사 및 파쇄 단층의 원인이되므로이 프로토콜의 경우, 이는, 유동 챔버의 기포 형성을 방지하는 것이 중요하다. 이를 방지하기 위해, 우리는 튜브가 흐름 챔버에 연결되어있는 단계 4.2 및 4.5에 특별한 관심을 지불 강조하고 싶습니다. 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 이전의 흐름 챔버 (단계 4.1)에 주입에 37 ° C에서 15 ~ 30 분을 배양하여 실온에서 보관하는 백혈구의 프라이밍이다. 이것은 그들이 같은 내피 세포에서 ICAM-1 또는 VCAM-1과 같은 부착 분자에 부착 할 수 있도록, 백혈구 인테그린 프라이밍의 결과. 이 프로토콜은 호중구의 윤회를 연구하기 위해 제한되지 않습니다. 이러한 단핵구 또는 림프구와 같은 또 다른 유형의 백혈구가 사용될 수있다. 백혈구의 종류에 따라 상이 할 수 백혈구를 프라이밍, 즉 해당 단계 4.1을합니다. 또한, 내피 세포의 다른 유형을 사용할 수있다. 이를 위해이 여전히 중요같은 TNF-α와 IL-1β 적절한 염증 자극으로 내피 세포를 자극한다. 호중구 transmigrating 응답하지 않으면, 하나의 N-포르 밀-L-메티 오닐-L-로이 실-L-페닐알라닌 (FMLP) 펩티드 16 호중구 간단히 (5 분) 처리 고려할 수있다. 이 내피 세포에 부착하기가 더 많은 경향이있어 더욱 특히 자신의 인테그린에, 호중구를 자극 할 것이다. 일반적으로 1 DYN / ㎝ 2 흐름 속도가 사용됩니다. 이 흐름 속도는 후 모세관 정맥, 대부분의 백혈구 transendothelial 마이그레이션 (17)를 발생 사이트로 측정됩니다. 설명한 플로우 챔버를 사용하면, 10 DYN / cm 2 유동 속도까지 증가시킬 수있다. 그러나, 더 전단을 증가하지 않는 것이 좋습니다. 이 흐름 챔버에서 세포의 튜브와 분리의 원치 않는 노출시키는 결과를 가져올 수 있습니다. 도 3에 설명 된 결과는 이러한 것을 나타항체는 시각화하고 백혈구 diapedesis 동안 내피 세포 - 세포 접합의 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 특히, 기존 윤회 분석법 이외에이 프로토콜은 실시간 흐름 생리적 조건 하에서 세포 횡단 이동부터 세포층을 구별 할 수있다. 항체는 세포 - 세포 접합을 얼룩 때문에, 하나는 / PECAM - 한 사이트-cadherin의를 VE 정이 대 VE-cadherin의 / PECAM-1 양성 접합을 교차 백혈구의 수를 점수 수 있습니다. 이 방법으로, 세포 횡단 마이그레이션은 세포층의 마이그레이션 구별 할 수 있습니다. 본 연구에서 사용 PECAM-1 항체가 상기 제 외 도메인에 대하여 지시한다 : 이들 항체들은 바인딩 단백질의 기능을 방해하지 않는 것을 강조하는 것이 중요하다. 항체는 적어도하지 않았다는 것을 시사 확산 또는 단일 층을 형성하는 결함을 나타내지 않았다 항체의 존재하에 도금 된 내피 세포,내피 세포 사이의 동형 상호 작용을 방해합니다. 그 외에도, 두 항체가 내피 단층으로 마이그레이션하는 호중구의 능력을 손상하지 않는다. 또한, 부재 또는 항체의 존재하에 내피 단층 걸쳐 transmigrate 호중구의 수 (데이터는 도시하지 않음)를 변경하지 않는다. 중요한 것은, 공 초점 레이저 주사 현미경은 우리에게 동시에 서로 다른 형광 채널 및 DIC를 기록 할 수있는 가능성을 준다. 호중구는 내피 세포 - 세포 접합을 교차하고 백혈구 세포 횡단 대 다른, 즉, 세포층을 통해 하나의 경로를 선택하는 이유를 이해하는 데 도움이 될 것입니다 경우에 따라서,이 분석은 동시에 VE-cadherin의 및 PECAM-1의 역학을 공부하고 있습니다.

효율적이고 엄격하게 제어 백혈구 transendothelial 마이그레이션 (TEM)은 이러한 면역 감시 및 급성 염증 생리 학적 과정의 핵심 중요하다. 그러나, 특정 병태 생리 조건 하에서, 제어되지 않는 과도 TEM 및 만성 염증성 질환 (예, 류마티스 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 천식)에서 얻어진 관찰된다. 종양 세포는 1-3 전이하는 순환을 떠나는 또한 종양 세포 전이 동안 transendothelial 마이그레이션 프로세스 수단이다. 구체적으로는 과도한 백혈구 또는 종양 세포 TEM을 방해하기 위해,이 프로세스의 상세한 규정의 이해가 필요하다. 그것은 TEM 프로세스가 여러 단계를 통해 발생하는 것으로 생각된다. 정육점 및 스프링에 의해이 수십 년 전에 검토 정액 연구는, TEM 4,5의 과정을 설명하는 다단계 모델로했다. 이 모델은 여전히​​ 광고하지만, 사실이 보유하고ditional 단계 6를 포함하고있다. 알론은 외. 내피 (7)의 표면에 고정화 케모카인의 존재에 대한 필요성을 설명했다. 최근에, 그들은 내피 세포 자체가 내피 선 단면 팔에서 발표하는 케모카인을 생성 것을 보여 주었다. 또한, 동일 그룹 TEM 7 중에 유동 조건의 중요성을 제안했다. 최근, 두 개의 서로 다른 노선의 백혈구에 초점을 맞춘 여러 서적은 TEM의 최종 diapedesis 단계에서 걸릴 수 있습니다. 그들은, 즉, 세포 - 세포 접합을 통해 세포층의 마이그레이션 경로를 이동하거나, 세포 횡단 마이그레이션 경로를 9로 알려진 내피 세포의 몸을 통해 통과 할 수 있습니다. 전차 승무원 및 동료에서는 이러한 경로를 공부하고 제대 정맥 내피 단일 층 (10)을 횡단 할 때 백혈구가 우선적으로 세포 횡단 노선 (10 %)를 통해 세포층의 마이그레이션 경로 (90 %)을 선택할 것을 결론을 내렸다.그러나, 다른 기원에서 내피 세포가 사용 된 때, 예를 들면, 뇌 미세 혈관보다 백혈구 세포 횡단 경로 (30 %) (11)을 사용했다. 이 VE-cadherin의 알파 - 카테닌에 대한 키메라 Vestweber 그룹은 최근 세포 - 세포 접합이 내생를 대체 노크 동물 모델을 사용하여 서로 해리 수 없습니다 때 VE-cadherin의를 보여 백혈구 TEM 완전히 12을 차단되었습니다 . 놀랍게도, 저자는 TEM 여러 차단, 전부는 아니지만, 조직 된 것으로 나타났습니다. 전반적으로,이 우아한 실험은이 결정을 트리거 규제 신호는 아직 알 수 있지만 백혈구, 세포 횡단 노선을 통해 세포층의 경로를 선호하는 것으로 나타났다. 백혈구의 대부분이 세포층 이동 경로를 선호한다하더라도, 그것은 두 경로를 구별하는 것은 여전히​​ 어렵다. 내피 세포 - 세포 junct의 역할에 초점을 맞추고 몇몇 연구에도 불구하고 그 외에있어서이온은 이러한 접합의 역학, 특히 접합부 단백질은 VE-cadherin의 및 PECAM-1, 백혈구 횡단 논쟁에서 여전히 동안. 우리는 이러한 접합 분자가 형광 표지 된 항체를 사용하여 유동 생리적 조건 하에서 백혈구 diapedesis 중에 실시간으로 모니터링 할 수있는 비교적 간단한 분석을 개발 하였다. 이러한 항체는 방해 또는 표적 단백질의 접합부 무결성이나 이동성을 차단하지 않았다. 이 분석은 우리가 세포층 TEM 과정에서 접합부 단백질의 역학을 수행 할 수 있습니다. 또한,이 분석은 또한 파라 및 세포 횡단 이동 경로 간의 판별한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:471px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:365px;">Company</td>
			<td style="width:184px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;-Slide VI</td>
			<td style="width:365px;">IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">80606</td>
			<td>Flow-chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Whatman/GE Lifesciences</td>
			<td style="width:184px;">10462100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:184px;">300013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD Discardit II</td>
			<td style="width:184px;">366296</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">21G needle&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Microlance</td>
			<td style="width:184px;">301155</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Sanquin</td>
			<td style="width:184px;">15522644</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Ammunium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1009245000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">449709</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:471px;">EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
			<td style="width:365px;">Lonza</td>
			<td style="width:184px;">CC-3156 + CC-4176</td>
			<td>media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">EDTA (Titriplex III)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1370041000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">352096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">F1141-2MG</td>
			<td>FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Glucose</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">G7528</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">HEPES</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3375</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">In-line Luer Injection port&#160;</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">10820</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">105886</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PECAM-1-ALEXA-647&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">561654</td>
			<td>clone WM59 
			stock concentration 0.1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">17-0891-09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:365px;">Fresenius Kabi&#160; Nederland</td>
			<td style="width:184px;">M090001/01NL</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P9541</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1048540500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P5504</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Silicone Tygon 3350 tubing</td>
			<td style="width:365px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">228-4331</td>
			<td>tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:365px;">Calbiochem (Millipore)</td>
			<td style="width:184px;">567441</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>model number 55-5920</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF&#945;&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Peprotech</td>
			<td style="width:184px;">300-01A</td>
			<td>tumor necrosis factor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trisodium citrate&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1.06447.5000</td>
			<td>TNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuettes</td>
			<td style="width:365px;">Greiner, Germany</td>
			<td style="width:184px;">980044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-Cadherin-FITC&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">560411</td>
			<td>clone 55-7H1</td>
			<td>stock concentration 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss LSM510 META&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Zen Software 2008</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

염증 동안 백혈구는 혈액 순환을 떠나 기본 조직에서 병원균 침입 싸울 내피 교차합니다. 이 과정은 백혈구 transendothelial 이주로 알려져있다. 내피 단일 층을 통과하는 백혈구에 대한 두 가지 방법으로 설명되었다 : 즉, 세포 - 세포 접합 및 세포 횡단 노선을 통해 세포층의 경로, 즉, 내피 세포의 몸을 통해. 그러나 파라 및 세포 횡단 경로를 구별하는 것은 기술적으로 곤란 하였다. 우리는 내생의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1을 생리 흐름 조건에서 호중구 transendothelial 마이그레이션하는 동안 공부를 할 수있는 간단한 체외 분석을 개발했다. 호중구 관류 이전에, 내피 세포 간단히 VE-cadherin의 및 PECAM-1에 대한 형광 표지 항체를 처리 하였다. 전기 세포 substra 의해 결정되었을 때 이러한 항체는, 두 단백질의 기능을 방해하지 않았다테 임피던스 감지 및 FRAP 측정. 이 분석을 사용하여, 우리는 내생의 분포가 흐름 조건에서 transendothelial 마이그레이션하는 동안 및 PECAM-1-cadherin의를 VE 및 내피 세포에서 백혈구의 파라와 세포 횡단 마이그레이션 경로를 구별 수행 할 수 있었다.

항체는 내피 세포의 장벽 기능을 방해하지 않은 경우 우리는 첫번째 테스트했다. 우리는 전기 세포 - 기질 임피던스 센서 (ECIS)를 사용하여 내피 세포 단일 층의 저항을 측정 하였다. 자세한 내용은 반 Buul 외. 13 항 VE-cadherin의 형광 표지 된 항체를 세포 (도 2A)를 첨가했을 때의 저항의 변화가 관찰되지 않았다 참조. 차단 잘 인식되고 항-VE 카드 헤린 항체 함수 극적 (도 2A)을 저항을 감소 VE-카드 헤린의. 또한,의 역학을 변경하지 않는 영상에 사용되는 항체는 VE-cadherin의를, 사진 표백 (FRAP) 후 형광 복구를 측정하여 평가 하였다으로 (그림 2B)-cadherin의-GFP를 VE. 1-2 분 후, 호중구는 DIC 채널 (그림 3A)에 시각화 할 수 있기 때문에 활성화 된 내피 세포 단일 층에 부착. 5-30 자체에 대한 크롤링 후C, 중성 백혈구의 대부분은 PECAM-1에 대항하는 항체로 표지 및 VE-cadherin의를 한 세포 - 세포 접합을 통해 내피 세포 단일 층을 통해 transmigrated. diapedesis의 과정에서의 분포 VE-카드 헤린 및 PECAM-1은 실시간 (도 3b)에 따랐다. 호중구 diapedesis의 부위에서, VE-cadherin의 국부적 교란 및 PECAM-1 이상의 고리 형 구조를 보였다. diapedesis 완료 후, 가까이 접합 VE-cadherin의 및 PECAM-1 명확하게 diapedesis의 사이트 (그림 3C)에 이전. 호중구는 내피 세포의 BASO - 측면에 도달하면 안티 PECAM-1 항체의 부품이 호중구의 표면에 검출되었다합니다. 그러나, 이는 내피를 건너로부터 호중구를 방지하지 않았다. 호중구 transendothelial 마이그레이션하는 동안 실시간으로의 관찰 역학 VE-cadherin의는 쇼와 동료에 의해 작업과 일치 하였다 사람공 초점 현미경을 사용하여, 보여 VE-cadherin의-GFP 형질 VE-cadherin의-GFP가 백혈구가 내피 세포 - 세포 접합 (14)를 교차 할 때 가로 방향으로 확산 내피 세포를. 스와와 동료 PECAM-1의 우리의 관찰을 강조하여도 작동합니다. 그들은 백혈구 통로에 측면 옆에, 즉 VE-cadherin의 확산을 보여 PECAM-1은 로컬 transmigrating의 호중구 (15) 주위에 반지에 재분배된다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> 관내 유량 용기에서 그림 1. (A)는 화살표 매체가 새로 고칠 필요가있는 저수지를 나타냅니다. 튜빙 (화살촉)를 분리하지 않고 백혈구 주입에 사용되는 인라인 루어 주입구로 유동 챔버를 연결하는 (B) 실리콘 호스. (C) 코네티컷37 ° C의 흐름 버퍼 (화살촉) 가득 저수지 플라스크에 빈 흐름 챔버의 ection. (D) 흐름 버퍼 함유 튜브에 TNF-α 처리 된 HUVEC과 흐름 챔버의 연결 및 현미경 단계 (화살촉)에 배치. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> 도 2는 VE-cadherin의 접합부 역학 또는 기능을 방해하지 않는 항체. (A) 내피 세포 단층 ECIS 임피던스를 이용하여 측정된다. Y 축은 옴의 임피던스를 표현하고, X 축은 시간의 시간을 나타낸다. 항체 cl75 (검은 선)을 차단-cadherin의 VE 반면, VE-cadherin의 항체 ALEXA647 (파란 선)으로 표시 복제 55-7H1, 또는 임피던스를 감소, 내피 세포 단일 층의 임피던스를 변경하지 마십시오의 IgG-ALEXA647 제어 (빨간 선) 않았다 이소 타입 . (B </stroNG&gt;)는 HUVEC에서 발현 된 GFP-카드 헤린은-VE와 공 촛점 현미경을 사용하여 FRAP 분석의 존재 또는 부재하에 형광 회복에 변화는 보이지 않았다 VE-cadherin의보기 55-7H1 항체. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> 도 3은 VE-카드 헤린 및 PECAM-1 분포를 실시간으로 호중구 TEM 중에. (A) 호중구가 내피에 부착 및 분포에 영향을주지 않고 세포 간 접합을 횡단 (흰색 선으로 표시) VE-카드 헤린 및 PECAM -1. (B) 호중구는 세포 - 세포 접합을 통해 내피 세포 단일 층을 건너. 의 로컬 분산 VE-cadherin의 호중구는 세포 간 접합을 통해 돌출 될 때 및 PECAM-1이 관찰 될 수있다. 화이트 라인은 내피 세포의 상단에 여전히 호중구의 존재를 보여줍니다. 노란색 선은 호중구 막 그쪽을 보여줍니다t는 내피 세포 아래에 이미 사용 중입니다. (C) 호중구가 완전히 내피 세포 단일 층을 교차하고있다. VE-cadherin의 및 PECAM-1 diapedesis의 사이트에 재배치된다. 노란색 선이 transmigrated 호중구의 테두리를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

real-time-imaging-endothelial-cell-cell-junctions-during-neutrophil

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Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Cell Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

19.4K 조회수.  Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam.  백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다. 

비디오: Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Leukotriene B의 실시간 영상 4 중재 셀 마이 그 레이션 및 β - arrestin로 BLT1 상호 작용

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

골수 세포 역학의 실시간 영상<em&gt; APC<sup&gt; 최소 / +</sup</em&gt; 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...