이 프로토콜은 전립선 오르가노이드 배양에서 약리학적 반응을 평가하는 표준적이고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 전립선 오르가노이드 배양은 세포가 지하 막 매트릭스에서 3차원 구조를 채택할 수 있도록 함으로써 생체 내 생물학 및 약리학적 반응의 많은 측면을 보존하는 체외 시스템을 제공합니다. 우리는 특히 유전자형이 전립선에서 약리학적 반응을 지시하는 방법을 평가하고 약물 내성을 모델링하기 위해 이러한 방법을 사용하는 것에 대해 매우 기쁘게 생각하고 있습니다.
이러한 방법은 돔 도금 방법을 사용하는 오가노이드 배양 시스템에 적용될 수 있다. 그러나, 성장인자 등의 매체의 성분은 조직 유형에 따라 다를 수 있다. 시각적 데모는 프로토콜 단계와 연구자가 사용할 수있는 다른 많은 출판 된 오르가노이드 문화 시스템과 어떻게 다른지에 대한 보다 구체적이고 상세한 토론을 할 수 있습니다.
오르가노이드 배양은 전형적으로 2차원 세포 배양보다 시간이 더 많이 소요된다. 이러한 메서드에 대한 추가 시간을 할당해야 합니다. 마우스 또는 인간 조직에서 전립선 오르가노이드를 분리하여 시작합니다.
단 하나 세포 현탁액을 생성하기 위하여 조직을 mince 및 효소로 소화한 다음 5 분 동안 300 배 g에서 원심분리에 의해 세포를 수집합니다. 세포를 계산하고 지하 막 매트릭스에서 다시 중단합니다. 그런 다음 미리 따뜻워진 오르가노이드 배양 판에 매트릭스 돔에서 적절한 밀도로 플레이트를 놓습니다.
돔은 서로 떨어져 있고 우물의 측면에서 2 밀리미터여야합니다. 일단 고형화되면 매트릭스를 방해하지 않도록 우물 옆에서 미디어를 부드럽게 추가합니다. 돔이 굳어진 후 돔 위에 미디어를 추가하여 완전히 덮어두게 합니다.
표준 계수 방법으로 셀 수를 결정하는 다운스트림 응용 프로그램에 대해 원하는 수량으로 오르가노이드를 증가시면 됩니다. 오르가노이드를 사용할 준비가 되면 Pten00 파이펫으로 매체를 작성하고 파이펫을 위아래로 사용하여 지하 막 매트릭스를 방해합니다. 서스펜션을 15밀리리터 원물 튜브와 원심분리기로 5분 간 300배 g로 옮긴다.
슈퍼 나티퍼를 흡인하고 PBS의 5 밀리리터로 셀 펠릿을 씻으십시오. 원심분리를 반복한 다음, 펠릿을 트립신 교체의 4밀리리터로 재연한 다음 섭씨 37도에서 흔들면서 5~10분 동안 소화할 수 있도록 합니다. 10%의 FBS로 동일한 양의 오르가노이드 배지를 추가하여 트립신 교체를 억제하고 5분 동안 300배 g의 원심분리기를 사용한다.
슈퍼 나티퍼를 흡인하고 PBS의 1 밀리리터에서 세포를 재일시 중단합니다. 그런 다음 세포를 40 마이크로미터 필터로 변형하여 단일 세포 현탁액을 보장하고 혈종계를 사용하여 셀을 계산합니다. 10 마이크로몰러 로 키나제 억제제 Y27632와 함께 오르가노이드 배지를 사용하여 10 마이크로리터 당 100 세포로 세포 현탁액을 희석시 희석시.
새로운 원물 튜브에 1, 100 세포를 전송하고 70 %의 매트릭스 농도를 초래할 것이다 지하 막 매트릭스의 285 마이크로 리터를 추가합니다. 다음으로, 미리 따뜻진 24웰 플레이트에서 매트릭스 돔의 35 마이크로리터에 세포를 시드하여 샘플당 3~5개의 복제를 플레이트에 플레이트에 놓습니다. 플레이트를 뒤집어 셀 인큐베이터에 배치하여 지하 매트릭스를 고화시합니다.
10분 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 로 키나아제 억제제가 함유된 배지를 추가합니다. 2일마다 배지를 새로 고치고 7일 후에돔에 설정된 오르가노이드의 수를 계산하고 총 세포 수에서 형성된 오르가노이드의 백분율을 계산합니다. 앞서 설명한 바와 같이 오르가노이드를 격리한 후, 종자 1, 000 에서 100, 000 세포는 최종 세포 수를 결정하기 위한 프록시로서 오르가노이드 형성 효율 및 성장 속도를 사용하여 매트릭스 돔에서 종자 1, 000 에서 100 세포.
그런 다음 24 웰 플레이트에 매트릭스 돔의 35 마이크로 리터를 씨앗과 돔이 고화하자. 로 키나제 억제제 및 선택 약물을 함유하는 배지를 추가합니다. 로그(10)를 증분하여 약물이 대조군으로 용해된 차량을 사용하여 반 최대 억제 농도를 결정한다.
매 2~3일마다 배지를 새로 고치고 7일째에 오르가노이드를 분석하여 원고에 설명된 바와 같이 세포 생존성 분석을 수행하여 약물에 대한 약리학적 반응을 결정한다. 트립시화 없이 오르가노이드 조각을 플레이트하려면 Pten00 파이펫을 사용하여 중간 및 파이펫을 위아래로 흡인하여 지하 막 매트릭스를 방해합니다. 매트릭스가 완전히 중단되면 서스펜션을 15 밀리리터 원물 튜브및 원심분리기로 5분 동안 300배 g로 옮긴다.
슈퍼네티를 흡인하고 PBS의 5 밀리리터를 추가합니다. 세척 후, PBS의 1 밀리리터로 오르가노이드를 다시 중단하고 유리 파스퇴르 파이펫으로 트리튜레이션으로 오르가노이드를 방해합니다. 이전에 설명한 바와 같이 100개의 조각으로 복제된 오르가노이드 조각과 종자 5의 수를 정량화한다.
7 일 후, 원고 방향에 따라 세포 생존 성 분석작업을 수행한다. 야생형 전립선기세포는 발광세포에 비해 우수한 오르간구형성을 보였다. 바구지 형성의 사소한 증가는 CRISPR-Cas9 매개 펜 또는 P53의 손실과 추가 증가 된 형성 용량의 손실로 달성되었다.
성장에 항 안드로겐 분자의 효과 다른 유전자형을 가진 뮤린 오르가노이드에서 테스트 되었다. P53의 손실은 항 안드로겐 분자에 저항을 일으키지 않았다, 하지만 Pten의 손실 증가 저항. 그러나 P53과 Pten의 이중 손실은 완전한 저항을 초래했습니다.
안드로겐 수용체 억제는 또한 표현형을 변경했습니다. 야생형 Pten 삭제 및 P53 삭제 된 오르가노이드는 오르가노이드 루멘 크기의 감소를 입증했으며 Pten과 P53모두의 손실을 입은 오르가노이드는 일반적으로 영향을받지 않았습니다. 예상대로, 이 세포가 측면에 피하로 이식되었을 때, 이중 삭제 된 Pten 및 P53 오르가노이드만 증가했습니다.
2개의 명백한 인간적인 전립선암 오르간성 MSKPCA2 및 MSKPCA3는 항 안드로겐 분자에 그들의 반응을 위해 시험되었습니다. MSKPCA2 오르가노이드의 증식은 MSKPCA3 오르가노이드가 영향을 받지 않은 반면 강하게 억제되었습니다. MSKPCA2는 안드로겐 수용체와 FKBP5뿐만 아니라 특징 발광 단백질의 높은 수준을 표현했다.
MSKPCA3는 또한 기저 및 중간엽 마커를 표현하고 FKBP5의 아무 표현도 보여주지 않으며, 이러한 오르가노이드가 비 발광 안드로겐 독립적 표현형을 모델링한다는 것을 시사한다. 오르가노이드는 실행 가능한 유지하기 위해 유리 파이펫으로 트립시화 또는 트리튜팅에 의해 주기적으로 중단될 필요가 있습니다. 주파수는 종 기원과 유전자형에 따라 달라집니다.
모든 유형의 차세대 염기서열 분석 또는 프로테오믹스 실험은 설명된 절차에 따라 수행될 수 있다. 이 실험은 표현형 및 약리학적 반응의 분자 기초를 조사할 것입니다. 이 3 차원 오르가노이드 배양 기술은 연구원이 체외에서 고도로 통제된 유전 적 맥락에서 약리학적 반응을 연구할 수 있게 합니다.
이것은 생체 내 연구에서 긴 에 대한 신뢰할 수있는 대안이 될 수 있습니다.
