이 프로토콜은 미국 바퀴벌레를 연구하는 간단한 방법을 제공합니다. 일반적인 위생 해충과 전통 중국 의학에 유익한 곤충. 그것은 특정 유전자를 무너 뜨림으로써 미국 바퀴벌레의 여러 생명 활동의 분자 메커니즘을 탐구하는 데 도움이 될 것입니다.
이 기술의 가장 큰 장점은 미국 바퀴벌레 또는 유전자 편집에 적합하지 않은 다른 유사한 곤충의 유전자를 무너 뜨릴 수 있다는 것입니다. 이 기술은 유전 및 후성 유전 학적 조절, 조직의 발달 과정, 부속기의 재생, 짝짓기 행동 및 미국 바퀴벌레의 다른 흥미로운 측면과 같은 다양한 분야를 탐구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 작동하기 쉽고 다재다능합니다.
DSRA 주사 치료 중에 동물을 건강하게 유지하는 것이 좋습니다. 초보자는 여러 연습 세션 후에이 기술을 쉽게 습득 할 수 있다고 생각합니다. 시작하려면 부화 한 님프를 네 밀리미터 조리개 체로 oothecae에서 분리하십시오.
유리 튜브가있는 흰색 갓 맥아 P.americana를 골라냅니다. P.americana를 새 용기에 넣고 올바른 치료 단계를 기다립니다. 반응 시스템에서 10 마이크로리터의 T7 2X 완충액, 2 마이크로리터의 T7 익스프레스 효소 믹스 및 2마이크로그램의 PCR 생성물을 첨가한다.
마지막으로, 이중 증류수로 총 부피를 20 마이크로 리터로 구성하십시오. 수동으로 부드럽게 거꾸로 섞어서 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양 한 다음 섭씨 70도에서 10 분 동안 배양하십시오. 마이크로리터 RNase A 용액 당 4 마이크로그램을 DEPC 물로 1 내지 200의 비율로 희석한다.
그런 다음 마이크로리터 당 1 마이크로리터의 RQ1 RNase 프리 드나제 및 희석된 RNase A 용액 1 마이크로리터를 시스템에 첨가한다. 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 아세트산 나트륨의 총 부피의 10 %와 이소프로판올의 총 부피의 세 부피를 첨가하십시오.
수동으로 거꾸로 부드럽게 섞은 다음 얼음 위에 5 분 동안 놓고 섭씨 4도에서 10 분 동안 13, 000g에서 원심 분리하십시오. 피펫으로 상층액을 제거하십시오. 다음으로, 잔류물을 75% 에탄올, 25% DEPC 처리수로 세척한 다음, 섭씨 4도에서 5분 동안 13, 000 g에서 원심분리한다.
상층액을 다시 제거하고, 펠렛을 실온에서 15분 동안 공기 건조시킨다. 그런 다음 이중 가닥 RNA를 약 100 마이크로리터의 DEPC 물로 용해시키고 마이크로리터 당 2 마이크로그램의 최종 농도로 희석한다. 미세 주입 펌프에 프로그램을 설정하여 각 주입의 부피가 일정한지 확인하십시오.
그런 다음 주사기를 DEPC 물로 8 ~ 10 번 채워서 청소하십시오. 마이크로 주입 펌프에 10 마이크로 리터 주사기를 설치하십시오. 그런 다음 펌프를 시작하고 주사기를 10 마이크로 리터의 이중 가닥 RNA 용액으로 채 웁니다.
바퀴벌레를 이산화탄소로 마취 한 다음 핀셋으로 부드럽게 집어 들고 바퀴벌레를 손으로 바늘쪽으로 전달하십시오. 다음으로, 표피에 대해 수평으로 두 개의 복부 소마이트 사이의 틈을 통해 바늘을 삽입하십시오. 바퀴벌레에 이중 가닥 RNA 용액을 주입하여 바늘 끝이 표피에 최대한 가까워 내부 장기가 손상되지 않도록하십시오.
마지막으로, 바늘 끝을 당깁니다. 주입 된 바퀴벌레를 깨끗한 생물 분석 용기에 넣으십시오. 이산화탄소의 영향으로부터 회복 할 수 있도록 약 10 ~ 20 분 동안 기다리십시오.
용기에 주사 날짜, 이중 가닥 RNA의 유형 및 복용량 및 P.americana의 나이를 표시하십시오. Ddc 또는 DOPA 데카르복실라제 및 Dpp 또는 데카펜타플레기 유전자는 이중 가닥 RNA 주사 후 맥아 바퀴벌레의 표현형을 관찰하기 위해 두 가지 예로서 선정하였고, 동물에서 표적이 없는 dsMocK를 음성 대조군으로 취하였다. RNAi 효율을 qRT PCR에 의해 검출하였다.
유전자는 dsDdc에 대해 0.01 미만, dsDpp에 대해 0.05 미만의 P 값으로 유의하게 녹다운되었다. 녹다운 Ddc 유전자를 가진 P.americana는 막힌 멜라닌화로 인해 흰 표피를 가졌다. dsDpp 주사를 사용한 실험에서, RNAi는 사지 재생을 방해했다.
곤충은 건강해야하며 해를 끼치 지 않고 주사해야합니다. 이 기술은 미국 바퀴벌레와 같이 유전자 편집 할 수없는 곤충의 유전자 기능을 탐구하는 간단한 방법을 제공합니다.
