Name: in vivo evaluation of fracture callus development during bone healing in mice using an mri-compatible osteosynthesis device for the mouse femur
Uploaded: 2017-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur at JoVE.com

우리는 우수한 기술 지원에 대 한 Sevil Essig, 스테파니 치유력이, 레나 피셔, 카 차 Prystaz,이 본 Hägele, 및 앤 Subgang 감사합니다. 우리는 또한 독일 연구 재단 (CRC1149, INST40/499-1)와 AO 외상 기초 독일이이 연구 자금에 대 한 감사 합니다.

모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 국제 규정을 준수 하 고 (제 1250, Regierungspräsidium 튀빙겐, 독일) 지역 규제 당국에 의해 승인 했다. 모든 마우스 10 h 어두운 circadian 리듬 물과 음식을 제공 광고 libitum 14 h 빛에 감 금 소 당 2 ~ 5 동물의 그룹에서 유지 되었다.
 1. 수술 재료 및 쥐의 치료 전 준비 <ol><li>Sterilize 모든 수술 재료. 120-135 ° C의 압력가 마로 소독 온도 사용 하 여 살 균 시간 20-30 분.</li>
	<li>구매 C57BL/6 마우스 또는 몸 무게의 19-35 g 사이 다른 스트레인에서 쥐. 적절 한 동물 보호 및 조사에 의해 승인 되는 국가 지침 서에 따라 실험 프로토콜에 따라 &#39; s 기관 동물 관리 및 사용 위원회. 절차를 시작 하기 전에 7 일 순응 기간의 최소 허용.</li>
	<li>3 수술 날까지 수술 전에 1 일 식 수를 통해 모든 마우스 진통 제공.</li>
</ol> 2. 수술 절차 및 응용 프로그램의 외부 Fixator <ol><li>장소 5-7 %isoflurane 및 60 mL/min 산소 튜브로 마우스 탑재. 자세 반사의 손실, 후에 마 취 유도 관에서 마우스를 제거 하 고 제공 하는 1-3 %isoflurane 및 60 mL/min의 산소 흡입 마스크를 통해 마 취를 유지 합니다.
	마 취 중의 <ol><li>모니터 호흡 패턴 및 뒷 다리 발 반사 호흡 속도 약 100 사이클/분 하 고 뒷 발 반사 이다 결 석. 
		&#8203; 참고: 필요로 하는 가스의 양을 나이, 성별, 체중, 및 마우스의 변형에 따라 달라 집니다.</li>
	</ol></li> <li>수술 전에 주입 마우스 항생제의 단일 투여와 피하 (clindamycin, 45 mg/kg). 또한, 생리 유체 균형의 유지 보수, 500 µ L 염 분의 피하 유체 디포 마우스 주입 (0.9 %NaCl).</li>
	<li>막 방지 하기 위해 건조, 마우스 눈 눈 연 고를 적용 됩니다. 마 취 동안 37 ° C에서 난방 접시에 마우스를 배치 하 고 생리 유지 하기 위해 수술 신체 온도.</li>
	<li>오른쪽 뒷 다리에서 모피를 제거 하 고 알코올 기반의 소독 제와 수술 영역을 문질러. 오른쪽 뒷 발 unsterile 지역을 피하기 위해 멸 균 장갑의 작은 부분을 커버. 오른쪽 뒷 다리를 세 번 치료. 외과 영역 제외한 전체 마우스 살 균 드 레이프 장소.</li>
	메스와 오른쪽 대 퇴 골의 앞쪽 측에 따라서 경도 <li>절 개 피부 약 1 cm. 별도 퉁 명 스럽게 엠 팔 뚝 femoris와 m. vastus lateralis 마이크로 시저 및 집게. 뼈의 anterolateral 부분에 무료로 액세스할 수 있도록 마이크로 시저와 대 퇴 골 trochanter에 힘 원점 쪽을 잘라. 좌 골 신경 유지 됩니다 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>외부 fixator (3 N/mm, 그림 1 A의 축 강성) 대 퇴 골에 평행 하 게 배치합니다. 수동으로 0.45 m m 드릴 비트와 함께 피 질을 통해 시추공 훈련과 시추공에 핀을 장착 하는 세라믹을 배치. 가장 말 초 핀 뒤 가장 근 위 핀과 2 개의 핀 사이 시작 합니다.
	<ol><li>는 긴장, 압축, 또는 전단 응력에는 fixator 장착 절차 동안 그렇지 않으면 달성된 뼈 격차는 fixator의 이완으로 인해 충분 한 되지 것입니다 있는지 확인 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>절단 절차 동안 탈수를 피하기 위해 무 균 NaCl의 작은 양의 뼈 축이다.</li>
	<li>만들 0.4 m m 질 리 와이어 톱을 사용 하 여 두 내부 핀 사이 전체 뼈를 통해 서 0.4 m m 뼈. 
	참고: 필요에 따라, 진동 마이크로 보고 사용할 수 있습니다는 뼈를 만드는 데. 뼈 지역에서 본에서 어떤 금속 칩을 피하기 위해 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>두 골절된 외피가 사이 뼈 칩을 제거 하는 살 균 NaCl의 2 mL와 함께 신중 하 게 뼈 간격 플러시.</li>
	<li>Resorbable 봉합으로 연속 봉합 사를 사용 하 여 근육을 적응 (재료의 표 참조). 다음 중단된 비 resorbable 봉합 (재료의 표 참조)를 사용 하 여 피부를 적응. 상처 물고를 방지 하려면 배치 하지 마십시오 봉합 상처의 두개골 부분에. 
	참고: 피부 접착제를 사용 하지 마십시오 또는 클립 마우스 일반적으로 상처 발생에서 그것을 제거 하는 때문에, 더 피부를 손상.</li>
	<li>살 균 제와 수술 영역을 청소 하 고 마우스의 케이지. 모니터 마우스 그리고 공급 충분 한 열 (예: 적외선 빛) 때까지 완전히 깨어. 물, 음식 섭취 량과 몸 무게를 수술 후 모니터링 동물 통증과 고통을 하지 있는지 확인 합니다. 3 수술 날까지 식 수를 통해 모든 마우스 진통 제공. 
	참고: 마우스 최대 4 개의 동물의 그룹에서 지 내게 될 수 있습니다.</li>
	<li>모니터 마우스 &#39; 수술 후 1 ~ 5 일에 s 활동. 그 시간 과정, 마우스는 운영된 다리에 체중을 부담 한다. 그렇지 않으면, 마우스 추가 분석에서 제외 해야 합니다.</li>
</ol> 3. Mri 검사 절차 및 이미지 분석 <ol><li>이전 절차, 스캔 MRI에 2.1, 2.3, 단계에서 프로토콜에 따라 마우스를 anaesthetize 하 고 계속 호흡 속도 약 100 사이클/분의 오른쪽 뒷 다리에 외부 fixator를 삽입 합니다 주문 품 장착 장치 ( 그림 1 B, C)에 신중 하 게 마우스.
	<ol><li>이후이 골절 치유를 방해할 수 있습니다 절곡 또는이 단계는 fixator의 압축을 피하기 위해 있는지 확인 합니다. 
		참고: MRI 검사는 동물 보호와 실험 프로토콜에 따라 수술 후 3 일 지휘 될 수 있다.</li>
	</ol></li> <li>MRI 장치 도입에 대 한 온도 제어 요람에 마우스를 놓습니다. 4 소자 헤드 코일에 단단하게 장착 장치를 연결.</li>
	<li>11.7 토니에서 전용된 높은 필드 작은 동물 MRI 시스템을 사용 하 여 취득 MRI 데이터 
	&#8203; 참고:는 MRI 데이터 수집 형상을 직교 나사에 대 퇴 골 뼈에 맞춰집니다.
	양성자 밀도 지방 억제 멀티 슬라이스 TSE 시퀀스 (PD-TSE)을 적용 하 여 <ol><li>취득 데이터 수집 매개 변수를 사용 하 여: 에코/반복 시간 테 5.8 ms/TR = 2500 ms, 해상도 Δr = 52 × 52 × 350 µm³, 보기의 필드 (FOV) = = 20 × 20 m m ², 그리고 대역폭 Δω = 150 KHz.</li>
		<li>참고: 22 조각 총 수집 시간은 36 분</li>
	</ol></li> <li>이미지 분석 소프트웨어와 함께 수집 된 데이터를 엽니다. 0.35 m m 3 x 0.05 x 0.05로 복 크기를 입력 합니다. (뼈, 연골, 섬유 조직/골) 골절 굳은 살에 다른 조직 같이 반자동 임계 처리를 가진 그들의 강도에 따라 세그먼트.
	<li>클릭 <ol>는 &#34; 새로운 레이블 필드 편집 &#34;, 클릭 &#34; 추가 자료 &#34;, 자료를 이름을 바꿉니다 &#34; callus &#34;. 사용 하 여과 포 강렬한 신호에 따라 주변 조직에서 굳은 살 지역 구분은 &#34; 올가미 &#34; 도구.</li>
		<li>클릭 &#34; 자료에 추가 &#34;. 클릭 &#34; 추가 자료 &#34; 자료를 이름을 바꿉니다 &#34; 연골 &#34;. 연골을 사용 하 여 세그먼트는 &#34; 임계값 &#34; 도구 및 &#34; 현재 자료만 선택 &#34;에서 &#34; callus &#34;. 클릭 &#34; 연골 &#34; 및 &#34; 물자에 추가 &#34;. 이러한 단계를 반복 하 여 &#34; 뼈 &#34; 및 &#34; 골/섬유 조직 &#34;.</li>
	</ol></li> <li>이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 조직 세분화 데이터에 따라 골절된 화관의 3D 개조를 생성. 클릭 &#34; 생성 표면 &#34;, 적용 &#34; 없음 &#34; 위한 &#34; 부드럽게 유형 &#34; 클릭 합니다 &#34; 표면 보기 &#34;. 
	참고: 매우 작은, 하이퍼 강렬한 분야는 en을 둘러싼골절된 외피가의 ds 뼈에서 부드러운 조직 전환으로 유물을 될 가능성이 있습니다. 이 지역 추가 분석에서 제외 해야 합니다. 골절 중간 하이퍼 강렬한 지역 callus 대표 연골 조직 치유 골절의 endochondral 단계. Endochondral 나오고 단계에서 뼈 간격에서 골절 굳은 살 원심 hypo-강렬한 지역 및 전체 골절 굳은 살 나중 치유 단계에 걸쳐 동일한 강도 영역 새로 형성된 된 뼈 굳은 살 조직을 나타냅니다. 이 분야는 hypo 강렬한 신호, 성숙한 뼈 (피 질)에서 신호 강도 더 낮은. 임계 처리 후 골절 굳은 살의 연골 조직과 뼈 조직에 대 한 신호 강도 표시 골으로 나머지 조직과 섬유 조직. 조직 세분화에 대 한 값: 뼈 조직 (를 포함 하 여 성숙 피 질, 배수 뼈와 뼈의 굳은 살 조직) 1-3.3 (성숙 피 질 정규화 된 신호 강도)의 범위 내에서 세그먼트는 3.4-5.4의 범위 내에서 골 수/섬유 조직 및 5.5-6.2의 범위 내에서 연골 굳은 살 조직.</li>
	<li>필요한 경우 MRI 스캔 경도 동안 반복 골절 치유 과정. 연골이 굳은 살 개발 모니터링, 10, 14, 그리고 21 일 수술 후에 마우스를 스캔. 
	참고: 시간 포인트 동물 관리 및 실험 프로토콜에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
</ol>

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저자 로마노 Matthys RISystem AG 다보스, 스위스는 임 플 란 트를 생산 하 고이 문서에서 사용 되는 특정 악기 임 플 란 트의 직원입니다. 다른 모든 저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

수정 및 문제 해결:
이 연구의 주요 목표를 사용 하 여 MRI 호환 외부 fixator의 마우스에 대 퇴 골 뼈에 대 한 경도 endochondral 골절 치유 과정 동안 굳은 살 조직 개발을 모니터링 하는 기능에 대 한 프로토콜을 설명 했다. 외부 fixator의 삽입에 대 한 주문 품 장착 장치 디자인 반복된 검사 하는 동안 표준된 위치를 보장합니다. 자동 조직 세분화 골절 굳은 살에 섬유, 연...

2 차 골절 치유 뼈 치유의 가장 일반적인 형태입니다. Ontogenic endochondral 나오고1,2,3의 특정 측면을 흉내 낸 복잡 한 과정 이다. 주로 초기 골절 혈은 면역 세포과 립 및 섬유 조직 구성 됩니다. 낮은 산소 긴장 및 높은 biomechanical 긴장 골절 간격에서 osteoblast 차별화를 방해 하지만 chondrocytes4,,56으로 조상 세포의 분화를 촉진. 이러한 셀 골절된 뼈의 초기 안정성을 제공 하는 연골 매트릭스를 형성 하는 상해의 사이트에 확산 하기 시작 합니다. 굳은 살 성숙 동안 chondrocytes hypertrophic, 되 받을 apoptosis, 또는 트랜스-osteoblasts로 분화. 연골 뼈 전이 영역에서 Neovascularization 제공 높은 산소 수준, 뼈 조직7의 형성. 뼈 분쇄 갭의 다리, 후 biomechanical 안정성 증가 하 고 외부 골절 굳은 살의 osteoclastic 개장 생리 뼈 윤곽 및 구조3을 얻을 수 발생 합니다. 따라서, 골절 굳은 살에 섬유, 연골, 뼈 조직 양의 뼈 치유 과정에 대 한 중요 한 정보를 제공 합니다. 굳은 살 조직 개발 모두 인간과 쥐8,9,,1011의 변경에 의해 방해 또는 지연 치유 표시 됩니다. 경도 연구 작은 동물을 사용 하 여 치료 전 임상 골절에 굳은 살 조직 개발 모니터링 기술을 사용할 수 비보에 디지털 방사선 및 µCT12,13이미징 포함 됩니다. 그러나, 두 기법 및 비 mineralized 광물 화 된 조직 사이 차별 수만 있습니다. 반면, MRI 우수한 연부 조직 대조를 제공 하 고 따라서 부드러운 조직과 연골 골절 굳은 살에 확인할 수 있을 수 있습니다.
이전 작업 intramembranous 뼈-결함 치유15동안 쥐에 사후 MRI 쥐에서 관절 골절14 그리고 vivo에서 MRI를 위한 유망한 결과 보여주었다. 그러나, 두 연구는 또한 제한 된 공간 해상도 조직 대비를 밝혔다. 우리는 이전 murine endochondral 골절 치유16동안 부드러운 굳은 살 형성의 경도 평가 대 한 고해상도 vivo에서 MRI의 타당성을 설명 했다. 여기, 우리는 굳은 살 조직 개발 endochondral 골절 치유 과정 동안 경도 모니터 하기 위해 쥐의 대 퇴 골 뼈에 대 한 MRI 호환 외부 fixator를 사용 하기 위한 프로토콜을 보고 합니다. 외부 fixator의 삽입에 대 한 주문 품 장착 장치 디자인 반복된 검사 하는 동안 표준된 위치를 보장합니다.

<table><tbody><tr><td>Anaesthesia tube</td><td>FMI, Seeheim, Germany</td><td>ZUA-82-ANA-TUB-Mouse</td><td></td></tr><tr><td>Anaesthetic machine&amp;nbsp;</td><td>FMI, Seeheim, Germany</td><td>ZUA-82-GME-MA</td><td></td></tr><tr><td>Artery forceps&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BH104R</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Systec, Wettenberg, Germany</td><td>DX-150</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaving packaging</td><td>Stericlin, Feuchtwangen, Germany</td><td>2301-04/06/10/12/16</td><td></td></tr><tr><td>Avizo software</td><td>FEI, Burlington, USA</td><td>-</td><td>Version 8.0.1</td></tr><tr><td>BioSpec 117/16 magnetic resonance imaging system</td><td>Bruker Biospin, Ettlingen, Germany</td><td>117/16</td><td></td></tr><tr><td>Bulldog clamp&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BH 021R</td><td></td></tr><tr><td>Carbon steel scalpel no. 11/15</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BA211/215</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic mounting pin 0.45 mm&amp;nbsp;</td><td>RISystem, Davos, Switzerland</td><td>HS691490</td><td></td></tr><tr><td>Clindamycin (300 mg / 2ml)</td><td>Ratiopharm, Ulm, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Dressing forceps 115 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BD210R</td><td></td></tr><tr><td>Dressing forceps 130 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BD025R</td><td></td></tr><tr><td>Drill bit coated 0.45 mm&amp;nbsp;</td><td>RISystem, Davos, Switzerland</td><td>HS820420</td><td></td></tr><tr><td>Durogrip needle holder 125 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BM024R</td><td></td></tr><tr><td>Foliodrape&amp;nbsp;</td><td>Hartmann, Heidenheim, Germany</td><td>2513026</td><td></td></tr><tr><td>Frekaderm</td><td>Fresenius, Bad Homburg, Germany</td><td>4928211</td><td></td></tr><tr><td>Gigli saw 0.44 mm&amp;nbsp;</td><td>RISystem, Davos, Switzerland</td><td>RIS.590.110.25</td><td></td></tr><tr><td>Hand drill</td><td>RISystem, Davos, Switzerland</td><td>RIS.390.130-01</td><td></td></tr><tr><td>Heating plate&amp;nbsp;</td><td>FMI, Seeheim, Germany</td><td>IOW-3704</td><td></td></tr><tr><td>Hygonorm gloves&amp;nbsp;</td><td>Hygi, Telgte, Germany</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbot, London, UK</td><td>Forene</td><td></td></tr><tr><td>Micro forceps 155 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BD343R</td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors 120 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>FD013R</td><td></td></tr><tr><td>Mouse FixEx L 0.7 mm&amp;nbsp;</td><td>RISystem, Davos, Switzerland</td><td>RIS.611.300-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle case for drills&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BL911R</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BB078R</td><td></td></tr><tr><td>Octenisept</td><td>Sch&amp;uuml;lke, Norderstedt, Germany</td><td>121403</td><td></td></tr><tr><td>Osirix software</td><td>Pixmeo SARL, Bernex, Switzerland</td><td>-</td><td>Version 4.0</td></tr><tr><td>Oxygen, medical grade</td><td>MTI, Ulm, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Resolon 5/0</td><td>Resorba, N&amp;uuml;rnberg, Germany</td><td>88143</td><td></td></tr><tr><td>Saline 0.9%</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>3570350</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle 125 mm</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BB073R</td><td></td></tr><tr><td>Scissors 150 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BC006R</td><td></td></tr><tr><td>Sealer for autoclave packaging&amp;nbsp;</td><td>Hawo GmbH, Obrigheim, Germany</td><td>HM500</td><td></td></tr><tr><td>Sterican 27 G&amp;nbsp;</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Sterile surgical blades no. 11/15&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>BB511/515</td><td></td></tr><tr><td>Surgical gloves&amp;nbsp;</td><td>Hartmann, Heidenheim, Germany</td><td>Peha-micron 9425712</td><td></td></tr><tr><td>Surgical light&amp;nbsp;</td><td>Maquet SA, Ardon, France</td><td>Blue line 80</td><td></td></tr><tr><td>Syringes 5 ml&amp;nbsp;</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>Injekt 4606051V</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps 80 mm&amp;nbsp;</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td><td>OC091R</td><td></td></tr><tr><td>Tramadol 25 mg/l</td><td>Gr&amp;uuml;nenthal, Aachen, Germany</td><td>100mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Vasofix Safety&amp;nbsp;</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4268113S-01</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 5-0&amp;nbsp;</td><td>Ethicon, Norderstedt, Germany</td><td>V30371</td><td></td></tr><tr><td>Visdisic eye ointment&amp;nbsp;</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb, Berlin, Germany</td><td>3099559</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo evaluation of fracture callus development during bone healing in mice using an mri-compatible osteosynthesis device for the mouse femur

Endochondral 골절 치유 골절 굳은 살에 섬유, 연골, 뼈가 있는 직물의 개발을 포함 하는 복잡 한 공정 이다. 다른 조직에는 굳은 살의 금액 골절 치료 진행에 중요 한 정보를 제공 합니다. 경도 작은 동물을 사용 하 여 전 임상 골절 치유 연구에 굳은 살 조직 개발 모니터링 기술을 사용할 수 비보에 디지털 방사선 및 µCT 이미징 포함 됩니다. 그러나, 두 기법과 비 mineralized 광물 화 된 직물을 구별 수만 있습니다. 따라서, 섬유 조직에서 연골을 차별 수 아니다. 대조적으로, 자기 공명 영상 (MRI) 그들의 함량에 따라 해 부 구조를 시각화 하 고 따라서 noninvasively 부드러운 조직과 연골 골절 굳은 살에 확인할 수 있을 수 있습니다. 여기, 우리는 MRI 호환 외부 fixator 마우스 대 퇴 골에 대 한 쥐에서 뼈 재생 중 MRI 검사를 허용 하도록 사용을 보고 합니다. 실험 그는 fixator와 주문 품 장착 장치 수 있도록 반복적인 MRI 검사, 골절-굳은 살 조직 개발의 경도 분석 활성화 설명 했다.

첫째, 수술의 성공 ( 그림 2에서 예제 참조)는 MRI 검사의 분석에 의해 확인할 수 있습니다. 모든 4 개의 핀 대 퇴 축 가운데 위치 해야 합니다. 뼈 간격의 크기는 0.3-0.5 사이 여야 m m. 뼈 간격의 크기는이 값에서 크게 차이가, 마우스 추가 분석에서 제외 해야 합니다.
둘째, 골절 치유 같은 동물에서 과정 동안...

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In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

Vivo에서 골절 뼈 쥐 마우스 대 퇴 골에 대 한 MRI-호환 Osteosynthesis 장치를 사용 하 여 치료 기간 동안 굳은 살 개발의 평가

Endochondral 뼈 치유 하는 동안 골절 굳은 살에 조직 개발의 평가 치료 과정을 모니터링 하는 데 필수적 이다. 여기, 우리는 자기 공명 영상 (MRI)의 사용을 보고-MRI 있도록 마우스 대 퇴 골에 대 한 호환 외부 fixator 쥐에서 뼈 재생 동안 검색.

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

9.5K 조회수.  University Medical Center Ulm. Endochondral 뼈 치유 하는 동안 골절 굳은 살에 조직 개발의 평가 치료 과정을 모니터링 하는 데 필수적 이다. 여기, 우리는 자기 공명 영상 (MRI)의 사용을 보고-MRI 있도록 마우스 대 퇴 골에 대 한 호환 외부 fixator 쥐에서 뼈 재생 동안 검색.

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Creating Rigidly Stabilized Fractures for Assessing Intramembranous Ossification, Distraction Osteogenesis, or Healing of Critical Sized Defects

Assessing modes of skeletal repair is essential for developing therapies to be used clinically to treat fractures. Mechanical stability plays a large role in healing of bone injuries. In the worst-case scenario mechanical instability can lead to delayed or non-union in humans. However, motion can also stimulate the healing process. In fractures that have motion cartilage forms to stabilize the fracture bone ends, and this cartilage is gradually replaced by bone through recapitulation of the developmental process of endochondral ossification. In contrast, if a bone fracture is rigidly stabilized bone forms directly via intramembranous ossification. Clinically, both endochondral and intramembranous ossification occur simultaneously. To effectively replicate this process investigators insert a pin into the medullary canal of the fractured bone as described by Bonnarens4. This experimental method provides excellent lateral stability while allowing rotational instability to persist. However, our understanding of the mechanisms that regulate these two distinct processes can also be enhanced by experimentally isolating each of these processes. We have developed a stabilization protocol that provides rotational and lateral stabilization. In this model, intramembranous ossification is the only mode of healing that is observed, and healing parameters can be compared among different strains of genetically modified mice 5-7, after application of bioactive molecules 8,9, after altering physiological parameters of healing 10, after modifying the amount or time of stabilization 11, after distraction osteogenesis 12, after creation of a non-union 13, or after creation of a critical sized defect. Here, we illustrate how to apply the modified Ilizarov fixators for studying tibial fracture healing and distraction osteogenesis in mice.

This article describes a method for stabilizing long bone fractures that is based on the application of modified Ilizarov external fixators 1-3. After application of the fixators and creation of the bone injury, healing can be assessed, distraction osteogenesis can be performed, or non-union or critical sized defect can be created and used to study therapeutic interventions.

산만 Osteogenesis, 또는 임계 크기의 결함의 치유는 Intramembranous 골화을 평가하기위한 Rigidly 안정 골절 만들기

Assessing modes of skeletal repair is essential for developing therapies to be used clinically to treat fractures. Mechanical stability plays a large role ...

연구

의학

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

결합<em&gt; 생체</em&gt; 광학 및 μCT 이미징 마우스의 정형 외과 임플란트 감염에 감염, 염증 및 뼈 해부학을 모니터링

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of therapies to enhance fracture healing.&#160; Periosteal cells rapidly migrate to an injury to supply new chondrocytes and osteoblasts for fracture healing. Traditionally, the efficacy of a cytokine to induce cell migration has only been conducted in vitro by performing a transwell or scratch assay. With advancements in intravital microscopy using multiphoton excitation, it was recently discovered that 1) P-SSCs express the migratory gene CCR5 and 2) treatment with the CCR5 ligand known as CCL5 improves fracture healing and the migration of P-SSCs in response to CCL5. These results have been captured in real-time. Described here is a protocol to visualize P-SSC migration from the calvarial suture skeletal stem cell (SSC) niche towards an injury after treatment with CCL5. The protocol details the construction of a mouse restraint and imaging mount, surgical preparation of the mouse calvaria, induction of a calvaria defect, and acquisition of time-lapse imaging.

This protocol describes the detection of CCL5-mediated periosteal skeletal stem cell migration in real-time using live animal intravital microscopy.

쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

발생학

An Intramedullary Locking Nail for Standardized Fixation of Femur Osteotomies to Analyze Normal and Defective Bone Healing in Mice

Bone healing models are essential to the development of new therapeutic strategies for clinical fracture treatment. Furthermore, mouse models are becoming more commonly used in trauma research. They offer a large number of mutant strains and antibodies for the analysis of the molecular mechanisms behind the highly differentiated process of bone healing. To control the biomechanical environment, standardized and well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory in mice. Here, we report on the design and use of an intramedullary nail to stabilize open femur osteotomies in mice. The nail, made of medical-grade stainless steel, provides high axial and rotational stiffness. The implant further allows the creation of defined, constant osteotomy gap sizes from 0.00 mm to 2.00 mm. Intramedullary locking nail stabilization of femur osteotomies with gap sizes of 0.00 mm and 0.25 mm result in adequate bone healing through endochondral and intramembranous ossification. Stabilization of femur osteotomies with a gap size of 2.00 mm results in atrophic non-union. Thus, the intramedullary locking nail can be used in healing and non-healing models. A further advantage of the use of the nail compared to other open bone healing models is the possibility to adequately fix bone substitutes and scaffolds in order to study the process of osseous integration. A disadvantage of the use of the intramedullary nail is the more invasive surgical procedure, inherent to all open procedures compared to closed models. A further disadvantage may be the induction of some damage to the intramedullary cavity, inherent to all intramedullary stabilization techniques compared to extramedullary stabilization procedures.

This protocol describes an osteosynthesis technique using an intramedullary locking nail for standardized fixation of femur osteotomies, which can be used to analyze normal and defective bone healing in mice.

대퇴골 절골술의 표준화 된 고정을위한 골수 내 잠금 네일은 마우스에 정상 및 결함 뼈 치유를 분석하기

Bone healing models are essential to the development of new therapeutic strategies for clinical fracture treatment. Furthermore, mouse models are becoming ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

Endochondral 골절 표준화 된 Biomechanical 조건 하에서 쥐에서 치유를 분석 하는 최소 침 습 모델

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies that promote efficient bone healing are non-existent and in high demand. Effective and reproducible animal models of fractures healing are needed to understand the complex biological processes associated with bone regeneration. Many animal models of fracture healing have been generated over the years; however, murine fracture models have recently emerged as powerful tools to study bone healing. A variety of open and closed models have been developed, but the closed femoral fracture model stands out as a simple method for generating rapid and reproducible results in a physiologically relevant manner. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice and facilitate a post-fracture stabilization of the femur by inserting an intramedullary steel rod. Although devices such as a nail or a screw offer greater axial and rotational stability, the use of an intramedullary rod provides a sufficient stabilization for consistent healing outcomes without producing new defects in the bone tissue or damaging nearby soft tissue. Radiographic imaging is used to monitor the progression of callus formation, bony union, and subsequent remodeling of the bony callus. Bone healing outcomes are typically associated with the strength of the healed bone and measured with torsional testing. Still, understanding the early cellular and molecular events associated with fracture repair is critical in the study of bone tissue regeneration. The closed femoral fracture model in mice with intramedullary fixation serves as an attractive platform to study bone fracture healing and evaluate therapeutic strategies to accelerate healing.

The murine closed femoral fracture model is a powerful platform to study fracture healing and novel therapeutic strategies to accelerate bone regeneration. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice using an intramedullary steel rod to stabilize the femur.

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin

Fracture repair is an essential function of the skeleton that cannot be reliably modeled in vitro. A mouse injury model is an efficient approach to test whether a gene, gene product or drug influences bone repair because murine bones recapitulate the stages observed during human fracture healing. When a mouse or human breaks a bone, an inflammatory response is initiated, and the periosteum, a stem cell niche surrounding the bone itself, is activated and expands. Cells residing in the periosteum then differentiate to form a vascularized soft callus. The transition from the soft callus to a hard callus occurs as the recruited skeletal progenitor cells differentiate into mineralizing cells, and the bridging of the fractured ends results in the bone union. The mineralized callus then undergoes remodeling to restore the original shape and structure of the healed bone. Fracture healing has been studied in mice using various injury models. Still, the best way to recapitulate this entire biological process is to break through the cross-section of a long bone that encompasses both cortices. This protocol describes how a stabilized, transverse femur fracture can be safely performed to assess healing in adult mice. A surgical protocol including detailed harvesting and imaging techniques to characterize the different stages of fracture healing is also provided.

This protocol describes a method to perform fractures on adult mice and monitor the healing process.

안정화 핀을 가진 마우스 대퇴골의 횡단 골절

Fracture repair is an essential function of the skeleton that cannot be reliably modeled in vitro. A mouse injury model is an efficient approach to test ...

생물학

Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography

Micro-computed tomography (&#181;CT) is the most common imaging modality to characterize the three-dimensional (3D) morphology of bone and newly formed bone during fracture healing in translational science investigations. Studies of long bone fracture healing in rodents typically involve secondary healing and the formation of a mineralized callus. The shape of the callus formed and the density of the newly formed bone may vary substantially between timepoints and treatments. Whereas standard methodologies for quantifying parameters of intact cortical and trabecular bone are widely used and embedded in commercially available software, there is a lack of consensus on procedures for analyzing the healing callus. The purpose of this work is to describe a standardized protocol that quantitates bone volume fraction and callus mineral density in the healing callus. The protocol describes different parameters that should be considered during imaging and analysis, including sample alignment during imaging, the size of the volume of interest, and the number of slices that are contoured to define the callus.

Micro-computed tomography (&#181;CT) is a non-destructive imaging tool that is instrumental in assessing bone structure in preclinical studies, however there is a lack of consensus on &#181;CT procedures for analyzing the bone healing callus. This study provides a step-by-step &#181;CT protocol that allows the monitoring of fracture healing.

미세 컴퓨터 단층 촬영을 이용한 골절 치유 평가

Micro-computed tomography (&#181;CT) is the most common imaging modality to characterize the three-dimensional (3D) morphology of bone and newly formed ...

Establishing a Diaphyseal Femur Fracture Model in Mice

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age and overall health status of the patient, failures can occur, leading to delayed union or nonunion. Due to the increasing number of fractures resulting from high-energy trauma and aging, the development of innovative therapeutic strategies to improve bone repair based on the combination of skeletal/mesenchymal stem/stromal cells and biomimetic biomaterials is urgently needed. To this end, the use of reliable animal models is fundamental to better understanding the key cellular and molecular mechanisms that determine the healing outcomes. Of all the models, the mouse is the preferred research model because it offers a wide variety of transgenic strains and reagents for experimental analysis. However, the establishment of fractures in mice may be technically challenging due to their small size. Therefore, this article aims to demonstrate the procedures for the surgical establishment of a diaphyseal femur fracture in mice, which is stabilized with an intramedullary wire and resembles the most common bone repair process, through cartilaginous callus formation.

This protocol describes a surgical procedure for the establishment of a diaphyseal fracture in the femur of mice, which is stabilized with an intramedullary wire, for fracture healing studies.

마우스에서 Diaphyseal 대퇴골 골절 모델 확립

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age ...