우리는 원고를 읽는 C. 공원 감사합니다. 이 작품은 상 수 K01AR061434 및 DP에 백혈병과 림프종 사회 원정대 수상 (5127-09)에서 NIAMS에 의해 지원 내용은 CPL 및 DTS에 건강의 국립 연구소의 보조금을하지 전적으로 저자의 책임이며 않는 한 반드시 건강의 국립 연구소의 공식 견해를 나타냅니다.

1. 마우스 및 전처리 참고 : 모든 마우스는 무균 상태로 유지하고, 모든 프로토콜은 매사 추세 츠 종합 병원에서 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 모든 수술은 오토 클레이브 멸균 장비를 사용하여 무균 조건 하에서 수행되어야한다. MX1-크레 15 Rosa26는 -에 loxP 스톱에 loxP - EYFP (로사 - YFP), 및 Rosa26 -에 loxP는 스톱에 loxP-tdTomato (로사 토마토)이었다 잭슨 연구소에서 구입. 오스테오칼신-GFP 마우스 박사 헨리 KRONENBERG에 의해 제공되었다. 생체 내에서 OSPC의 이동과 증식의 정량적 분석을 위해, MX1-크레 + 로사 - YFP + (단일 색상 기자) 마우스를 사용 하였다. 오스테오칼신 + 성숙한 조골 세포로 분화의 자세한 추적을 위해, 우리는 사용 trigenic MX1-크레 + 로사 - 토마토 + OCN-GFP +마우스. <ol><li> , 생체 내에서 MX1 + 세포에 라벨을 멸균 PBS 용액에 polyinosinic-polycytidylic 산 (PIPC, 2.5 ㎎ / ㎖)을 준비하고 20 MX1-크레 + 기자 마우스의 G 복강 한 번 10 일 동안 매일 200 μl를 주입합니다. </li><li> 주민 MX1 + 조혈 세포를 제거하기 위해, 9.5 Gy의 단일 용량으로 쥐를 조사. 정맥 16 조사, 이식 야생형 골수 세포 (1 × 10 6 세포 / 마우스)의 24 시간 후. 주 : MX1 - 유도 세포가 조혈 세포 및 조혈 유래 파골, MX1 + 조혈 세포의 제거 MX1 + 조골 세포의 이미징 품질 및 정량을 개선을 포함하기 때문이다. </li><li> 골수 이식 후 공여자 골수 세포의 성공적인 다시 채우기를 달성하기 위해 4-6주위한 동물을 모니터링한다. </li></ol> 2. 모준비에게 사용 <ol><li> IACUC 승인 절차를 사용하여 케타민 / 자일 라진 (100 ㎎ / ㎏, 자일 라진 12 ㎎ / ㎏ 체중)의 50 μL의 복강 내 주사로 마우스를 마취. 참고 : 효과 지속 시간이 케타민 / 자일 라진의 추가 투여에 의해 연장 될 수있다. </li><li> 마우스가 완전히 발가락 및 / 또는 꼬리 핀치에 대한 응답의 부족에 의해 마취되어 있는지 확인합니다. 마우스를 마취하는 경우 (선택), 테이핑하여 코를 통해 이소 플루 란 가스 마스크를 고정합니다. 동물이 완전히 진정되어 있는지 확인하기 위해 이소 플루 란의 레벨을 조정합니다. </li><li> 전기 트리머 또는 작은 가위를 사용하여 두피 머리를 클립. 머리 조각을 제거하고 70 % 알코올 면봉으로 노출 된 피부를 소독. 각막 탈수를 방지하기 위해 눈물 젤을 적용합니다. </li></ol> 3. 미세 균열 부상 <ol><li> 동물이 완전히 진정되고 확인한 후, 두피의 피부를 열 수있는 하나의 역 L 자형 절개를합니다. 요약하면, 제 1의 가로 절개 (1cm 미만) starti을다른 귀 하나 귀에서 겨. 60 ° ~ 켜고 ~ 멀리 코에서 2-3mm 때까지 코를 향해 절개를 계속합니다. 주 :이 절개 묘화되는 영역 위에 흉터 조직의 형성을 최소화한다. </li><li> 집게로 양쪽으로 잡아 당겨 피부 플랩을 분리합니다. 모두 정면 뼈와 시상 및 관상 봉합의 교차점 명확하게 노출되어야합니다. </li><li> 모든 잔여 머리카락이 제거 될 때까지 멸균 PBS 및 멸균 거즈 또는 면봉과 부드러운 닦아로 세척하여 열린 표면을 청소합니다. </li><li> 개관에 미세 균열을 생성하려면, 한 손으로 마우스의 머리와 다른 손으로 30 G 바늘을 개최합니다. 부드러운 압력으로 30 G 바늘의 끝 부분을 삽입하고 운동을 왜곡하여 시상 ​​및 관상 봉합의 교차점 왼쪽 정면 뼈의 미세 구멍 (&lt;1 mm 깊이와 ~ 0.2 mm 직경의 상처)를 확인합니다. 주의 :함으로써 bleedi 최소화 뇌로 관통 바늘을 피하기 위해 중요NG 및 조직 손상. </li><li> 큰 바늘 (20 또는 25 G)로 전환하고 바늘 (~ 0.5 mm 직경)을 왜곡하여 구멍 구멍을 넓혀. </li><li> 반대측 정면 뼈에 두 번째 구멍을 생성하는 단계 3.3-3.5를 반복합니다. </li><li> 출혈이 멈출 때까지 PBS의 연속 낙하에 의한 부상 반점을 닦습니다. 주 : 골절 사이트에 출혈이 적절한 영상을 방해하고 흉터 형성을 유도 할 것이다. </li><li> 건조를 방지하기 위해 두개골에 멸균 생리 식염수 또는 2 % 토셀의 드롭을 적용합니다. 참고 : 이미지 선명도를 줄일 수있는 두개골 표면이 건조하지 않도록하십시오. 이 영역을 커버하는 젤 또는 식염수의 충분한 양을 사용하는 것이 중요하다. </li></ol> 4.의 intravital 이미징 <ol><li> (선택 사항) 촬영하기 전에 일부 마우스는 혈관을 시각화하는 혈관 염료로 주입된다. 비 대상 Qtracker 705 80m에 희석 (50 mM의 붕산 버퍼에 2 μM 용액) 20 ㎕와 함께 복고풍 궤도 주입PBS의 L. 시약의 낭비를 최소화하기 위해 인슐린 주사기를 사용합니다. 신호가 충분히 밝지 않은 경우, 추가적인 양이 요구 될 수있다. </li><li> 스캐너의 전원을 켭니다. 참고 : 다각형 기반의 레이저 스캐너 비디오 속도로 동시 다중 채널 이미지 수집 (초당 30 프레임)을 할 수 있습니다. 비디오 속도 스캐닝 라이브 동물 이미징을위한 매우 중요합니다. </li><li> (: 사파이어 레이저 펨토초 티타늄) 다 광자 레이저의 전원을 켭니다. 880 nm의 파장을 설정하고 뼈의 두 번째 고조파 발생의 영상 (440 NM)의 전원을 조정합니다. GFP 및 tdTomato 여기를 들어, 491 ㎚, 561 nm의 고체 레이저의 전원을 켭니다. </li><li> PMT 각 신호 (광전자 증 배관) 검출기를 켭니다 (두 번째 고조파 발생에 대한 435 ± 20 nm의 대역 통과 필터, GFP의 528 ± 19 nm의 대역 통과 필터 및 tdTomato 590 ± 20). (선택 사항) Qtracker보기 (705)의 신호를 검출하도록 695 ± 27.5 nm의 대역 통과 필터와 638 nm의 헬륨 - 네온 레이저 및 PMT를 사용한다. </li><li> PLACXYZ 축 동력 현미경의 무대에서 동물을 전자. (이것은 동물 손실의 위험을 감소시킨다)의 체온을 유지할 수 있도록 전기 가열 패드를 가장 편안한 위치에 마우스를 유지한다. 촬영하는 동안 움직임을 최소화하기 위해 가능한 한 수평으로 몇 군데 지역을 유지하기 위해 마우스를 잡고 테이프를 사용합니다. </li><li> 건조를 방지하기 위해 두개골에 따뜻한 2 % 메틸 셀룰로오즈 겔 또는 생리 식염수 용액의 방울을 적용한다. 이미징 영역에 커버 글래스를 넣어. 덮개 뼈를 스캔 (0.9 NA로 30 배 물 침지 목적) 낮은 배율의 렌즈를 사용합니다. </li><li> XYZ 축 제어기를 사용하여 뼈 SHG 신호를 검출함으로써 덮개 뼈의 표면을 발견하고 시상 봉합과 관상 봉합의 교점으로서 중요한 랜드 마크의 위치를​​ 식별한다. 이미지를 획득하고 XYZ 좌표를 기록한다. </li><li> SHG 형광 신호를 관찰하여 손상의 위치를​​ 검색하기 위해 계속합니다. </li><li> 부상 사이트 또는 지역 오 때F 관심이 발견되어, 그 세포로부터 SHG 형광 신호를 포함하는 최적 초점 평면의 이미지를 획득. 저장 XYZ 좌표와 시상 및 관상 봉합의 교차점까지의 거리 이미징의 다음 라운드를 위해 자신의 정확한 위치를 정의 할 수 있습니다. </li><li> 골절 부상의 3D 세포 및 뼈 구조를 수집, Z-스택으로 이미지를 기록 - 내막 뼈 표면에서 ~ 100 μm의 깊이 (5 μm의 간격). 부상의 한쪽의 촬상 종료 후, 다음 부상 사이트에 대한 촬영 처리를 반복한다. </li></ol> 5. 포스트 운전 설정 <ol><li> 촬상 후, 두개골에서 메틸 셀룰로오스 겔을 제거 멸균 식염수로 촬상 사이트를 헹군다. 멸균 면봉을 사용하여 표면에 트리플 항생제 연고 묻혀. 피부 플랩 커버 및 수술 봉합하여 두피를 다시 닫습니다. 이것은 저자 극성 봉합사 (흡수 polyglactin 스와 함께 할 수있는진짜야)와 5-0 크기 봉합 바늘. 주의 : 좋은 봉합 기술은 흉터 형성을 최소화한다. </li><li> / kg 부 프레 노르 핀 48 시간마다 12 시간이 수술 후 0.05 ~ 0.1 밀리그램의 IP 주입과 모든 동물을 치료. 그들은 충분한 의식을 되 찾을 때까지 따뜻한 복구 실에서 동물이 오지 않게하십시오. 3~5일 후 봉합을 다시 및 골절 치료시 세포의 변화를 추적 할의 intravital 이미징 단계를 반복합니다. </li></ol>

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-computed+tomography+assessment+of+the+progression+of+fracture+healing+in+mice.">Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice.</a> Bone. 50, 1357-1367 (2012).</li><li>Kovar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared-labeled+tetracycline+derivative+is+an+effective+marker+of+bone+deposition+in+mice.">Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice.</a> Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).</li><li>Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+promotes+progress+in+orthopedic+research.">Molecular imaging promotes progress in orthopedic research.</a> Bone. 39, 965-977 (2006).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li><li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).</li><li>Tu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osterix+overexpression+in+mesenchymal+stem+cells+stimulates+healing+of+critical-sized+defects+in+murine+calvarial+bone.">Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone.</a> Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).</li></ol>

저자는 더 경쟁 금융 관심이 없다는 것을 선언합니다.

골격 줄기 세포의 조절은 골 재생을 달성하기 위해 더 나은 방법을 정의하기 위해 매우 중요 할 수있다. 세포 수준에서 정량 및 연속 촬영은 기술적으로 도전하고있다. 마우스 긴 뼈의 골절 모델이 널리 사용되는 생체 역학적 연구 (17)에 적합하였으나, 그 깊은 조직의 위치, 고르지 골절의 크기, 연부 조직 손상, 및 안정화 fixators의 응용 프로그램이 순차의 intravital 이미징을 제한했다. 여기...

퇴행성 뼈 질환 및 골다공증 성 골절의 위험이 높은 선도 연령과 관련된 뼈 손실은 공중 보건의 1의 주요 과제가되고있다. 뼈의 유지 보수는 뼈가 형성 조골 세포와 뼈 resorbing 파골 세포에 의해 제어된다. 뼈 형성 세포의 결함은 연령과 관련된 뼈 손실 및 퇴행성 뼈 질환 2,3의 주요 원인입니다. 광범위한 연구는 골절 치료의 개선에 집중되었지만, 안정적인 약물의 발견은 뼈 퇴행성 질병을 치료 및 골다공증 성 골절의 약점을 취소하는 것은 중요한 문제가 남는다. 따라서, 골 재생 및 수리의 골 형성 세포 및 그 제어 메커니즘의 근원을 연구하면 골격 재생을 높이고 골 손실 질환을 반전하는 신규 한 통찰력을 제공한다. 골수에있는 다 능성 간엽 세포의 존재는 클론 원성 개체군의 식별에 기초하여 제안되었다 수 있었고 상이한골 형성에 늦었, 지방 형성과 연골 계보는 생체 4. 최근, 여러 연구는 골격 / 중간 엽 줄기 세포 (SSC가 / 엽 줄기 세포)는 조골 세포의 자연적인 원천 및 골 교체, 개조, 및 파괴 수리 5,6에 중요한 것으로보고있다 . 또한, 우리의 혈통 추적 연구는 성숙한 조골 세포가 예기치 않게 짧은 반감기 (~ 60 일)이 지속적으로 정상 항상성과 골절 수리 조건 6 모두 자신의 줄기 / 전구 세포에 의해 보충되는 것으로 나타났다. 그러나, 생체 내 줄기 세포의 정체성과 어떻게 이러한 세포는 부상 골절과 뼈 형성 세포가 불분명 공급하는 반응. 따라서, 생리적 상황에서 이주, 증식 및 내인성 개의 SSC / 엽 줄기 세포의 분화를 분석 할 수있는 방법을 개발하는 것이 중요하다. 골절 수리 복잡한의 배열에 의해 규제 다세포과 역동적 인 과정이다사이토 카인과 성장 7 요인. 골절 연구에 가장 인기있는 방법은 긴 뼈 골절 동물 모델을 사용하여 뼈 절편 및 면역 형광 기법 8-10로 뼈를 분석하는 것이다. 이 복구 프로세스는 마이크로 - CT (11), 근적외선 형광 (12) 및 화학 발광 영상 (13)을 포함하여 다수의 영상 기술로 모니터링 할 수있다. 그러나 각 기술은 특정 제한 사항이 생체 내에서 세포 수준에서 SSC가 / MSC 기능을 모니터링하는 효과적인 방법이 없었다. 최근에, 공 초점 / 이광자의 intravital 현미경이 개발 및 동물에게 14 리빙 심지어 단일 셀 해상도 그들의 골수 미세 환경의 컨텍스트에서 이식 된 암세포 및 조혈 줄기 세포를 검출하기 위해 사용되어왔다. 계보 추적 모델 시리즈 기술을 결합함으로써, 우리는 골 형성 줄기 / 전구 세포는 유전자 변이 (AC)에 의해 표시 될 수 있음을 정의 할 수 있었다믹소 바이러스 저항 -1 (MX1) 발기인 및 MX1 유도 조상의 tivation 시간이 지남에 성숙한 조골 세포의 대부분을 유지할 수 있지만, 성인 마우스 (6)에 연골 세포의 생성에 참여하지 않습니다. 또, MX1-표지 OSPCs은 골절 치료 6 새로운 골아 세포의 대부분을 공급하는 것을 보여 주었다. 여기에, osteo-혈통 추적 모델과의 intravital 현미경을 사용하여, 프로토콜은 골절 수리 MX1 + 골 형성 줄기 / 전구 세포의 생체 역학을 정의하기 위해 제공됩니다. 이 프로토콜은 골절 사이트에 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이전 및 초기 수리 과정에서 osteoprogenitor 확장의 정량적 측정을 추적하기 위해 순차적으로 영상을 제공합니다. 이 접근법은 골 수선을 향상시키는 치료 후보의 평가를 포함한 여러 상황에서 유용 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">C57BL/6J (H-2b)</td>
			<td style="width:140px;">Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)</td>
			<td style="width:195px;">000664</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ketamine Hydrochloride Injection</td>
			<td style="width:140px;">Bionichepharma</td>
			<td style="width:195px;">67457-001-10</td>
			<td>&#160;Vial size: 10 ml (50 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine Sterile Solution</td>
			<td style="width:140px;">Lloyd Inc.</td>
			<td style="width:195px;">NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buprenorphine Hl</td>
			<td style="width:140px;">BEDFORD LAB</td>
			<td style="width:195px;">NDC 55390-100-10</td>
			<td>Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS, 1X</td>
			<td style="width:140px;">CORNING cellgro</td>
			<td style="width:195px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol)</td>
			<td style="width:140px;">Kendall WEBCOL</td>
			<td style="width:195px;">5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine Surgical Scissor</td>
			<td style="width:140px;">F.S.T</td>
			<td style="width:195px;">14568-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extra fine Forceps</td>
			<td style="width:140px;">F.S.T</td>
			<td style="width:195px;">11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">VICRYL*Plus Suture</td>
			<td style="width:140px;">Ethicon</td>
			<td style="width:195px;">VCP490G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qtracker 705 non-targeted quantum dot</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:195px;">Q21061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methocel 2%</td>
			<td style="width:140px;">OmmiVision</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)&#160;&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:195px;">P0913-50MG</td>
			<td>100 &#956;l (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers</td>
			<td style="width:140px;">Spectra Physics</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser</td>
			<td style="width:140px;">Cobolt AB</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Radius-635 HeNe laser</td>
			<td style="width:140px;">Coherent</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential in vivo imaging of osteogenic stem/progenitor cells during fracture repair

뼈는 지속적으로 반전 높은 재생 부상을 따르고있다. 골 형성 줄기 / 전구 세포가 오랫동안 존재하는 가설이 있지만, 이러한 세포의 생체 내 데모 최근에 달성되었습니다. 여기에, 생체 이미징 기술 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 역할 (OSPCs)과 뼈 수리에 자신의 자손을 조사하기 위해 제공됩니다. 모델과 두 개관 뼈 유도 미세 균열의의 intravital 이미징을 추적 osteo-계보 세포를 사용하여, OSPCs 직접 초기 수리 과정에서 중요한 이벤트가 발생하는 부상 후 처음 몇 일 동안 관찰 할 수있다. 상해 사이트는 순차적으로 OSPCs가 부상으로 옮겨 놓을 수가 증가하고 뼈 형성하는 조골 세포로 분화 드러내는 이미지가 될 수있다. 이러한 방법은 뼈 재생 및 수리를위한 줄기 세포의 내장과 외부의 분자 규제의 역할을 조사하는 수단을 제공합니다.

<html> 안정화 된 긴 뼈의 골절 모델은 골절 연구에 인기가있다. 그러나, 긴 뼈의 골절 또는 큰 모델은 여러 조직의 손상을 야기하기 때문에, 뼈 세포 기능의 양적 측정에 제한이있다. 우리는 바늘 드릴링 (그림 1A-1C)와 두 개관 정면 뼈에 최소 침습 부상 (경막에없이 또는 최소한의 침윤 미만 mm 직경)를 개발했다. 이 뼈는 (다른 조직의 간섭없이 맑은 부상 뼈의 영상, 뼈 세포 및 혈관을 허?...

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Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

골절 치료에 뼈 전구 기능의 정량적 측정은 고해상도 시리얼 이미징 기술을 필요로한다. 여기에, 프로토콜은 이미지를 순차적으로 골절을 수리하는 과정에서 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이동, 증식과 분화를 정량화의 intravital 현미경과 osteo-혈통 추적을 사용하여 제공됩니다.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

10.4K 조회수.  Harvard Stem Cell Institute.  골절 치료에 뼈 전구 기능의 정량적 측정은 고해상도 시리얼 이미징 기술을 필요로한다. 여기에, 프로토콜은 이미지를 순차적으로 골절을 수리하는 과정에서 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이동, 증식과 분화를 정량화의 intravital 현미경과 osteo-혈통 추적을 사용하여 제공됩니다. 

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In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

생체 듀얼 기판 발광 생물 이미징에

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

연구

의학

3D-Neuronavigation In Vivo Through a Patient's Brain During a Spontaneous Migraine Headache

A growing body of research, generated primarily from MRI-based studies, shows that migraine appears to occur, and possibly endure, due to the alteration of specific neural processes in the central nervous system. However, information is lacking on the molecular impact of these changes, especially on the endogenous opioid system during migraine headaches, and neuronavigation through these changes has never been done. This study aimed to investigate, using a novel 3D immersive and interactive neuronavigation (3D-IIN) approach, the endogenous &#181;-opioid transmission in the brain during a migraine headache attack in vivo. This is arguably one of the most central neuromechanisms associated with pain regulation, affecting multiple elements of the pain experience and analgesia. A 36 year-old female, who has been suffering with migraine for 10 years, was scanned in the typical headache (ictal) and nonheadache (interictal) migraine phases using Positron Emission Tomography (PET) with the selective radiotracer [11C]carfentanil, which allowed us to measure &#181;-opioid receptor availability in the brain (non-displaceable binding potential - &#181;OR BPND). The short-life radiotracer was produced by a cyclotron and chemical synthesis apparatus on campus located in close proximity to the imaging facility. Both PET scans, interictal and ictal, were scheduled during separate mid-late follicular phases of the patient's menstrual cycle. During the ictal PET session her spontaneous headache attack reached severe intensity levels; progressing to nausea and vomiting at the end of the scan session. There were reductions in &#181;OR BPND in the pain-modulatory regions of the endogenous &#181;-opioid system during the ictal phase, including the cingulate cortex, nucleus accumbens (NAcc), thalamus (Thal), and periaqueductal gray matter (PAG); indicating that &#181;ORs were already occupied by endogenous opioids released in response to the ongoing pain. To our knowledge, this is the first time that changes in &#181;OR BPND during a migraine headache attack have been neuronavigated using a novel 3D approach. This method allows for interactive research and educational exploration of a migraine attack in an actual patient's neuroimaging dataset.

3D-Neuronavigation In Vivo Through a Patient&#039;s Brain During a Spontaneous Migraine Headache

In this study, the authors report for the first time a novel 3D-Immersive &#38; Interactive Neuronavigation (3D-IIN) through the impact of a spontaneous migraine headache attack in the &#956;-opioid system of a patient's brain in vivo.

3D-Neuronavigation<em&gt; 생체</em&gt; 자발적인 편두통 두통 동안 환자의 뇌를 통해

A growing body of research, generated primarily from MRI-based studies, shows that migraine appears to occur, and possibly endure, due to the alteration ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

세포 추적을위한 생체 19 F MRI에서

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

말 건 병증에 골수 중간 엽 줄기 세포를 레이블 테크네튬 99m의 생체 ​​이미징 및 추적에서

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The amount of the different tissues in the callus provides important information on the fracture healing progress. Available in vivo techniques to longitudinally monitor the callus tissue development in preclinical fracture-healing studies using small animals include digital radiography and &#181;CT imaging. However, both techniques are only able to distinguish between mineralized and non-mineralized tissue. Consequently, it is impossible to discriminate cartilage from fibrous tissue. In contrast, magnetic resonance imaging (MRI) visualizes anatomical structures based on their water content and might therefore be able to noninvasively identify soft tissue and cartilage in the fracture callus. Here, we report the use of an MRI-compatible external fixator for the mouse femur to allow MRI scans during bone regeneration in mice. The experiments demonstrated that the fixator and a custom-made mounting device allow repetitive MRI scans, thus enabling longitudinal analysis of fracture-callus tissue development.

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

The evaluation of tissue development in the fracture callus during endochondral bone healing is essential to monitor the healing process. Here, we report the use of a magnetic resonance imaging (MRI)-compatible external fixator for the mouse femur to allow MRI scans during bone regeneration in mice.

Vivo에서 골절 뼈 쥐 마우스 대 퇴 골에 대 한 MRI-호환 Osteosynthesis 장치를 사용 하 여 치료 기간 동안 굳은 살 개발의 평가

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue plasminogen activator (tPA) as an approved drug treatment to target ischemic strokes. Current research in the field of ischemic stroke focuses on better understanding the pathophysiology of stroke, to develop and investigate novel pharmaceutical targets. Reliable experimental stroke models are crucial for the progression of potential treatments. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is clinically relevant and the most frequently used surgical model of ischemic stroke in rodents. However, the outcomes of this model, such as lesion volume, are associated with high levels of variability, particularly in mice. The alternative MCAO model described here allows the reperfusion of the common carotid artery (CCA) and the increased perfusion of the middle cerebral artery (MCA) territory, using a tissue pad with fibrinogen-based sealant to repair the vessel, and the improved welfare of the mice by avoiding external carotid artery (ECA) ligation. This reduces the reliance on the Circle of Willis, which is known to be highly anatomically variable in mice. Representative data show that using this alternative surgical approach decreases the variability in lesion volumes between the traditional MCAO approach and the alternative approach described here.

Intraluminal filament occlusion of the middle cerebral artery is the most frequently used in vivo model of experimental stroke in rodents. An alternative surgical approach to allow common carotid artery repair is performed here, which allows the reperfusion of the common carotid artery and a full reperfusion to the middle cerebral artery territory.

쥐에 있는 일반적인 경 동맥 수리 통해 Reperfusion를 허용 하는 중간 대뇌 동맥 폐색

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...

A Simplified Stepwise Approach to Echo Guidance during Percutaneous Mitral Valve Repair

Percutaneous transcatheter edge-to-edge reconstruction of the mitral valve is a safe and well-established therapy for severe symptomatic mitral regurgitation in patients with high surgical risk. Echocardiographic guidance in addition to fluoroscopy is the gold standard and should be performed using a standardized technique.
This article lays out our reproducible step by step echocardiographic guide including views, measurements as well as highlighting possible difficulties that may arise during the procedure.
This article provides detailed and chronological echocardiographic views for each step of the procedure, especially preferences between 2D and 3D imaging. If needed, pulse wave, continuous wave and color doppler measurements are described. Furthermore, as there are no official recommendations for the quantification of mitral regurgitation during the percutaneous edge-to-edge-repair procedure, advice is also included for echocardiographic quantification after grasping the mitral leaflets and after device deployment. In addition, the article deals with important echocardiographic views to prevent and deal with possible complications during the procedure.
Echocardiographic guidance during transcatheter mitral valve repair is mandatory. A structured approach improves the collaboration between interventionist and imager and is indispensable for a safe and effective procedure.

This protocol presents in detail how to perform real-time echocardiographic guidance during transcatheter mitral valve repair. The fundamental views and the necessary measurements are described for each stage of the procedure.