이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (31371596), 바이오 기술 연구 센터, 중국 3 협곡 대학 (2016KBC04), 그리고 장쑤 성, 중국 (BK20151424)의 자연 과학 재단에 의해 지원 되었다.

1. 시퀀스 정렬
<ol><li>
진 핵 정하고 별도 문서에 간결한 SemiSWEET의 아미노산 시퀀스를 수집 하 고 FASTA 형태로 그들을 나열. 유사성 검색 기본 로컬 맞춤 검색 도구 (폭발) 도구를 사용 하 여 생명 공학 정보 (NCBI), 유럽 분자 생물학 실험실 (EMBL), 및 일본 (DDBJ) 데이터베이스의 DNA 데이터 은행에 대 한 국립 센터에서 시퀀스 다운로드.
	<ol>
<li>예제 파일에서 진핵생물과 원핵생물의 단일 MtN3/타 액 도메인 (3 막 횡단 나선)를 소지 하는 57 약간 단 단백질 시퀀스의 두 MtN3/타 액 도메인 (7 막 횡단 나선)를 소지 하는 228 putative 달콤한 단백질 시퀀스를 수집 13.</li>
		<li>프로세스를 단순화 하려면 계통 발생 나무 건축을 위해 228 putative 과자 중 단 세포 진 핵 생물에서 35 후보 달콤한 단백질을 선택 합니다. 이러한 시퀀스는 독자가 실제 데이터 세트에 연습 수 있도록 연결 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
35 달콤한 시퀀스 정렬 Clustal 오메가 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)으로 그들을 입력 하 여.
	<ol>
<li>복사 및 붙여 단백질 시퀀스 FASTA 형태로 입력된 상자 또는 FASTA 형식의 시퀀스 파일 업로드. 그들은 ' 1 단계 ' 단원의 풀 다운 메뉴에서 아이콘을 클릭 하 여 아미노산 시퀀스는 지정 합니다.</li>
		<li>필요한 경우 ' 2 단계 ' 섹션에서 출력 형식 및 다른 매개 변수를 지정 합니다. 이 연구를 위해 "clustal 번호 없이",으로 출력 포맷을 설정 하 고 다른 매개 변수를 기본 설정에 두고. 대부분의 경우에서 기본 매개 변수는 어떤 사양 하지 않고 잘 작동합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제출 하 고 ' 3 단계 ' 단원의 맞춤을 실행 합니다. 그것은 분 맞춤 완료 될 때까지 몇 초에서 아무 데도 걸릴 수 있습니다. 결과 요약 패널에서 "CLUSTAL 형식에서 맞춤"에서 링크를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "35.clustal" (그림 1)으로 정렬 된 시퀀스를 저장 합니다.</li>
	<li>
BioEdit에서 정렬 결과 파일을 엽니다.
	<ol>
<li>BioEdit의 주 패널에서 "시퀀스"를 클릭 첫 번째 풀 다운 메뉴에서 "편집 분위기"를 선택한 다음 하위 메뉴 (그림 2)에서 "편집 잔류물"를 클릭.</li>
		<li>정렬 (선택한 시퀀스는 검정색으로 표시 됩니다) 커서의 왼쪽에 튀어나온 시퀀스를 선택 합니다 (그림 3) 선택 된 시퀀스를 제거 하려면 "편집" 메뉴에서 "Delete" 아이콘을 클릭 합니다.</li>
		<li>선택 및 첫 번째 MtN3/타 액 도메인의 오른쪽에 튀어나온 시퀀스를 삭제 하 고 35-I.fas (그림 4)으로 트림된 첫 번째 MtN3/타 액 도메인 시퀀스를 저장 합니다. 마찬가지로, 왼쪽 및 오른쪽 튀어나온 두 번째 MtN3/타 액 도메인의 시퀀스를 삭제 하 고 35-II.fas로 저장. 첫 번째 및 두 번째 MtN3/타 액 도메인 시퀀스 수 있습니다 예측할 수 리듬 (http://proteinformatics.charite.de/rhythm/inndex.php?site=helix) 또는 TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)와 함께 사전에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
메가, 파일 35-I.fas를 열고 "정렬" 메시지가 표시 되 면 클릭 합니다. "편집" 메뉴에서 "모두 선택"을 클릭 "선택 애"; 이름과 시퀀스는 taxa의 블랙 (그림 5)에서 선택 됩니다.
	<ol>
<li>시퀀스를 클립보드에 복사 하려면 "편집" 메뉴에서 "복사"를 선택 하 고 복사 된 시퀀스는 doc 파일에 붙여 넣습니다.</li>
		<li>모든 "#" doc 파일에서 바꿉니다 ">", FASTA 형식 변환 관련 없는 문자가 삭제. 추가 "-I" 첫 번째 MtN3/타 액 도메인 시퀀스로 표시 각 taxon 이름 끝에. 다음과 같은 메서드를 두 번째 MtN3/타 액 도메인 시퀀스를 처리 하 고 추가 "-II" 각 taxon 이름.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
첫 번째 및 두 번째 MtN3/타 액 도메인 시퀀스 FASTA 형식의 문서 파일에 결합 합니다.
	<ol>
<li>Clustal 오메가에 결합 된 시퀀스를 다시 로드 하 고 위에서 설명한 대로 시퀀스를 정렬. "35 realigned.clustal"로 결과 저장 합니다.</li>
		<li>BioEdit에서 "35 realigned.clustal" 파일을 열고, 정렬 된 시퀀스의 양쪽 끝에 고르지 (튀어나온) 아미노산 잔류물을 삭제 하 고 시퀀스 "35 realigned.fas"로 저장. 일부 비표준 문자를 저장할 수 없습니다 경고 때 "예"를 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 계통 발생 나무의 계산
<ol><li>
메가에서 "35 realigned.fas"를 엽니다.
	<ol>
<li>"수출 맞춤", "데이터" 메뉴를 클릭 선택한 맞춤 PAUP 형식 (넥서스) "35.nex" MrBayes (그림 6)에서 나중에 사용 하기 위해 저장 합니다.</li>
		<li>한편, 메가의 메인 패널에 "모델" 아이콘을 클릭 하 고 선택한 "찾을 최고의 DNA/단백질 모델 (ML)", 팝업 창에서 "확인"을 클릭 합니다. 프로세스 (그림 7)를 검색 하는 모델을 시작으로 "계산"을 클릭 합니다. 새로운 진행률 패널을 열 것 이다; 이 과정의 로드 시퀀스 컴퓨터의 성능과 복잡성에 따라 몇 일 분 정도 지속 됩니다. 참고: 테이블 보여주는 모델 검색 프로세스가 완료 되 면 결과 열립니다 ( 그림 8). 작은 빅 점수 나열 됩니다 첫째, 뒤에 점차 빅 점수를 증가 함께 다른 모델의 시리즈. 작은 빅 점수와 함께 첫 번째 모델 "LG + G + F" ML 트리 "35 realigned.fas" 파일에 대 한 권장된 모델이입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
메가의 메인 패널에 "계통" 아이콘 "구문/테스트 최대 가능성 나무"를 누르고 팝업 패널에서 "예"를 클릭. 새 창이 나타납니다 다른 표시 되어야 하는 매개 변수 지정 (그림 9).
	<ol>
<li>첫째, 계통 상자;의 시험에서 부트스트랩 값을 설정 500 또는 1000은 대부분의 경우에 적합 합니다. 대체 모델에서 대체 형식으로 "아미노산"을 선택 합니다. 대체 모델 선택의 목적은 그들의 현재 주3에 따라 시퀀스의 진정한 차이 예측 것입니다.</li>
		<li>선택 하는 "lg 전자는 Freqs와 함께. (+F) 모델 "(LG + F) 모델/메서드 상자에. 속도 패턴 상자에서 선택 "감마 배포" (G) 사이트, 즉속도 변화를 설명 하기 위해.,3사이트 천천히 진화에서 변화에 더 많은 무게를 주는. 데이터 하위 집합 상자에서 "전체 삭제" 하는 것을 선택 모든 하이픈을 포함 하는 열을 제거 하려면.</li>
		<li>그들의 기본 상태 (그림 9)에 다른 모든 매개 변수를 유지. 이러한 매개 변수 지정 후 계산을 시작 하려면 "계산" 아이콘을 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 계통 발생 나무의 프레 젠 테이 션
참고: 계통 발생 ML 트리 나타납니다 메가 사용 하 여 계산 완료 되 면 (그림 10).
<ol><li>트리 패널에 있는 "파일" 아이콘의 풀 다운 메뉴에서 선택 "" 결과 저장 하려면 현재 세션을 저장 (.mas는 기본 파일 형식). 현재 연구 결과 "35.mas"로 저장 되었다. 트리 패널에 clade의 길이 포함 하 여 많은 매개 변수 트리 스타일, 트리 토폴로지, taxon 이름, 크기, 및 색깔의 글꼴 표시 되 고 다른 옵션을 설정할 수 있습니다.</li>
	<li>이미지 아이콘을 클릭 하 여 최종 트리 파일 저장 다른 형식으로 그림을 저장 하거나 사진 편집에 대 한 원본으로 이미지를 복사.</li>
</ol>4. 과자 및 정렬 순서를 사용 하 여 SemiSWEETs의 관계 분석
참고:이 단계를이 수행 하지 일반 시퀀스 분석에 필요할 수 있습니다.
<ol><li>228 진 핵 자와 57 간결한 SemiSWEETs Clustal 오메가 위에서 설명한 대로 맞춥니다. 정렬 결과 Clustal 오메가, 통합 이며 복사 사진 편집기 (그림 11)에 저장 하는 Jalview에 표시 될 수 있습니다. 참고: 예제에서는 정렬에 α-Proteobacteria에서 일부 SemiSWEETs 정렬 됩니다 달콤한 시퀀스의 첫 번째 MtN3/타 액 도메인 반면 달콤한 시퀀스의 두 번째 MtN3/타 액 도메인 SemiSWEETs Methanobacteria (archaea)에서 정렬 됩니다.</li>
</ol>5. 계통 발생 나무 건축 MrBayes
<ol><li>베이즈 추론 MrBayes와,에 대 한 MrBayes 실행 파일 열고 도스 인터페이스 새 창에서 올 것 이다. 첫 번째 단계는 넥서스 데이터 ﬁle를 읽을 수 있다. 입력 "execute 35.nex" 프롬프트 후 (35. nex 파일의 MrBayes 실행 파일 같은 디렉터리에 저장 하거나 그것을 업로드 하기 전에 파일의 통로 지적 기억). 다음 나열 된 taxa (그림 12)의 마지막 "성공적인 읽기 매트릭스" 메시지가 표시 됩니다. 35. nex 파일 이미 준비 되었으며 메가에 저장 (위의 2.1 참조).</li>
	<li>
진화 모델을 설정 합니다.
	<ol>
<li>입력을 한 후 "prset aamodelpr = fixed(lg); lset 요금 = g ". "Lg 전자"와 "g" 메가에 설정 되는 "lg 전자"와 "G" 모델에 해당 합니다. 모델을 성공적으로 설정한 후 입력 "mcmc nchains = 4 ngen 5000000 =" 프롬프트 후. 사용은 "nchains = 4" 항목 한 콜드 체인 및 대도시 커플링에 대 한 3 개의 뜨거운 체인의 총 수를 나타냅니다. "ngen 5000000 =" 춥고 뜨거운 체인의 융합을 위한 대도시 커플링의 5000000 세대를 실행 하는 것을 의미. 이 연구에서 평균 표준 편차 0.01 분할 주파수의 따뜻한 것과 차가운 체인의 융합으로 간주 되었다.</li>
		<li>Ngen 번호는 프로세스의 시작 부분에 정확 하 게 예측할 수 없습니다와 일반적으로 조정에 따라 분할 주파수의 평균 표준 편차에 변화. 또한, 융합을 위한 ngen 번호 수 있습니다 때 동일한 데이터를 기반 프로그램을 실행 하는 각 시간.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
실행 분석: 이 단계는 컴퓨터의 성능과 입력된 데이터의 복잡성에 따라 몇 일 분에서 지속. 미리 계산을 완료 한 후 프롬프트가 묻습니다 "계속 분석 (예/아니요)?" "아니오" 입력 하는 경우 프롬프트 후, 컴퓨팅 (그림 13), 중지 됩니다 그렇지 않으면 계속 됩니다 추가 세대 수 입력 후 계산 하. 계산이 완료 되 면 (분할 주파수의 평균 표준 편차와 < 0.01 또는 0.05), 후 문의 프롬프트 "no"를 입력 하 여 계산을 중지. 참고: 0.01은 엄격한 기준, 0.05 온건 하 고 일반적으로 적절 한.</li>
	<li>
샘플 요약: 모델 매개 변수 (그림 14)의 샘플 요약을 프롬프트 후 "기름 통"을 입력 합니다. 다음 입력 "sumt relburnin 예 burninfrac = 0.25 =" 요약 트리 샘플 프롬프트 후. 계통 발생 나무 건축에 대 한 자세한 내용은 그림 15, 두 나무 그림 화면, 보여주는 하나의 clade 신뢰성 및 다른 표시 지점 길이에 ASC II 코드에 나타납니다 다음 처럼 표시 됩니다. 동시에 "35.nex.con"의 이름 가진 나무 파일을 자동으로 저장 됩니다.</li>
	<li>계통 발생 나무의 더 나은 프레 젠 테이, 기관 도구 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) "35.nex.con" 트리 파일을 열고, 스타일 또는 크기 (그림 16) 결과 표시를 선택 또는 심지어 그것을 사진 편집기에서 편집 더 리더-친절 한.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nei, M., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Evolution and Phylogenetics. , (2000).</li><li>Foth, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+to+uncover+organellar+origins+of+nuclear-encoded+genes.">Phylogenetic analysis to uncover organellar origins of nuclear-encoded genes.</a> Methods Mol Biol. 390, 467-488 (2007).</li><li>Baldauf, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+for+the+faint+of+heart:+a+tutorial.">Phylogeny for the faint of heart: a tutorial.</a> Trends Genet. 19, 345-351 (2003).</li><li>Feng, D. F., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+sequence+alignment+as+a+prerequisite+to+correct+phylogenetic+trees.">Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees.</a> J Mol Evol. 25, 351-360 (1987).</li><li>Persson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+in+protein+analysis.">Bioinformatics in protein analysis.</a> EXS. 88, 215-231 (2000).</li><li>Sievers, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega.">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).</li><li>Sievers, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustal+omega.">Clustal omega.</a> Curr Protoc Bioinformatics. 48, 1-16 (2014).</li><li>Yang, Z., Rannala, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phylogenetics:+principles+and+practice.">Molecular phylogenetics: principles and practice.</a> Nat Rev Genet. 13, 303-314 (2012).</li><li>Hall, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+accuracies+of+several+phylogenetic+methods+using+protein+and+DNA+sequences.">Comparison of the accuracies of several phylogenetic methods using protein and DNA sequences.</a> Mol Biol Evol. 22, 792-802 (2005).</li><li>Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGA6:+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+version+6.0.">MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0.</a> Mol Biol Evol. 30, 2725-2729 (2013).</li><li>Ronquist, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MrBayes+3.2:+efficient+Bayesian+phylogenetic+inference+and+model+choice+across+a+large+model+space.">MrBayes 3.2: efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space.</a> Syst Biol. 61, 539-542 (2012).</li><li>Chen, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+transporters+for+intercellular+exchange+and+nutrition+of+pathogens.">Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens.</a> Nature. 468, 527-532 (2010).</li><li>Xuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+oligomerization+for+bacterial+and+plant+SWEET+sugar+transporter+family.">Functional role of oligomerization for bacterial and plant SWEET sugar transporter family.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 3685-3694 (2013).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+evidence+for+a+fusion+of+archaeal+and+bacterial+SemiSWEETs+to+form+eukaryotic+SWEETs+and+identification+of+SWEET+hexose+transporters+in+the+amphibian+chytrid+pathogen+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Phylogenetic evidence for a fusion of archaeal and bacterial SemiSWEETs to form eukaryotic SWEETs and identification of SWEET hexose transporters in the amphibian chytrid pathogen Batrachochytrium dendrobatidis.</a> FASEB J. 30, 3644-3654 (2016).</li><li>Holder, M. T., Zwickl, D. J., Dessimoz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+robustness+of+phylogenetic+methods+to+among-site+variability+in+substitution+processes.">Evaluating the robustness of phylogenetic methods to among-site variability in substitution processes.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 4013-4021 (2008).</li><li>Alfaro, M. E., Holder, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Posterior+and+the+Prior+in+Bayesian+Phylogenetics.">The Posterior and the Prior in Bayesian Phylogenetics.</a> Annu Rev Ecol Evol Syst. 37, 19-42 (2006).</li><li>Suchard, M., Rambaut, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many-core+algorithms+for+statistical+phylogenetics.">Many-core algorithms for statistical phylogenetics.</a> Bioinformatics. 25, 1370-1376 (2009).</li><li>Zierke, S., Bakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPGA+acceleration+of+the+phylogenetic+likelihood+function+for+Bayesian+MCMC+inference+methods.">FPGA acceleration of the phylogenetic likelihood function for Bayesian MCMC inference methods.</a> BMC Bioinformatics. 11, 184 (2010).</li></ol>

저자는 공개 없다.

그것은 뉴클레오티드 또는 아미노산 시퀀스8에 따라 계통 발생 나무를 만들기 위해 생물 학적 연구에 점점 더 인기 끌고있다. 일반적으로, 시퀀스 정렬, 계통 발생 나무 계산 결과의 시각화 및 적당 한 방법 또는 알고리즘, 정렬 된 시퀀스의 평가 포함 하는 실천의 세 가지 중요 한 단계가 있습니다. 제시 연구에서 열 정렬의 3 라운드 실시 했다: 첫째, 첫 번째 및 두 번째 MtN3/타 액 ...

DNA 또는 RNA 순서 생리 및 생 화 확 적인 방법을 통해 분석 하거나 형태학 및 화석 증거를 통해 관찰 될 수 있는 기본 고기에 대 한 유전 정보를가지고. 의미에서 유전 정보 외부 고기 때문에 전자는 후자에 대 한 기초 평가 보다 더 안정적입니다. 진화 연구, 화석 증거에서는 매우 직접적이 고 설득력 있는입니다. 그러나, 미생물와 같은 많은 유기 체를 긴 지질 시대 화석 형성 작은 기회가 있다. 따라서, 뉴클레오티드 시퀀스 및 관련된 현존 생물에서 아미노산 시퀀스 등 분자 정보 진화 관계1을 탐험에 대 한 가치는 있습니다. 현재 연구에서 기본적인 계통 발생 지식과 배우기 쉬운 프로토콜의 간단한 소개 자신의 계통 발생 나무를 구성 하는 이민자를 위한 제공 했다.
동종 유전자, 세포, 또는 심지어 유기2계통 발생 관계를 추론 (뉴클레오티드) DNA와 단백질 (아미노산) 시퀀스를 사용할 수 있습니다. DNA 시퀀스 동안 진화 변화에 의해 영향을 받을 가능성이 더 높습니다. 대조적으로, 아미노산 시퀀스는 훨씬 더 안정 주어진 뉴클레오티드 시퀀스에 동의어 돌연변이 아미노산 시퀀스에서 돌연변이 발생 하지 않습니다. 그 결과, DNA 시퀀스는 반면 아미노산 시퀀스는 먼 관련된 생물3에서 동종 유전자에 대 한 적절 한 밀접 하 게 관련된 유기 체에서 동종 유전자의 비교를 위해 유용 합니다.
아미노산의 맞춤으로 시작 하는 계통 발생 분석 또는 시퀀스, FASTA 형식, 즉, 상 상속 또는 표현 단백질에 나열 된 뉴클레오티드 시퀀스4 한 주석된 게놈 시퀀싱 데이터베이스5 에서 검색 RNA 순서 또는 DNA 순서. 그것은 높은-품질 시퀀스 분석을 위해 수집 하는 것이 중요 하만 동종 시퀀스 계통 발생 관계를 분석 하는 데 사용할 수 있습니다. 많은 다른 플랫폼 Clustal W, Clustal X, 근육, T-커피, MAFFT, 시퀀스 정렬에 사용할 수 있습니다. Clustal 오메가6,7 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), 온라인으로 사용할 수 또는 무료로 다운로드 될 수 있다는 가장 널리 사용 되는. 정렬 도구는 많은 매개 변수를 기본 매개 변수는 대부분의 경우에서 잘 작동 하지만 사용자 정렬, 시작 하기 전에 조정할 수 있습니다. 프로세스가 완료 되 면 정렬된 시퀀스 다음 단계에 대 한 올바른 형식으로 저장 해야 합니다. 그들은 다음 편집 한다 또는 메가 하 여 계통 발생 나무 건축 (를 포함 하 여 아미노산 약어 및 하이픈 길이가 되도록 시퀀스 필요 하기 때문에 BioEdit, 같은 편집 소프트웨어를 사용 하 여 손질. 정렬 된 시퀀스에는 아미노산 또는 뉴클레오티드 없이 어떤 위치 든 지 하이픈으로 표시는 "-"). 일반적으로, 튀어나온 아미노산 또는 뉴클레오티드 맞춤의 양쪽 끝에 모두 제거 되어야 한다. 또한, 열 맞춤에서 잘못 정렬 된 시퀀스를 포함 하는 그들은 약간 귀중 한 정보를 전달 하 고 때로는 혼란 또는 거짓 정보3를 줄 수 있기 때문에 삭제할 수 있습니다. 이 시간에 또는 이후 트리 건설 단계에서 하나 이상의 하이픈을 포함 하는 열을 삭제할 수 있습니다. 또는, 그들은 계통 발생 계산에 사용할 수 있습니다. 순서 정렬 및 트리밍 완료 되 면, 정렬된 시퀀스 FASTA 형식, 또는 차후 사용을 위해 원하는 포맷에 저장 한다.
많은 소프트웨어 플랫폼 다른 방법 또는 알고리즘을 사용 하 여 트리 건설 기능을 제공 합니다. 일반적으로 메서드는 거리 매트릭스 방법 또는 개별 데이터 방법으로 나눌 수 있다. 거리 매트릭스 방법 간단 하 고 빠른 계산, 개별 데이터 메서드는 복잡 하 고 시간이 많이 걸리는 동안에. 공유의 아미노산 또는 뉴클레오티드 순서, 거리 행렬 방법의 높은 수준으로 매우 밀접 하 게 관련된 taxa에 대 한 (이웃 합류: 뉴저지; 산술 평균 unweighted 쌍 그룹 방법: UPGMA) 적합 한; 먼 관련된 taxa, 개별 데이터 방법에 대 한 (최대 가능성: ML; 최대 간결: MP; 베이지안 추론) 최적의3,8입니다. 이 연구에서는 메가 (6.0.6) 및 베이지안 추론 (MrBayes 3.2) ML 방법 계통 발생 나무9를 생성에 적용 했다. 이상적으로, 적절 한 모델 및 매개 변수 사용 하는 다른 방법에서 파생 된 결과 일치, 있을 수 있습니다 그리고 그들은 따라서 더 안정적이 고 설득력 있는.
10메가 사용 하 여 건설 ML 계통 발생 나무에 대 한 프로그램으로 FASTA 형태로 정렬된 시퀀스 파일을 업로드 해야 합니다. 첫 번째 단계는 다음 업로드 된 데이터에 대 한 최적의 대체 모델을 선택 하는 것입니다. 업로드 된 순서에 따라 모든 사용할 수 있는 대체 모델을 비교 하 고 그들의 최종 점수 결과 테이블에 표시 됩니다. (테이블에 처음 나열) 작은 베이지안 정보 기준 (의 BIC) 점수와 모델을 선택 권장 모델 ML 매개 변수를 설정 하 고 계산을 시작. 계산 시간 로드 데이터 (길이 시퀀스 및 taxa의 수)의 복잡 하 고 프로그램은 실행 하는 컴퓨터의 성능에 따라 몇 일 분에서 변화 한다. 계산이 완료 되 면, 계통 발생 나무는 새 창에 표시 됩니다. "FileName.mat"로 파일을 저장 합니다. 나무의 모양을 지정 하는 매개 변수를 설정한 후 다시 한 번 저장 합니다. 이 메서드를 사용 하 여 메가 게시 학년 계통 발생 나무 그림을 생성할 수 있습니다.
MrBayes11나무 건설, 대 한 첫 번째 단계는 넥서스 형식 (파일 형식으로.nex)으로 보통 FASTA 형태로 나열 된 정렬 된 순서를 변환 하입니다. FASTA 파일 넥서스 형식으로 변형 하는 것은 메가에서 처리할 수 있습니다. 다음, 넥서스 형태로 정렬된 순서 MrBayes에 업로드할 수 있습니다. 파일이 성공적으로 업로드 하는 경우 트리 계산에 대 한 상세한 매개 변수를 지정 합니다. 이러한 매개 변수 커플링, ngen 번호 아미노산 대체 모델, 변형 률, 체인 번호 마르코프 연쇄 몬테 카를로 (MCMC)에 대 한 세부 정보를 포함, 분할 주파수의 표준 편차를 평균 하 고. 이러한 매개 변수를 지정한 후 계산을 시작 합니다. 결국, ASC II 코드, 보여주는 하나의 clade 신뢰성 및 다른 표시 지점 길이, 2 개의 나무 숫자는 화면에 표시 됩니다.
나무 결과 "FileName.nex.con"으로 자동으로 저장 됩니다. 이 트리 파일을 열 수 및 기관에 의해 편집 그리고 기관에 표시 하는 그림 추가 수 있도록 게시를 위해 더 적당 한 수정할 수 있습니다.
이 연구에서는 단 세포 진핵생물에서 35 자와 원핵생물에서 57 SemiSWEETs를 포함 하 여 228 달콤한 단백질, 예를 들어 분석 했다. 과자 및 SemiSWEETs는 막12,13에 걸쳐 포도 당과 당, 또는 자당 전송기 특징 이었다. 계통 발생 분석 과자 포함 된 두 개의 MtN3/타 액 도메인 archaeon14와 세균성 SemiSWEET의 진화 융합에서 파생 될 수 있습니다 제안 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1132px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:127px;">Adobe Illustration</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a graphical tool developed by Adobe Systems Software Ireland Ltd. Copyright &#169; 2017</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:127px;">BioEdit</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a biological sequence alignment editor written for Windows 95/98/NT/2000/XP/7. Copyright &#169; Tom Hall</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:127px;">Clustal Omega</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a package for making multiple sequence alignments of amino acid or nucleotide sequences.&#160; http://www.clustal.org/</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:127px;">CorelDRAW</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a graphic design software. Copyright &#169; 2017 Corel Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:127px;">FigTree</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a graphical viewer of phylogenetic trees designed by the University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:127px;">MEGA</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">MolecularEvolutionary Genetics Analysis version6.0 http://www.megasoftware.net/home</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:127px;">MrBayes</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">an Bayesian phylogenetic inference tool</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:127px;">NVIDIA</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a company designs graphics processing units (GPUs) for the gaming and professional markets. Corporation Copyright &#169; 2017</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:127px;">PAUP</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">Phylogenetic Analysis Using Parsimony. David Swofford&#39;s program implements the maximum likelihood method under a number of nucleotide models.</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:127px;">Photoshop</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a raster graphics editor developed and published by Adobe Systems Software Ireland Ltd. Copyright &#169; 2017</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:127px;">RHYTHM</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a knowledge based prediction of hekix contacts. Charit&#233; Berlin &#8211; Protein Formatics Group - Copyright 2007-2009</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:127px;">TMHMM</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a tool for prediction of transmembrane helices in proteins. http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:127px;">Compter</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">4GB memory, Core 2 or above CPU. Windows 7, Windows 10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using phylogenetic analysis to investigate eukaryotic gene origin

계통 발생 분석을 사용 하 여 뉴클레오티드 또는 아미노산 시퀀스 또는 다른 매개 변수를 도메인 시퀀스 등 3 차원 구조는 분자에서 다른 taxa (분류 단위) 사이 진화 관계를 표시 하는 트리를 구성 수준입니다. 계통 발생 분석 사용할 수 있습니다 개별 taxon, 내 도메인 관계 조사를 실질적인 받은 생물 형태학과 생리학, 하지만 어떤 연구자 부족으로 인해 화석 증거에 대 한 변경에 대 한 특히는 생물의 긴 진화 역사 또는 담았다의 부족.
이 텍스트는 계통 발생 방법, 아미노산 순서 정렬 Clustal 오메가, 그리고 둘 다 최대 가능성 (ML) 분자 진화 유전학의를 사용 하 여 후속 계통 발생 나무 건축을 사용 하 여를 사용 하 여에 대 한 자세한 프로토콜 설명 분석 (메가) 및 MrBayes 통해 베이지안 추론. 진 핵 설탕 것 이다 결국 수출 전송기 수 (달콤한) 유전자의 기원 조사, 228 과자 35 달콤한 단백질에서 단 세포 진핵생물과 원핵생물에서 57 약간 단 단백질을 포함 하 여 분석 되었다. 흥미롭게도, SemiSWEETs 원핵생물에서 찾아냈다 그러나 과자는 진핵생물에서 발견 됐다. 이론적으로 다른 방법을 사용 하 여 건설의 계통 발생 나무 2 개는 지속적으로 첫 번째 핵 달콤한 유전자 세균성 약간 단 유전자와 archaeal 약간 단 유전자의 융합에서 줄기 수 있습니다 제안 했다. 그것은 하나는 결론을 끌기 위해는 계통 발생 분석에만 기반으로 어렵거나 심지어 실험 방법을 통해 분별 하는 다른 taxa 사이의 기본 관계를 설명 하는 데 유용 하지만 신중 해야 지적 가치 .

계통 발생 나무 35 달콤한 시퀀스의 첫 번째 MtN3/타 액 도메인의 모든 한 clade와 다른 clade로 클러스터 달콤한 시퀀스의 두 번째 MtN3/타 액 도메인으로 클러스터를 표시 합니다. 또한, 과자 및 SemiSWEETs의 정렬 결과 표시 일부 SemiSWEETs α-Proteobacteria에서 달콤한 시퀀스의 첫 번째 MtN3/타 액 도메인으로 정렬 SemiSWEETs Methanobacteria (archaea)에서 두 번째 MtN3/타 액과 정렬 하는 반면 달콤...

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Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

순서 상 동 자의 진핵생물과 SemiSWEETs에서 prokaryotes에서에 따라 계통 발생 나무를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 계통 발생 분석은 다른 유기 체 그룹에서 동종 단백질 또는 유전자 진화 relatedness를 설명 하는 유용한 도구.

사용 하 여 계통 발생 분석은 진 핵 유전자 원산지 조사

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

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Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

곤충<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 세균 Pathogenesis를 조사 할 수있는 강력한 감염 모델로

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

형광 단백질을 사용하면 아프리카 Trypanosome에서 Glycosome 역학을 모니터링하려면

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

편의적 곰팡이 병원균에 형광 태그 유전자의과 유전자 변형<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...