우리는 그의 멘토링에 대 한 마이클 Rosbash를 감사 하 고이 방법의 개발의 초기 단계 지원. 이 작품은 JST 프레스 토 프로그램, 스위스 국립 과학 재단 (31003A_149893 및 31003A_169548), 유럽 연구 회의 (ERC-StG-311194), 노바 티 스 의료 생물 의학 연구 (13A39)에 대 한 재단과 제네바의 대학에 의해 투자 되었다 .

1. 문화 후드 재고 솔루션의 준비
<ol><li>400 mL 슈나이더 활성 매체 (SAM) x 1 (참조24,25수정) 애벌레 머리의 비보 전 문화에 대 한 최적화의 준비 (표 1). 5 mL 및 플래시 약 수-80 ° c.에 저장, 액체 질소 (선2) 고정</li>
	<li>재고 솔루션 (참조26수정) x 10 희석 Dissecting 염 (DSS) x 1을 준비 (표 2).</li>
	<li>Aliquot fibrinogen 10mg을 4 ° c 단일 사용에 대 한 저장소. 주의: 층 류, 장갑, 그것은 유해한 입고 아래 fibrinogen 무게.</li>
	<li>SAM에서 트 롬 빈 재고 솔루션을 준비 (1500 NIH 단위/밀리 그램) 및 10 µ L aliquot, 플래시 LN2 에 고정 시키고-80 ° c.에 주의: 그것은 유해한 트 롬 빈을 처리할 때 장갑을 착용 한다.</li>
	<li>100의 aliquot 재고 솔루션 페니실린 스 x. -20 ° c.에 계속</li>
	<li>소계 (PTFE) 멤브레인의 동그라미를 잘라 (자료 표 참조) 유리 하단 접시의 안쪽에 맞는 크기를. 70%에 그들을 씻어 EtOH와 다음에 압력가 dH2O. Sterilize UV와 층 류에서 건조. 멸 균 페 트리 접시에 계속. 단일 사용 합니다. 참고: PTFE 가스 교환을 허용 하 고 장기적인 기록 중 증발에서 매체를 방지 하는 다공성 유연한 멤브레인입니다.</li>
</ol>2. 시간 경과 현미경 설치
참고: 다음 설치 연동 스캐너 거꾸로 confocal 현미경에 대 한 (자료 표 참조) 갖추고 있다 공명 스캐너 (8000 Hz). 시스템 공명 스캐너 함께 phototoxicity 및 photobleaching를 방지 하는 매우 중요 한 사진 배율 검출기를 포함 되어 있습니다. 온도 및 습도 제어 됩니다 현미경 환경 챔버 내에서 하는 현미경의 대부분을 커버 ( 자료 표참조).
<ol><li>무대-가기 습기 장소입니다.</li>
	<li>25 ° C와 80% 습도에 현미경 챔버 equilibrate를 온도 및 습도 컨트롤러를 켭니다.</li>
	<li>지속적인 암흑 (DD)에서 실험을 수행, (현미경 챔버는 불투명 재료의 만든) 않으면 불투명 천으로 현미경 환경 챔버를 커버.</li>
	<li>물 침수 목표를 사용 하 여 목표 위에 물 침수 마이크로 디스펜서 놓고 하는 동안 시간 경과 영상 일정 한 속도로 물 걸 Autoimmersion 목표 컨트롤러 소프트웨어 프로토콜 프로그램. 참고: 물 디스펜서 또는 건조 렌즈 물 침수 목표는 권장 장기 라이브 이미징, 침수 매체의 다른 유형을 건조 것입니다.</li>
	<li>무대, 습도 챔버 내부에 페 트리 접시 홀더를 배치 합니다.</li>
	<li>현미경 소프트웨어를 실행 하 고 첫 번째 대화 상자에서 스캐너를 공 진 모드를 선택 합니다. 메시지가 표시 되 면 단계를 초기화 하는 확인을 선택 합니다. 구성 탭에 하드웨어 구성 관련 레이저 라인에 스위치를 이동 합니다.</li>
	<li>XY 패널 양방향 모드를 선택 하 고 이미지 수집 매개 변수를 설정 하 고 취득 탭 이동 합니다. 참고: 설명된 영상 설치 여기에 제시 된 (그림 2, 그림 3 과 영화 1) 관찰 circadian 표현의 특정 형광 기자 최적화 됩니다. 다음 매개 변수는 가장 우리의 사양에 맞게 선정 됐다: 40 X 물 침수 목표, 8 X 선 평균 512 × 512 이미지 해상도. 멀티 컬러 이미징에 대 한 순차적 이미지 수집이 필요한 때 한 fluorophore와 다른 중복 (여기, 노란 형광 성 단백질 (YFP) 방출 및 토마토 여기 오버랩의 파장)의 여기 파장의 방출 파장. 그것은 빠른 고 Z 스택의 인수 중 시계 뉴런의 이동은 무시할 수 "스택" 사이 순차 모드를 선택 합니다. 현미경 설정을 각 실험의 목표에 맞게 적응 해야 합니다.</li>
</ol>3입니다. 애벌레 두뇌 Explant 문화의 설치
참고: 뇌 explants의 포함 해 부에서 전체 절차 ~ 30 분 걸립니다.
<ol><li>
문화 후드 시 약의 준비입니다.
	<ol>
<li>트 롬 빈의 약 수를 해 동 하 고 (3.3 단계) 포함 단계까지 실내 온도에 유지. 단일 사용 합니다.</li>
		<li>37 ° C에서 샘의 약 수를 빠르게 해 동 하 고 단일 사용에 대 한 얼음에 계속.</li>
		<li>10 mg/ml fibrinogen의 약 10 밀리 그램 수로 샘을 추가 하 고 부드럽게 터치 포함 단계 (단계 3.3) 및 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 단일 사용 합니다. 참고: 않습니다 하지 품 어 2 h 이상 fibrinogen 솔루션 유해를 시작으로.</li>
		<li>100 x 재고 페니실린 스의 약 수 동 1 샘의 2.5 mL 준비 페니실린-스 (샘/항생제) x. 실내 온도에서 보관. 참고: 저장소 나머지 100 x 재고 페니실린 스 4 ° C에서 1 달까지.</li>
		<li>나머지 샘에서 500 µ L의 약 수를 준비 합니다. 얼음에 계속.</li>
		<li>장기적인 이미징에 대 한 유리 하단 접시 (그림 1A)의 바닥의 플라스틱 부분에 압력가 진공 그리스를 적용 하 고 UV 층 류에서 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
중앙 신 경계와 복 부 신경 코드 절 개가 고
	<ol>
<li>청소는 집게와 2 x 3-잘 유리 해 부 요리 70 %EtOH. 4 우물에 DSS의 400 µ L와 한 우물에서 샘의 400 µ L를 붓는 다. 얼음에 계속.</li>
		<li>애벌레를 포함 하는 비행 중간에 밖으로 푸 고 집게와 방황 아닌 3 탈피 애벌레 (L3)를 선택. 2 DSS 가득 우물에 그들을 연속적으로 린스. 3 DSS 가득 잘 애벌레 anesthetizes 얼음에 그들을 유지. 참고: L3 지속 25 ° c.에 약 2 일 순수 관련 기간에 뇌를 관찰 하 우리는 방황 아닌 L3 유 충을 사용 하기로 결정 했다. L-LNvs, DN3s, 등 시계 뉴런의 다른 하위 방황 L3 단계에서 형성 시작 하지만 그들은 반드시 자전거 아직 (데이터 표시 되지 않음). 따라서, 이미지 수 시계 뉴런 (데이터 표시 되지 않음),이 단계에서 사이클링 그것 이지만 신중 하 게 데이터 분석에 대 한 개발에서 이미 기능 애벌레 시계 신경 세포를 구별 하는 것이 중요 합니다. 비 방황 L3 25 ° c.에 누워 계란 후 약 4.5 4 일 표시 이 프로토콜을 사용 하 여 circadian 리듬을 공부, 하려면 동기화 (끌고가 다)에서 12 h/12 h LD 개발 애벌레 L3 애벌레를 수집 하기 전에 3 일 동안 25 ° C에서 주기.</li>
		<li>4 DSS 가득 잘, 애벌레,27내부 메서드 사용 하 여 세 정을 위해 사용 되지 않은 어떤 좋은 집게와 애벌레 두뇌를 해 부.<ol>
<li>간단히, 유 충 2에, 부드럽게 입 고리 집게의 쌍 꼬집어 잘라내어 집게, 따라서 뇌를 노출의 다른 쌍을 사용 하 여 몸 벽 내부를 롤. 모든 기도는 시체의 나머지 부분에 연결 된 신경을 절단 하 여 뇌를 무료.</li>
			<li>20 µ L 피 펫 (DSS 미리 씻어 서)와 DSS의 약 3 µ L에서 뇌를 발음 하 고 샘 가득 잘에서 분배. 최대 7 두뇌에 대 한 절차를 반복 합니다. 주: 해 부 취 애벌레 및 냉장 두뇌 차가운 표면에 수행 되어야 한다. 예를 들어 얼음 냉장 물 순환 펌프에 연결 된 냉각 블록에 해 부 접시를 놓습니다. 해 부 절차 소요 ~ 30의 뇌 당. 그것은 두뇌와 그대로 복 부 신경 코드에 연결 된 눈/더듬이 imaginal 디스크를 유지 하는 것이 중요입니다. 이러한 부분을 찢 어 두뇌를 손상 하 고 문화의 질을 줄일 것입니다. 또한, 공기에 머리를 노출 하지 마십시오. 첫 번째 뇌 해 부 애벌레의 부분을 포함 하는 DSS 위아래로 피 펫을 발음 하기 전에 그것으로 두뇌에서 방지 팁의 벽에 고정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 차원 매트릭스에 장착 (~ 20 분) 뇌 explants의 포함.
	<ol>
<li>잠수함 fibrinogen 작업 솔루션 (fibrinogen 최종 농도 ~3.3 mg/mL, 뇌 당 10.5 µ L)에서 해 부 두뇌 다음과 같습니다.</li>
		<li>(동일한 팁 섹션 3.2.3에서에서 사용)와 샘/항생제의 3.5 µ L 발음. 동일한 피 펫 팁으로 잘 해 부 해 부 두뇌에 있는 샘/항생제 매체를 분배 하지 않고 발음.</li>
		<li>분배는 두뇌와 멸 균 페 트리 접시의 뚜껑에 매체. 두뇌를 포함 하는 드롭에 샘/항생제의 또 다른 3.5 µ L와 따뜻한 fibrinogen/샘 10 mg/mL 해결책의 3.5 µ L를 추가 합니다. 20 µ L 피 펫 팁 pipetting으로 뇌 주변의 솔루션을 부드럽게 혼합. 참고:이 단계에서 겸 자 보다는 피 펫을 사용 하 여 강조 하는 두뇌 피 한다.</li>
		<li>2 µ L에서에서 fibrinogen 작업 솔루션의 고 작은 원으로 유리 하단 접시의 coverslip에 적용. 트 롬 빈의 0.8 µ L을 추가 하 고 피 펫 팁 매우 신속 하 게 혼합. fibrinogen 섬유 소에 변환 되 고 유해 하기 시작.</li>
		<li>두뇌 fibrinogen 작업 솔루션 (단계 3.3.1) 집게의 쌍 사이에서 앉아 고 섬유 소의 흰색 매트릭스 표시 되는 행렬에 위치. (시계 신경 세포 이미징)에 대 한 뇌 앞쪽 측면 아래로 동양. 밀어 최대한 가까이 커버 유리에. 섬유 소 응고 섬유 소의 레이어의 구성 됩니다. 한 레이어를 선택 하 고 매트릭스를 분리 하지 않고 작고 부드러운 움직임을 뇌 위에 접어.<ol>
<li>뇌를 안정 시키기 위해 응고의 다른 부분에서 2 ~ 3 회 반복 합니다. 참고: 때 집게와 두뇌를 처리, 건조 또는 물리적 스트레스 부과 주의 해야 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>트 롬 빈의 행동을 막으려고 포함된 뇌 위에 샘/항생제의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>나머지 머리를 탑재 하는 절차를 반복 합니다. 그것은 최대 5 유리 하단 접시에 6 두뇌를 포함 수 있습니다.</li>
		<li>장기 라이브 이미징에 대 한 내부 잘 (유리 부분)에서 샘/항생제의 600 µ L를 추가 합니다. 매체 위에 미리 잘라 PTFE 멤브레인을 하단 (3.1.5) (그림 1A)의 플라스틱 부분에 적용 하는 진공 그리스에 그것을 막대기.</li>
		<li>약리학 적인 분석에 대 한 샘/항생제 (그림 1B)의 2 개 mL로 접시를 채우십시오. 매체의 osmolality은 신경 세포의 생존에 중요 한 참고: 그것을 매체의 증발을 피하기 위해 매우 중요 하다. 따라서, 장기 이미징 실험에 대 한 그것은 문화 접시 PTFE 막으로 밀봉 하는 데 필요한입니다. 반면 단기 실험, 멤브레인 씰링 필요 하지 않습니다 접시 중간의 2 개 mL 가득 고 습도 챔버에 모니터링.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 시간 경과 이미지 수집
<ol><li>페 트리 접시 홀더 무대 최고 습도 챔버 내부에 유리 바닥 접시를 놓습니다.</li>
	<li>인식 탭에서 z-스택 패널에가 고 현미경 소프트웨어 (2 µ m × 40에서 그림 2 와 그림 3, 영화 1에 표시 된 실험)에서 z-섹션 단계를 설정. coverslip와는 coverslip 가까이 뇌 explant의 표면에 끝에서 멀리 비행기에서 z 스택의 시작 부분을 설정 합니다. 비록 뇌 움직임 무시할 수 있습니다, 그리고 시작 및 z 스택의 끝 부분에서 여분의 z-섹션 추가.</li>
	<li>마크 & 패널 설정 다 위치 이미지 수집을 찾을로 이동 합니다. 40 X 목표 1 두뇌 반구 보기의 필드 내에서 캡처할 수 있습니다.</li>
	<li>수집 모드 패널 및 선택 xyzt (z-스택 시간 경과)로 이동 합니다. 시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 주파수 매개 변수 설정. 참고: 원하는 주파수와 시간 경과 이미지를 취득 합니다. Note 시간 경과 간격 2 시간 보다 짧은 장기 라이브 영상 (24-72 h) 적은 자전거 신경에 있는 결과 경향이 아마도 때문에 뉴런의 생존 능력을 감소 시킨다. 데이터 볼륨 확장 시키는 데이터 분석 및 저장 더 도전 이미지 수집 증가의 비율으로.</li>
</ol>5. 약리 치료 단기 라이브 영상으로 뇌 Explants의
참고: 다음 절차는 본질적으로 동일 장기 이미징에 대 한 하지만 PTFE 멤브레인을 필요 하지 않습니다. 화학 물질 문화에 추가 될 때 빛을 파랑 머리 노출 피하려고 현미경 붉은 빛으로 어두운 방에 두어야 한다.
<ol><li>시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 약물 응용 프로그램 전에 초기 계획 데이터를 스캔 수 설정. 스캔을 시작 합니다.</li>
	<li>베이스 후 검사가 완료 되 면, 현미경 시스템의 스캔 헤드를 리프트. 무대 최고 습도 컨트롤러의 뚜껑을 제거 하 고 매우 신중 하 게 그것을 이동 하지 않고 유리 하단 접시의 뚜껑을 제거 합니다.</li>
	<li>필요한 경우 적절 한 양의 문화 매체를 제거 합니다. 매체에서 실험적인 솔루션을 추가 하 고, 신중 하 게, 아주 부드럽게 조화를 살 균 파스퇴르 피 펫 두뇌 explants 건드리지 않고. 참고: PDF의 목욕 용, (10 %DMSO)에서 2 µ M PDF 재고 솔루션을 사용 합니다.</li>
	<li>유리 바닥 접시와 습 한 챔버 스캔 머리 뚜껑을 교체 합니다. 사용 하 여, 현미경 챔버 주위 검은 불투명 천으로 재조 정할.</li>
	<li>라이브 스캔 모드에서 그들의 원래 위치에서 두뇌 인지 확인 하십시오. 필요한 경우 조정 합니다.</li>
	<li>시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 스캔 수 설정. 스캔을 시작 합니다. 참고: 여기 우리가 테스트 시간 경과 이미지 최대 10 h에 대 한 모든 시간을 획득.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+circadian+pacemaker+circuit:+Pas+De+Deux+or+Tarantella?.">The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).</li><li>Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clock+shop:+coupled+circadian+oscillators.">The clock shop: coupled circadian oscillators.</a> Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).</li><li>Zhang, Y., Emery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15+-+Molecular+and+neural+control+of+insects+circadian+rhythms.">Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms.</a> Insect molecular biology and biochemistry. , 513-551 (2012).</li><li>Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+circadian+timekeeping+in+Drosophila.">Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila.</a> Adv Genet. 74, 141-173 (2011).</li><li>Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+clocks+in+the+brain:+an+update+of+the+morning+and+evening+oscillator+model+in+Drosophila.">Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila.</a> Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).</li><li>Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+synchronization+and+rhythmicity+in+larval+photoperception-defective+mutants+of+Drosophila.">Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila.</a> J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).</li><li>Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+circadian+imaging+reveals+a+PDF-dependent+transcriptional+regulation+of+the+Drosophila+molecular+clock.">Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock.</a> Sci Rep. 7, 41560 (2017).</li><li>Hyun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+GPCR+Han+is+a+receptor+for+the+circadian+clock+neuropeptide+PDF.">Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF.</a> Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).</li><li>Lear, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G+protein-coupled+receptor,+groom-of-PDF,+is+required+for+PDF+neuron+action+in+circadian+behavior.">A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior.</a> Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).</li><li>Mertens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDF+receptor+signaling+in+Drosophila+contributes+to+both+circadian+and+geotactic+behaviors.">PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors.</a> Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).</li><li>Ayaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li><li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culturing+of+whole,+developing+Drosophila+brains.">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Zschatzsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+branching+dynamics+by+axon-intrinsic+asymmetries+in+Tyrosine+Kinase+Receptor+signaling.">Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling.</a> Elife. 3, e01699 (2014).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li><li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+evokes+rapid+circadian+network+oscillator+desynchrony+followed+by+gradual+phase+retuning+of+synchrony.">Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony.</a> Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).</li><li>Sehadova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+entrainment+of+Drosophila's+circadian+clock+involves+the+gene+nocte+and+signaling+from+peripheral+sensory+tissues+to+the+brain.">Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain.</a> Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).</li><li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+Drosophila+circadian+pacemakers+display+nonsynchronous+Ca(2)(+)+rhythms+in+vivo.">Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo.</a> Science. 351 (6276), 976-981 (2016).</li><li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Series+of+Suppressive+Signals+within+the+Drosophila+Circadian+Neural+Circuit+Generates+Sequential+Daily+Outputs.">A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs.</a> Neuron. , (2017).</li><li>Kuppers-Munther, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+culturing+strategy+optimises+Drosophila+primary+cell+cultures+for+structural+and+functional+analyses.">A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses.</a> Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Larval+Drosophila+Eye-Antennal+Discs+in+Vitro.">Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro.</a> J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).</li><li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels.">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster.">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (1), e85 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culturing+of+Drosophila+brain+as+a+method+to+live+image+pupal+brains:+insights+into+the+cellular+mechanisms+of+neuronal+remodeling.">Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+keep+non-adhering+living+cells+in+place+on+glass+for+perfusion+or+fixation.">Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation.</a> Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Lukinavi&#269;ius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy.">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nature Communications. 6, 8497 (2015).</li><li>Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+axonal+transport+in+Drosophila+pupal+brain+explants.">Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants.</a> Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).</li><li>Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+imaging+of+circadian+rhythms+detected+with+a+Nipkow+spinning+disk+confocal+system.">Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).</li><li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리 교양된 애벌레 머리의 장기 형광 시간 경과 현미경에 대 한 방법을 설명합니다. 이 유형의 실험의 성공에 따라 달라 집니다 문화, 건강 등의 여러 요소 두뇌 explant, 형광 강도 및 기자, 시간적 및 공간적 해상도의 신호 대 잡음 비율의 동원 정지를 위한 방법 및 explant에 대 한 접근 이러한 요소는 상호 배타적 될 수 있습니다. 예, 문화, 건강에 영향을 미치는 시간 경과 주파수를 증가 하 고 ...

Circadian 시계 도움이 지구의 24 시간 회전에 의해 생성 된 주기적인 환경 변화에 적응 하는 생물. 연동된 transcriptional 변환 피드백 루프는 일반적으로 종1에 걸쳐 circadian clock의 분자 기계를 기반이 됩니다. Circadian 심장 박 동기 회로 구성 포함 하는 클록의 명암 (LD) 등 통합 하는 매일의 과다의 리듬을 온도 사이클 환경 단서에 의해 전달 하는 일의 시간 정보를 통합 하는 신경 생리와 행동 프로세스2,3. 신경 입력 / 출력을 갖는 분자 리듬의 조정 circadian 회로 하지만 부분적 으로만 이해 하는 남아의 작업에 대 한 비판적으로 중요 하다.
초파리, 분자 시계의 코어에 클록/사이클 (CLK/CYC) heterodimer 활성화 기간 (당)의 전사와 영원한 (팀). 당 및 팀 복합물을 형성 하 고 그들은 CLK/CYC 그리고 결과적으로 그들의 자신의 전사의 transcriptional 활동을 억제 핵를 입력 합니다. Post-transcriptional 및 포스트 번역 상 규정 CLK/CYC-중재 전사와 당에 의해 억압 사이 지연이 발생할 / 팀, 24 h 분자 진동1,,34 년경의 세대를 보장 . 이러한 분자 시계 폼을 포함 하는 약 150 신경 성인 circadian 동작을 제어 하는 회로5를이동 합니다. 훨씬 더 간단한 아직 완전 하 게 작동 circadian 회로-5 복 부 측면 뉴런 (LNvs; 4 PDF 확실성 LNvs 및 하나의 PDF 음수가 LNv, 아래 참조), 2 등 쪽 신경 1 (DN1s)과 2 등 쪽 신경 2s (DN2s)-시계 뉴런의 3 그룹의 구성 된는 애벌레에 존재 하는 뇌6,7.
간단한 애벌레 circadian 회로 간 신경 통신 및 분자 시계 사이의 상호 작용을 공부 하는 우수한 모델을 제공 합니다. 우리의 새로 개발된 된 형광 기자 당-TDT를 단백질의 subcellular 위치 당의 수준, 모방을 사용 하 여 우리 하고자 했다 애벌레 circadian 회로 에 다른 시계 신경 하위 그룹에 분자 시계의 역학 특성 8. 또한, 4 LNvs 신경 레벨9,,1011circadian 리듬을 조절에 의해 생산 하는 neuropeptide 안료 분산 요소 (PDF)의 핵심적인 역할을 알고, 우리가 하 고 싶 었 직접 검사 분자 시계에 PDF의 효과입니다. 이 위해, 우리는 애벌레 뇌에서 리듬 시간 경과 confocal 현미경 검사 법에 의해 여러 일 동안 explant circadian 유전자 발현을 모니터링 하는 방법을 개발 했다. 프로토콜 당 TDT의 수준에 PDF 또는 다른 화합물의 효과 테스트 하는 약리 분석 실험에 대 한 적응도 했다. 따라서, 적응 뇌 explant 문화 약물 응용 프로그램에 액세스할 수 만들기, 시간적 해상도 증가 하 고 짧은 기간에 대 한 이미징 구성 되어 있습니다.
다른 발달 단계에의 초파리 두뇌의 비보 전 문화 이전 설립된12,13,,1415,16,17 되었습니다. ,18. 반면 이러한 프로토콜 이미징 다양 한 생물학 현상에 대 한 사용 되었습니다, 그들 중 일부는 단일 셀 해상도 이미지와 호환 되지 않는 또는 몇 시간에 대 한 문화를 지원 하지 않습니다. 초파리 에서 circadian 뉴런의 장기 라이브 영상을 수행 하는 대체 방법을 분자 리듬19,,2021 의 생물 발광 영상 등의 형광 이미징 칼슘 표시기 빛 시트 현미경22,23. 생물 발광 영상 더 높은 시간 해상도 얻을 수 있지만 가벼운 시트 현미경 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 적응 하실 수 있습니다 그들은 공간 해상도에 제한 되 고 특수 현미경 시스템 필요.
여기 설명 하는 방법은 여러 일 동안 단일 셀 해상도에서 전체 뇌 문화에 형광 신호를 시각화 하기 위해 지어진 다. 이 손쉬운 방법과 다양 한 교양 이미지 성인 비행 두뇌와 초파리 신경 생물학에 있는 많은 다른 문제를 연구 하는 약리 실험에 대 한 적응 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose &quot;suitable for insect cell culture&quot; whenever available</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+) Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1000</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>L-(&amp;minus;)-Malic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>Succinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9512</td><td></td></tr><tr><td>Fumaric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8509</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Ketoglutaric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1128</td><td></td></tr><tr><td>Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened</td><td>BioConcept Ltd. Amimed</td><td>2-01F30-I</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-KOH, pH 7.4</td><td>E&amp;amp;K Scientific Products</td><td>EK-654011</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from bovine plasma</td><td>Calbiochem (Merck)</td><td>341573-1GM</td><td>CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9549</td><td>CAUTION: Health Hazard, use gloves</td></tr><tr><td>PDF, NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td><td>Chi Scientific</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Vaccum grease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18405</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td><td>fisherscientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 &amp;mu;m</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) film</td><td>Dupont</td><td>200A Teflon FEP Film</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m, PVDF, 33&amp;nbsp;mm, gamma sterilized</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m, PVDF, 33&amp;nbsp;mm, gamma sterilized</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Three-well glass dissection dish</td><td>Any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, size 5, Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature control chamber</td><td>Life Imaging Services</td><td>The CUBE &amp;amp; BOX temperature control system, custom designed</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top humidity controller</td><td>Life Imaging Services</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SUM-stack creation and 3D correction drift plugin</td><td>ImageJ software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x iterative deconvolution</td><td>AutoQuant and Imaris software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell resolution fluorescence live imaging of drosophila circadian clocks in larval brain culture

Circadian 맥 박 조정기 회로 리듬 행동과 생리 적인 출력 일 또는 밤 주기 등 환경 신호 조정 총괄. 각 맥 박 조정기 뉴런 내에서 분자 시계 유전자 발현, 기초 회로의 작동에 필수적인 리듬 신경 기능에에서 circadian 리듬을 생성 합니다. 맥 박 조정기의 다른 서브 클래스에서 개별 분자 발진기와 신경 신호와 상호 작용의 속성의 조사 circadian 맥 박 조정기 회로의 더 나은 이해를 생성 합니다. 여기, 우리 제시 시간 경과 형광 현미경 접근 시계 교양된 초파리 애벌레 두뇌의 신경에 있는 분자 시계를 모니터링 하기 위해 개발. 이 메서드는 단일 셀 해상도 유전자 인코딩된 형광 circadian 기자의 리듬의 여러 날 녹음을 수 있습니다. 이 설치 밀접 하 게 다양 한 화합물의 분자 시계 실시간 응답을 분석 하는 약리 조작 결합 될 수 있다. Circadian 리듬, 넘어 강력한 초파리 유전자 기술 함께에서이 다목적 방법 라이브 뇌 조직에서 다양 한 신경 분자 과정을 공부 하는 가능성을 제공 합니다.

여기, 우리가 애벌레 뇌 문화 비보 전 기자 식에 PDF 목욕 응용 프로그램의 라이브 이미징 결과에 circadian 형광 기자의 장기 기록의 대표적인 결과 보여줍니다.
비 방황 L3 유 충 분자 시계 기자 당 TDT와 UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4 (그림 1C) LD. 두뇌에서 개입 했다 시계 신경 드라이버에 의해 구동 해 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture at JoVE.com

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-drosophila-circadian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

7.5K 조회수.  University of Geneva. 이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

비디오: Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 눈

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

연구

발생학

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

신경과학

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

생물학

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Drosophila melanogaster Third Instar 유충의 살아있는 뇌 이식 이미징

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

저자 스포트라이트: 비대칭 세포 분열 역학 조사: 초파리 유충 뇌 외식의 실시간 이미징을 위한 프로토콜 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Drosophila melanogaster Third Instar 애벌레 뇌의 생세포 이미징

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

초파리 뉴런 개발시 빠른 수지상 분지 역학의 시간 경과 라이브 이미징 및 정량화

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

의 라이브 영상

의 라이브 영상

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서

Drosophila melanogaster Third Instar 애벌레 뇌의 생세포 이미징

Drosophila melanogaster Third Instar 애벌레 뇌의 생세포 이미징

Drosophila melanogaster Third Instar 애벌레 뇌의 생세포 이미징

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

초파리 뉴런 개발시 빠른 수지상 분지 역학의 시간 경과 라이브 이미징 및 정량화

의 번데기 케이스를 통해서 영상