Name: high resolution 3d imaging of the human pancreas neuro-insular network
Uploaded: 2018-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network at JoVE.com

저자는 박사 앤 푸와 기술 지원에 대 한 조셉 Canzano, 박사 제니퍼 Treweek 귀중 한 조언, 그리고 닥터 크리스틴 Overton 및 MCT 스탠포드 대학 선명도 워크샵을 통해 교육에 대 한 박사 칼 Deisseroth 감사합니다. JDRF nPOD 및 장기 조달 조직 조직 샘플을 제공합니다. 이 작품은 JDRF (47-2014-1), 헴 슬 리 자선 신탁 (HCT 2015-PG-T1D052) 및 MCT에 NIDDK 1OT2 TR001773에 의해 투자 되었다.

모든 실험은 플로리다의 대학 기관 검토 위원회 및 연방 정부의 지침에 따라 실시 했다.
주의: Paraformaldehyde 및 아크릴은 독성 irritants입니다. 적절 한 개인 보호 장비 (실험실 외 투, 장갑, 눈 보호)와 증기 두건에서 시 약을 처리 합니다.
1. 포름알데히드 고정 조직 deparaffinization (신선한 조직 작업 하는 경우 2 단계로 건너)
<ol><li>새로운 면도날 또는 메스를 사용 하 여 조직의 표면에 수직인는 파라핀을 극복. 조직 풀어 마무리의 가장자리에는 파라핀을 잘라. 부드럽게 느슨하게 하 고 허가를 받아야하는 광학 조직을 제거 겸 자 또는 주걱을 사용 합니다. 부드럽게 주걱 (그림 1A)를 사용 하 여 조직에서 초과 파라핀 다쳤어요.</li>
	<li>크 실 렌 (3 x 3 x 3 m m 부분의 조직에 대 한 약 30 mL)와 함께 유리 용기를 실 온 (RT)에서 24 시간이 솔루션 조직을 품 어.</li>
	<li>1.2.1와 같은 볼륨으로 신선한 자일 렌으로 다른 유리 용기를 채우십시오. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어</li>
	<li>1.2.1와 같은 볼륨으로 원뿔 관으로 100% 에탄올을 놓습니다. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어</li>
	<li>1.2.1와 같은 볼륨으로 원뿔 튜브에 95% 에탄올을 놓습니다. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어</li>
	<li>1.2.1와 같은 볼륨으로 원뿔 관으로 70% 에탄올을 놓습니다. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어</li>
	<li>린스 0.01 M 인산에서 조직 버퍼링 식 염 수 (PBS) 및 조직 파라핀 (그림 1B, 오른쪽 패널)의 무료는 실시간 확인에서 24 h에 대 한 equilibrate를 원뿔 튜브에 0.01 M PBS에서.</li>
</ol>2. 준비 4 %Paraformaldehyde (PFA) 정착 제
<ol><li>플라스틱 10 mL 16% PFA 50 mL 원뿔 튜브로 4 mL 0.1 M PBS, 추가 하 고 추가 26 mL 증류수 이온 (ddH2O). 뚜껑 닫고 잠시 혼합.</li>
	<li>4%의 더 큰 볼륨 미리와 aliquots에서 냉동 PFA는 만들 수 있습니다. 4 ° C에서 1 주 및 1 개월-20 ° c.에 aliquots는 실 온 (RT)에서 1 일에 대 한 좋은</li>
</ol>3. 췌 장 고정
<ol><li>갓된 4%에서 췌 샘플 (1 x 1 x 2 cm ≤) 수정 PFA 48 h 4 ° C에서. 샘플 1 x 1 x 2 cm를 사용 하 여 메스 또는 면도칼으로 작은 해 부 보다 큰 경우 개 더 이상으로 보다 1 ㎝ 두께. 각 씻어 적어도 15 분 동안 0.01 M PBS의 세 가지 변화에서 조직 샘플을 세척 하 고 사용까지 0.01 %PFA / 0.01 M PBS 또는 0.5% 나트륨 아 지 드/0.01 M PBS에에서 15 mL 원심 분리기 튜브에 저장.</li>
	<li>고정, 후 추가 처리를 위해 1-2 m m 두꺼운 섹션으로 조직 섹션. 하도 단면에 vibratome를 사용 합니다. 참고: 섹션의 마지막 수 시작 샘플의 크기에 따라 달라 집니다.</li>
</ol>4. 하이드로 겔에 조직 포함
<ol><li>다음과 같이 4% 아크릴/1 %paraformaldehyde (A4P1) 하이드로 겔 단위체 솔루션 200ml를 준비:<ol>
<li>마그네틱 볶음 판 위에 양동이에 얼음에 플라스 크를 놓습니다. 플라스 크는 평평 앉아 있는지 확인 하 고 자기 볶음 바 추가 합니다.</li>
		<li>다음 순서로 추가: 147.8 mL 감기 (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL 0.1 M PBS, 20 mL 감기 (4-8 ° C) 40% 아크릴 솔루션, 12.2 mL 16 %PFA 솔루션, 및 250 mg 버지니아-044 초기자. 적어도 10 분 동안 자기 볶음 바 전체 히드로 솔루션을 혼합 하 고 단계에 대 한 얼음에 솔루션을 떠나.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하이드로 겔 솔루션을 포함 하는 플라스 크가 옆에 얼음에는 장소 15 mL 원뿔 튜브. 단량체 솔루션의 14 mL 튜브에 플라스틱 고 1-2 m m 두께 고정된 조직 샘플의 한 조각을 추가 합니다. 다음 모자는 튜브.</li>
	<li>4 ° C에서 3 일 동안 단위체 솔루션에서 샘플을 품 어 고 빛 으로부터 보호 합니다. Aliquot 어떤 나머지 모노 머 솔루션 및 나중에 사용-20 ° C에서 저장.</li>
</ol>5. 드 모노 머 솔루션 및 유해는 하이드로 겔
<ol><li>가스 N28을 사용 하 여 하이드로 겔 단위체 솔루션에서 산소를 제거 합니다.<ol>
<li>얼음 양동이 준비 하 고 얼음에 하이드로 겔 단위체 솔루션에는 샘플을 배치.</li>
		<li>샘플, 파라핀, 필름과 타이머 당 2-3, 18-게이지 피하 주사 바늘을 수집 합니다. 질소 흐름 수 있도록 질소 탱크에 있는 튜브를 연결 합니다. 얼음에 샘플을 유지 하면서 신중 하 게 한쪽에 샘플을 포함 하는 원뿔 튜브의 뚜껑을 뚫 고 때까지 통해 피하 바늘은 액체 단량체 솔루션의 표면 아래를 누릅니다.</li>
		<li>펑크는 캡의 반대 측에 다른 피하 주사를 사용 하지만 침수 될 그것을 허용 하지 마십시오. 참고: 두 번째 바늘 튜브를 환기 합니다.</li>
		<li>피하 주사는 히드로 아래 물속에 질소 탱크에서 튜브를 연결 하 고 천천히 때까지 액체를 통해 꾸준히 버블링은 질소를 켭니다.</li>
		<li>10 분 동안 액체를 통해 거품을 질소를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>산소 제거 되 면 신속 하 게 두 바늘을 제거 하 고 커버 튜브와 환경 사이 가스의 어떤 더 교류를 방지 하기 위해 파라핀 영화와 모자. 3 h는 히드로 유해를 37 ° C에서 인큐베이터에 degassed 샘플을 놓습니다.</li>
</ol>6. 조직 개간
<ol><li>500 mL 지우기 솔루션 (pH 8.5에서 4 %SDS)를 준비 합니다. DdH2O ~ 300 mL, 50 mL 0.1 M PBS와 20 g SDS 분말 자석 저 어 바 교 반 하면서 추가 합니다. 수산화 나트륨과 염 산이 pH 8.5 사용 하 여 솔루션을 조정 합니다. 마지막 볼륨은 500 mL까지 ddH2O를 추가 합니다.</li>
	<li>중 합, 후 멀리 초과 하이드로 겔을 부 어 하 고 화학 폐기물 용기에 그것을 삭제 합니다. 부드럽게 샘플에서 멀리 하이드로 겔을 닦아 하 고 화학 폐기물 용기에 폐기 종이 타월을 사용 합니다.</li>
	<li>각 세척 단계 샘플 0.01 M PBS의 3-5 교류에 (삭제 세척 액체 화학 폐기물에) 15 분 동안 씻어. 버퍼를 비운의 40 mL 50 mL 원뿔 튜브에 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>37 ° C에서 개간 버퍼에 샘플을 품 어 하 고 매일 신선한 개간 버퍼에 샘플을 변경 합니다.<ol>
<li>적절 한 청소를 보장 하기 위해 개간 버퍼 (~ 8 주가 3 mm x 3 mm x 3 mm 샘플) 샘플 크기에 따라 2-8 주에 대 한 샘플을 둡니다.</li>
		<li>모니터링 조직 개간 하 고 완료 되 면 중지 합니다. 샘플 확인 하기 위해 적절 한 개간 빛까지 개최 하 여 적절 하 게 투명 인지 확인 (일반적으로 일부 황갈색 색소에에서 남아 exocrine 지역). 참고:-선택된 샘플 가장자리에 닳은 나타나고 텍스처 집게로 집어 매우 부드러운 될 것입니다. 균등 하 게 취소를 샘플에 대 한 일반적입니다. 또한, 조직 설치 미디어 (삽입, 그림 1C)에 배치 될 때까지 완전히 투명 하 게 되지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 여러 면역 형광 검사
<ol><li>씻어 60 rpm에서 통에 샘플 RT에서 하루 동안 40 mL 0.01 M PBS (4-5 버퍼 변경 총, 40 mL에 각 세척, 최종 세척까지 모든 h 변경) 종종 신선한 버퍼에 변경. 실시간에서 밤새 계속 최종 세척 하자</li>
	<li>협정 얼룩 버퍼를 준비 합니다. 500 mL 0.01 M PBS, 50 mg 나트륨 아 지 드와 0.5 mL TritonX-100 추가. 잘 믹스.</li>
	<li>1 차 항 체와 함께 샘플을 품 어.<ol>
<li>2 mL 플랫 바닥 튜브에 버퍼를 얼룩 기본 협정을 2% 정상 혈 청 (동일한 종으로 이차 항 체)를 추가 (1 mL 전체 볼륨 샘플/튜브 당 권장).</li>
		<li>2% 세럼/협정 버퍼 얼룩에 1 차적인 항 체를 추가 합니다. 협정 얼룩에 대 한 1 차적인 항 체의 양 x 약 5를 사용 하 여 표준 immunohistochemistry (즉 경우 항 체를 위한 표준 immunohistochemistry, 협정 얼룩에 대 한 사용 1: 100 희석된 1: 500) 사용 될 것 이다.</li>
		<li>워시 버퍼에서 샘플을 제거 하 고 종이 타월에 초과 버퍼에서 소량 다음 주 항 체 솔루션 튜브에는 주걱을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-4 일 60 rpm에서 통에 RT에서 품 어. 4-5 시간 신선한 버퍼를 변경 하 고 마지막 세척 단계 7.1에서 하룻밤 사이에 떠나는 0.01 M PBS에서 60 rpm에서 통에 RT에서 샘플을 철저히 씻으십시오.</li>
	<li>이차 항 체와 함께 샘플을 품 어.<ol>
<li>2 mL 플랫 바닥 튜브에 버퍼를 얼룩 기본 협정을 2% 정상 혈 청 (동일한 종으로 이차 항 체)를 추가 (1 mL 전체 볼륨 샘플/튜브 당 권장).</li>
		<li>1: 200 (1 mL 버퍼에서 5 µ l)의 농도에 2 차 항 체를 추가 합니다. 참고: 작은 형식 항 체는, 뿐만 아니라 매우 크로스 흡착 항 체 경우 하나 이상의 기본 항 체를 사용 하 여.</li>
		<li>워시 버퍼에서 샘플을 제거 하 고 종이 타월에 초과 버퍼에서 소량 다음 이차 항 체 솔루션 튜브에는 주걱을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 일 동안 60 rpm에서 통에 RT에서 incubate 고 빛에서 샘플을 보호 합니다.</li>
	<li>샘플을 철저 하 게 세척, 단계 7.1 시간 4-5 신선한 버퍼를 변경 하 고 떠나는 마지막 0.01 M PBS에서 60 rpm에서 통에 RT에서 하룻밤 사이에 세척, 세척 하는 동안 빛에서 보호.</li>
</ol>8. 영상에 대 한 샘플 장착
<ol><li>굴절률 정합된 솔루션 (RIMS) 버퍼를 준비 합니다.<ol>
<li>신중 하 게 50 mL 원뿔 튜브에 전송 및 비 이온 밀도 그라데이션 매체 (예: Histodenz)의 11 g으로 무게.</li>
		<li>~ 5 mL 0.02 M 인산 버퍼 (PB)8 분말 비 이온 밀도 그라데이션 매체에서 공기를 해제 하는 주걱을 사용 하 여 추가 합니다. 참고: 솔루션은 아주 점성, 잘 혼합.</li>
		<li>10 ml 더 많은 PB를 사용 하 여 볼륨을가지고, 주걱으로 혼합 하 고 튜브에는 주걱을 초과 다쳤어요.</li>
		<li>해산 때까지 37 ° C에서 바퀴를 품 어, 반전 하 고 필요에 따라 부드럽게 혼합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>테두리에 샘플을 전송 합니다. 이렇게, 1 mL를 플라스틱 2 mL 평면 하단 튜브로 바퀴. 워시 버퍼에서 샘플을 제거 하 고 종이 타월에 초과 버퍼에서 소량 다음 테두리 솔루션 튜브에는 주걱을 사용 합니다.<ol>
<li>부드럽게 잠수함 테두리에 샘플 튜브를 누릅니다. RT에 빛에서 이미징 하기 전에 2-4 일에 대 한 보호는 벤치에 테두리에 샘플을 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지, 적은 양의 8 잘 coverslip 아래쪽 챔버 슬라이드에 테두리를 배치 합니다. 코트 바닥을 충분히 추가, 더 많은 샘플 거꾸로 범위에 이미지를 더 어렵게 하는 float 하면. 우물에 샘플을 추가 하 고 슬라이드 이미징에 대 한 모자.</li>
</ol>9입니다. 영상
<ol><li>Confocal 현미경 검사 법 및 이미징 소프트웨어<ol>
<li>여기 및 협정 샘플 얼룩 사용 fluorophores의 방출 스펙트럼에 대 한 적절 한 레이저를 선택 합니다. 채널 간의 모든 중복 제거 수집 소프트웨어의 설정을 조정 합니다. (두 fluorophores 비슷한 흥분 스펙트럼 때) 필요한 경우 별도 트랙 사용 합니다.</li>
		<li>이미지 수집 설정<ol>
<li>최대 수집 속도, 16 비트, 4 이상의 평균, 및 1024 x 1024 해상도 선택 하거나 더 나은 합니다.</li>
			<li>개체 수 이미지를 확대 합니다. 참고:이 하 사진 표백 줄일 또한 파일 크기와 다운스트림 편집 수집 시간을 줄일 것 이다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Z-스택 설치.<ol>
<li>사용 되 고 목표에 대 한 최적의 단면을 선택 합니다. Deconvolution 나중에 필요한 경우 사용 하 여 z-단계 1 µ m 등 최적의 보다 작은.</li>
			<li>Z-스택 보정을 사용 합니다.<ol>
<li>직물의 표면에 가장 가까운 시작 및 목표 z-비행기를 통해 초점을 맞추고 이득을 증가 하 고 수정 추가. 정정에 대 한 레이저 설정을 변경 하지 마십시오!</li>
				<li>취득 한 평균, 512 x 512 해상도와 최대 수집 속도 테스트 스택. 최종 높은 해상도 z-스택을 취득 하기 전에 각 색상에 대 한 전역 동등한 밝기는 되도록 3d에서 이미지를 확인 하십시오.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lightsheet 영상<ol>
<li>샘플 이상적으로 적어도 24 h. 이미지에 대 한 테두리에 equilibrated 되었습니다 이미징 챔버에 신선한 테두리에 샘플을 전송 고 적어도 하루에 대 한 챔버에 equilibrate 수 있게 확인 하십시오.</li>
		<li>이미징에 대 한 샘플을 탑재<ol>
<li>샘플을 탑재를 작은 (블랙) 모 세관을 선택</li>
			<li>퍼 티 또는 접시를 사용 하 여 모 세관의 끝에 슈퍼 접착제를 적용 하는 동안 샘플을. 감동 만큼 가능한 조직의 표면 모 세관에 조직 접착제.</li>
			<li>이미징에 대 한 예제를 삽입 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>이미지 광학 허가 샘플 피벗을 사용 하 여 스캔 옵션에 대 한 5 X 또는 적합 한 25 X 목표를 사용 하 여. 숨김 또는 흐리게 경우 샘플을 회전 다시 시도, 또는 바퀴에 equilibrate 계속 샘플을 보자. 참고: 1 스택 5 분, 설정에 따라 일반적으로 취득 수 있습니다.</li>
		<li>보기 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 스택 편집.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

새로운 광학 개간 방법의 동물 모델에는 중앙의 전례 없는 대규모 시험 및 주변 신경 시스템을 허용 하고있다. 인간의 췌 장의 전반적인 신경 분포 패턴 조직 밀도 높은 품질 biospecimens 인수에 어려움으로 인해 크게 탐험 되지 않습니다. 이 프로토콜은 고정 또는 파라핀 끼워 넣어진 보관 샘플에서 인간의 췌 장 조직에 대 한 프로토콜을 삭제 하는 최적화 된 조직에 제공 합니다.
시간을 지우기 샘플 크기, 통 유형, 기간, 저장 기간에 따라 달라 집니다 고 다음 고려 사항은 중요 한 그래서 1-8 주를 요구할 수 있습니다. 가능 하면 장기 보관 개간 시간 증가 하기 때문에 4 %PFA 고정 후 곧 조직을 지우려면 최상 이다. 청소 시간을 최소화 하기 위해 하이드로 겔 단위체에 PFA의 금액 1%로 고정 단계에서 사용 되는 인간의 췌 장 4%에서 감소 했다. 다른 조직, 특히 마우스 조직에 대 한 PFA 항을 유지 하기 위해 충분 한 하이드로 겔 강성을 제공 하기 위해 필요한 금액은 실험적으로 결정 되어야 합니다. 적절 한 개간 때문에 항 체 침투 제대로 삭제 된 조직에 감소 되 고 2 차 항 체에 의해 얼룩 표면 증가 또한 필수적 이다. 청소 솔루션을 변경 모든 다른 일 (또는, 심지어 매일)이 pH 상수와 세제를 신선한 유지 좋습니다. 반대로, 부정적인-지우기 세포 형태에 미치는 영향 및 조직 friability 증가. 이후 일부 췌 장 샘플 취소 하지 섬유 증 만성 췌 장 염에서의 지역 등 고유한 병 리 또는 다른 병 리 균등 하 게, 그것은 자주이 프로세스를 모니터링 하는 것이 중요. Vibratome 두꺼운 섹션의 사용 하 여 균일 한 두께 만들기 위해 사용할 수 있습니다 아직 필요 하지 않습니다. 최대한 빨리 빛 샘플, 쉽게 통과 샘플 세제에서 제거 됩니다 개간 과정 모니터링 샘플 충분히 지워집니다 보장 합니다.
항 체 침투 및 표면 얼룩 협정 예제와 함께 고려해 야 할 중요 한 문제가 있습니다. 좋은 항 체 침투를 위해, 그것은 적어도 2 일 동안 1 차 항 체와 함께 샘플을 품 어 중요입니다. 다양 한 항 체 다른 보급률 있고 개별적으로 최적화 해야 하지만 대부분 항 체, 4 일 1 m m3 샘플에서 전체 침투에 대 한 충분 한 기간. 표면 얼룩이 지는 문제는, 특히 Lightsheet 이미징에 대 한 샘플, 절반 절단 될 수 있습니다 또는 표면 얼룩 후 멀리 해 부. 작은 형식 항 체 사용 가능한 경우 조직 침투8을 지원 하기 위해 예상 될 것 이다. Preconjugated 항 체 같은 결합형된 복제 뿐만 아니라 작동 표시 되지 않습니다 및 일반적인 바인딩 및 빈약한 조직 침투에서 높은 배경 수 만약 그들이 모든 일을 관찰. Preconjugated 항 체와 함께 향상 된 성공, 증가 혈 청 및 TritonX-100 농도 얼룩이 지기에서 버퍼 긴 외피를 사용 (> 4 일). 얼룩, 후 몇 일 동안 바퀴에 샘플의 인큐베이션이 중요 합니다. PBS 및 테두리 외피에 허가 조직 팽창 발생 다시 원래 크기로 축소 합니다. Lightsheet 영상와 특히 샘플 완전히 이미징 하기 전에 equilibrated 되어야 한다.
Confocal 현미경에 샘플 이미지 때 수정에 새 위치를 선택 때마다가 설정 해야 합니다. 다양 한 수집 깊이 강도 조직 전체를 얼룩에 최적의 이미지를 조직의 각 영역에 대 한 조정이 필요로 합니다. 마찬가지로, 사용 하는 2 차 항 체는 신중 하 게 고려 되어야 한다. 스펙트럼 unmixing fluorophores 밝은 신호를 필터링 하는 confocal 현미경에 방출 되도록 낮은 여기 또는 오버랩 적절 하 게 선택 되어야 한다 그래서 협정 샘플, 도전 이다. 사진-표백 하지 않고 최고의 품질 이미지를 얻을 수 있다 그래야 각 응용 프로그램에 대 한 균형 해상도, 이미징 속도 및 소음 감소 사이 삼진 해야 합니다. 해상도 1024 x 1024 보다 큰 인간의 눈으로 감지 하지만 얼룩의 정량화는 필요한 경우 특정 응용 프로그램에 필요한 있을 수 있습니다.
광학 개간 기술을 선택할 때 그리고 다른 전통적인 방법을 통해 광학 개간을 선택할 때 고려해 야 할 많은 것 들이 있다. 낮은 풍부 항 따라서 있다 항 원 탐지에 대 한 제한 협정 방법을 사용 하 여 감지 하지 않을 수 있습니다. 특정 항 원 면역 항 원 (CD3, CD4, CD8, 등) 같은 협정 방법으로 파괴 하 고 그들을 감지 사용할 수 있는 고품질 항 체에도 불구 하 고 감지 되지 않습니다. 이 방법의 또 다른 한계는 기증자 췌 얼룩을 지운 후 때까지 분별 하기 어려운 사이 고유의 가변성. 각 기증자 조직 명확 하 고 절차, 사이 유사 하 게 얼룩 경향이 있다 하지만 다른 기증자 조직 널리 다양 한 청소 시간 및 조직의 형태학 품질 개간 후. 비록이 철저 하 게 조사 하지는 하나 환자 췌 샘플의 많은 수에 대 한 적절 한 액세스를 가질 수 있다면 보관 조직을 사용 하는 능력이이 제한을 완화 수 있습니다. 여기 보고 협정 프로토콜 저렴 하 고 쉽게 표준 실험실 장비로 구현 될 발견 됐다. 선택된 샘플 전통적인 confocal 현미경 검사 법, 2 광자 및 Lightsheet 기술을 통해 영상에 적합 되었고 고해상도 신경 및 인간의 췌의 큰 섹션에 독도의 3D 이미지를 제공. 이 절차의 미래 응용 프로그램 태아 췌 장 외 분 비 및 내 분 비 구획 및 타입-1에에서 섬 연구 및 2 형 당뇨병의 개발에 대 한 연구를 포함합니다.

최근까지, 큰 조직 또는 전체 장기의 3 차원 (3D) 재건 힘 드는 직렬 단면, 얼룩, 및 여러 섹션의 이미지 재건을 통해 수행 되었다. 이러한 방법은 직렬 섹션, 항 체, 및 비 산 방지 조직 내의 깊은 이미징 빛 가난한 조직 침투의 많은 수에 대 한 신뢰를 포함 하 여 몇 불리가 있었다. 있도록 큰 빛과 항 체 침투, 연구원 지질 빛 산란의 대부분을 제거 하는 동안 단백질 항 원을 보존 하기 위해 화학 방법을 개발. 여러 메서드는 엄밀한 이미징 조직 Clear Lipid-Exchanged 아크릴 때 교배 히드로 (선명도), 수동 선명도 기법 (협정), 및 관류 기반 에이전트 출시 원래의 (동위) ( 1,2 검토 관련 ,,34,,56). 선명도 메서드는 포름알데히드, 아크릴, 및 두번째 히드로 지질 제거 SDS 솔루션2전기 이동 법을 사용 하 여 다음을 사용 하 여 단백질의 안정화를 기반으로 합니다. 이 방법은 수동 삭제에 대 한 수정 나중 되었고 고급 이미징7. 추가 최적화 주도하 고 두번째의 paraformaldehyde 히드로 솔루션 (1-4%)의 다양 한 비율로 최적의 항 안정화를 협정 8이라는 기법에 대 한 짧은 청소 시간. 이러한 광학 개간 기술을 개발 초기 시도 관련 작업을 담금질된 생 형광 단백질 유전자 변형 마우스 모델에서 어려운 유기 또는 다른 화합물. 이러한 추가 메서드 포함 비늘, 가리지 두뇌/신체 칵테일과 Computational 분석 (큐빅), 스위치 및 Dimensional Imaging of Solvent-Cleared 기관 (디스코) 방법, 모두와 함께 다양 한 장점과 단점9, 10,,1112. 원래 선명도 방법은 지질이 풍부한 마우스 뇌 조직에서 개발 되었다 및 광학 개간 방법 인간의 조직7,,811,13,14에서에서 테스트 제한 했다 .
광학 개간 방법 그대로 마우스 중앙 신경 시스템에서 긴 거리 추적 신경에 이상적입니다. 췌 잘 자율 신경 및 감각 신경 시스템에 의해 innervated입니다. 전체 기관 (1-2%)의 아주 작은 부분을 구성 하는 췌 장 내 분 비 실, 독도 Langerhans 및 독도 크기 (50-250 µ m), 내 분 비 세포 비율, 및 ( 15에서에서 검토 한 결과 당뇨병에 특히 밀도에 알고 있다 ,16). 프로토콜 개발, 인간의 췌 장에 대 한 여러 가지 광학 개간 방법을 테스트 하 고 협정 절차 신경 및 독도의 우수한 형태 보존 시간 (~ 2 주)를 최고의 균형을 발견. 여기에 설명 된 마지막 최적화 절차는 대 한 신경 섬 네트워크의 묘사에 대규모 (밀리미터 거리) 및 여러 그대로 췌 장 독도의 고해상도 3D 이미징. 후 샘플으로 저장 중립 버퍼링 된 포 르 말린 고정 파라핀 왁 스에 포함 된 기술은 인간의 췌 장 바로 다음 고정 또는 적당 하다. 샘플은 여 confocal 영상에 대 한 적합 한 또는 lightsheet 현미경 검사 법.

<table><tbody><tr><td>10x phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Fisher</td><td>S375-500</td><td>PB buffer (RIMS)</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td><td>Sigma</td><td>71507-250</td><td>PB buffer (RIMS)</td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-5</td><td>Immersion fixation, hydrogel, storage solution</td></tr><tr><td>40% acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td>Hydrogel</td></tr><tr><td>2% bis-acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td>Hydrogel</td></tr><tr><td>VA-044 initiator</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>VA044</td><td>Hydrogel</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-5</td><td>Clearing buffer</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Sample storage buffer</td></tr><tr><td>18 gauge needles</td><td>Fisher</td><td>14-840-91</td><td>Degassing hydrogel solution</td></tr><tr><td>N2 tank</td><td>AirGas</td><td>various</td><td>Degassing hydrogel solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100 ml</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>Goat, normal serum</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td>Use as 2% in blocking buffer</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma</td><td>D2158-100G</td><td>RIMS</td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>710</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>LightSheet microscope</td><td>Zeiss</td><td>Z1</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibody&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>Bioss</td><td>bs-4820R-A488</td><td>Host: Rabbit&lt;br/&gt; Dilution: 1:100&lt;br/&gt; Comments: Did not work</td></tr><tr><td>CD45</td><td>DAKO</td><td>M0754</td><td>Host: Mouse&lt;br/&gt; Dilution: 1:200&lt;br/&gt; Comments: Did not work</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td>Host: Rabbit&lt;br/&gt; Dilution: 1:50&lt;br/&gt; Comments: Worked</td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>BD Biosciences</td><td>565891</td><td>Host: Mouse&lt;br/&gt; Dilution: 1:50&lt;br/&gt; Comments: Worked</td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>Cell Signaling</td><td>2760S</td><td>Host: Rabbit&lt;br/&gt; Dilution: 1:200&lt;br/&gt; Comments: Did not work</td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>Abcam</td><td>ab10988</td><td>Host: Mouse&lt;br/&gt; Dilution: 1:200&lt;br/&gt; Comments: Worked</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>DAKO</td><td>A0564</td><td>Host: Guinea Pig&lt;br/&gt; Dilution: 1:200&lt;br/&gt; Comments: Worked</td></tr><tr><td>NCAM (CD56)</td><td>DAKO</td><td>M730429-2</td><td>Host: Mouse&lt;br/&gt; Dilution: 1:50&lt;br/&gt; Comments: Did not work</td></tr><tr><td>NCAM (CD56)-FITC conjugate</td><td>DAKO</td><td>M730429-2</td><td>Host: Mouse&lt;br/&gt; Dilution: 1:50&lt;br/&gt; Comments: Did not work</td></tr><tr><td>Peripherin</td><td>EnCor</td><td>RPCA-Peri</td><td>Host: Rabbit&lt;br/&gt; Dilution: 1:100&lt;br/&gt; Comments: Worked</td></tr><tr><td>PGP9.5</td><td>DAKO</td><td>Z5116</td><td>Host: Rabbit&lt;br/&gt; Dilution: 1:50&lt;br/&gt; Comments: Did not work</td></tr><tr><td>Secretogranin 3</td><td>Sigma</td><td>HPA006880</td><td>Host: Rabbit&lt;br/&gt; Dilution: 1:200&lt;br/&gt; Comments: Worked</td></tr><tr><td>Smooth muscle actin</td><td>Sigma</td><td>A5228; C6198 (Cy5)</td><td>Host: Mouse&lt;br/&gt; Dilution: 1:200; 1:200&lt;br/&gt; Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated</td></tr><tr><td>Substance P</td><td>BioRad</td><td>8450-0505</td><td>Host: Rat&lt;br/&gt; Dilution: 1:200&lt;br/&gt; Comments: Worked</td></tr><tr><td>Tyrosine Hydroxylase</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>Host: Rabbit&lt;br/&gt; Dilution: 1:200&lt;br/&gt; Comments: Worked</td></tr><tr><td>Tyrosine Hydroxylase</td><td>Abcam</td><td>Ab76442</td><td>Host: Chicken&lt;br/&gt; Dilution: 1:100&lt;br/&gt; Comments: Worked, but weak staining</td></tr><tr><td>Vasoactive Intestinal Peptide (VIP)</td><td>Immunostar</td><td>20077</td><td>Host: Rabbit&lt;br/&gt; Dilution: 1:100&lt;br/&gt; Comments: Worked</td></tr><tr><td>Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT)</td><td>Synaptic Systems</td><td>139103</td><td>Host: Rabbit&lt;br/&gt; Dilution: 1:50&lt;br/&gt; Comments: Worked</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary Antibody&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guinea pig IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Various</td><td>Host: Goat&lt;br/&gt; Dilution: 1:200&lt;br/&gt; Comments: AlexaFluor conjugates</td></tr><tr><td>Mouse IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Various</td><td>Host: Goat&lt;br/&gt; Dilution: 1:200&lt;br/&gt; Comments: AlexaFluor conjugates</td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Various</td><td>Host: Goat&lt;br/&gt; Dilution: 1:200&lt;br/&gt; Comments: AlexaFluor conjugates</td></tr><tr><td>Rat IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Various</td><td>Host: Goat, Donkey&lt;br/&gt; Dilution: 1:200&lt;br/&gt; Comments: AlexaFluor conjugates</td></tr><tr><td>Chicken IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Various</td><td>Host: Goat&lt;br/&gt; Dilution: 1:200&lt;br/&gt; Comments: AlexaFluor conjugates</td></tr></tbody></table>

high resolution 3d imaging of the human pancreas neuro-insular network

전통적인 조직학 방법을 사용 하 여, 연구원은 그들의 능력을 이미지 전체에 방해는 조직이 나 장기 대규모 3d에서. 조직학 단면도 일반적으로 < 20 µ m로 포 르 말린 고정 파라핀 섹션 유리 슬라이드에 또는 < 부동성 고정된 섹션에 대 한 500 µ m. 따라서, 광범위 한 노력은 직렬 단면화 및 샘플에 대 한 3D를 다시 대규모 이미지 재건 방법 > 전통적인 방법을 사용 하 여 500 µ m. 또한, 내 조직, 특히 지질, 고분자에서 빛 없앤다 방지 깊이 영상 > 가장 confocal 현미경으로 150 µ m. 빛 분산을 줄이고 간단한 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 깊은 조직 이미징 수 있도록, 다양 한 광학 개간 방법 그는 설치류와 인간의 조직 샘플에 대 한 관련 고정 침수에 의해 개발 되어 왔다. 여러 가지 방법을 관련 고 아크릴 아 미드와 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)와 지우기 조직 단백질 가교를 사용 합니다. 다른 광학 개간 기술 사용 다양 한 용 매 다양 한 장점과 단점 각 수정 했다. 여기, 인간의 췌 장 신경 분포의 연구와 인간의 독도의 신경 분포의 심문을 위해 특별히 최적화 된 수동 광 개간 방법 설명 되어 있습니다.

이러한 착 절차는 독도 관련 된 자율 고 감각 네트워크를 검사 하는 인간의 췌의 대규모 시험을 제공 하기 위해 개발 되었다. 선명도7,17, iDISCO 포함 하 여 여러 절차를 테스트 하 고 최고의 발견 협정 방법으로 협정8 인간의 췌 장 및 confocal 영상에 적합.
1 차 항 체 처음 테스트에 적합 한 긍정적이 고 부정적인 제어 샘플 인간의 췌 샘플 고정 (뇌, 마우스 다른). 각 실험실 많은 번호와 조직 소스에 따라 항 체 희석 최적화를 기대할 수 있지만 주 항 체 및 제안된 희석 재료의 테이블에 나열 됩니다. 1 차적인 항 체 로트 변형 영향을 얼룩 강렬과 특이성, 고 전 시 약으로 얼룩 강도의 동일한 정도 달성 하기 위해 확인을 요구 수 있습니다.
인간의 췌에서 독도 인슐린, 글 루카 곤, 및 secretogranin 3 (그림 2)에 의해 구분 된 했다. Schwann 세포 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP, 그림 2 및 그림 3A)를 사용 하 여 구분 된 했다. 신경 부 교감 신경 마커 vasoactive 창 자 펩 티 드 (VIP)에 대 한 항 체로 얼룩진 Lightsheet (그림 3B)에 몇 군데 있었다. 교감 신경은 티로신 hydroxylase (표시 되지 않음)에 대 한 얼룩으로 볼 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig1.jpg"> 그림 1입니다. 인간의 췌 광학 개간. (A) 면도날 잘라내어 조직 단면도 제거 하 고 조직 (하단 패널)에서 멀리 초과 파라핀 된다고 하기 전에 파라핀 끼워 넣어진 조직 (상단 패널)의 섹션을 느슨하게 사용 됩니다. 대표 조직 샘플 (오른쪽 B, C 가운데) 광 개간 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 파라핀 끼워 넣어진 조직의 전후 (B 왼쪽된, C 위쪽) 에 표시 됩니다. 취소, 고정 조직 (B, C 최고) 와 종종 조직 후 완전히 투명 하지 않습니다 붓기 수 있습니다 (C, 중간 패널)평가. 허가 조직 바퀴 (C, 하단 패널)에서 평형 후 완전히 투명 하 게 된다. 바 규모: 500 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig2.jpg"> 그림 2입니다. 인간의 신경 섬 네트워크. NPOD 장기 기증자 또는 보관 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 설명 된 대로 인간의 췌 샘플 삭제 했다. (A-D) Schwann 세포 (GFAP + 흰색) 하 고 내 분 비 세포 (빨간색) 인슐린과 글 루카 곤 (녹색)으로 얼룩진 표시 됩니다. (A) Confocal 현미경 검사 법 및 최대 강도 투영 (MIP) 섬 주변에서 혈관 옆 전기가 하 고는 독도에 신경에 Schwann 세포 GFAP (+)의 추적을 보여줍니다. 삽입 된 높은 해상도 고 GFAP + Schwann 세포와 내 분 비 세포 사이 접촉을 보여줍니다 보여줍니다. (B) 패널의 3D 이미지 (규모: x = 50 µ m, y = 20 µ m, z = 25 µ m) a. 파라핀 협정 샘플 confocal 현미경 검사 법을 통해 이미지 표시 됩니다 고 최대 강도 프로젝션 (C) 과 3 차원 (D)에 제시, 확장: x, y = 50 µ m, z = 25 µ m). 스케일 바 , C: 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig3.jpg"> 그림 3. 3D 시각화 및 바느질. 3 바느질된 이미지 스택은 Schwann 세포 GFAP confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 스테인드 및 이미지 분석 소프트웨어에 neurite 추적기 플러그인을 사용 하 여 추적의 인수 했다. (A) 추적의 3D 채우기가 표시 됩니다 (막대를 확장: x = 150 µ m, y = 200 µ m (0.2 m m), z = 120 µ m) (B) A 협정 샘플과 VIP 항 체로 얼룩진 했다 lightsheet 현미경을 사용 하 여 몇 군데. 스택이 > 1 mm 깊이 신경 섬유에 높은 해상도에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. 섬유 포장 (D, 전경) 덕트와 신경 절 (G, 배경)를 볼 수 있습니다 (큰 그리드: x, y, z = 200 µ m; 눈금 표시: x, y, z = 40 µ m). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

high-resolution-3d-imaging-of-the-human-pancreas-neuro-insular-network

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.3K 조회수.  University of Florida. 여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.

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Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of pancreatic tissue, such as the rat pancreas, and to increase the number of channels (cell types) that may be studied in a single specimen. We further describe the implementation of a number of computational tools that provide: 1/ accurate positioning of a specimen's (in our case the pancreas) centre of mass (COM) at the axis of rotation (AR)2; 2/ improved algorithms for post-alignment tuning which prevents geometric distortions during the tomographic reconstruction2 and 3/ a protocol for intensity equalization to increase signal to noise ratios in OPT-based BCM determinations3. In addition, we describe a sample holder that minimizes the risk for unintentional movements of the specimen during image acquisition. Together, these protocols enable assessments of BCM distribution and other features, to be performed throughout the volume of intact pancreata or other organs (e.g. in studies of islet transplantation), with a resolution down to the level of individual islets of Langerhans.

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

We describe the adaptation of optical projection tomography (OPT)1 to imaging in the near infrared spectrum, and the implementation of a number of computational tools. These protocols enable assessments of pancreatic &beta;-cell mass (BCM) in larger specimens, increase the multichannel capacity of the technique and increase the quality of OPT data.

당뇨병 연구에서 β-세포 질량 분포의 평가를위한 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영 부근

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

연구

의학

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Implanted Stabilized Window를 사용한 쥐 췌장 영상

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have high morbidity and mortality. Intravital imaging (IVI) is a powerful technique enabling the high-resolution imaging of tissues in both healthy and diseased states, allowing for real-time observation of cell dynamics. IVI of the murine pancreas presents significant challenges due to the deep visceral and compliant nature of the organ, which make it highly prone to damage and motion artifacts. 
Described here is the process of implantation of the Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP). The SWIP allows IVI of the murine pancreas in normal healthy states, during the transformation from the healthy pancreas to acute pancreatitis induced by cerulein, and in malignant states such as pancreatic tumors. In conjunction with genetically labeled cells or the administration of fluorescent dyes, the SWIP enables the measurement of single-cell and subcellular dynamics (including single-cell and collective migration) as well as serial imaging of the same region of interest over multiple days. 
The ability to capture tumor cell migration is of particular importance as the primary cause of cancer-related mortality in PDAC is the overwhelming metastatic burden. Understanding the physiological dynamics of metastasis in PDAC is a critical unmet need and crucial for improving patient prognosis. Overall, the SWIP provides improved imaging stability and expands the application of IVI in the healthy pancreas and malignant pancreas diseases.

저자 스포트라이트: 첨단 생체 내 이미징을 통한 췌장 질환 이해의 혁명 

We present a protocol for the surgical implantation of a stabilized indwelling optical window for subcellular-resolution imaging of the murine pancreas, allowing serial and longitudinal studies of the healthy and diseased pancreas.

쥐 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have ...

암 연구학

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic beta-cell proliferation and islet growth is particularly challenging. We have developed a method to capture the distribution of beta-cells in the intact pancreas of transgenic mice with fluorescence-tagged beta-cells with a macro written for ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Following pancreatic dissection and tissue clearing, the entire pancreas is captured as a virtual slice, after which the GFP-tagged beta-cells are examined. The analysis includes the quantification of total beta-cell area, islet number and size distribution with reference to specific parameters and locations for each islet and for small clusters of beta-cells. The entire distribution of islets can be plotted in three dimensions, and the information from the distribution on the size and shape of each islet allows a quantitative and qualitative comparison of changes in overall beta-cell area at a glance.

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

The following protocol outlines the process of pancreatic dissection for virtual slice imaging, and the subsequent quantification of all GFP-tagged beta-cells in the entire pancreas.

마우스의 췌장 베타 세포 질량의 원위치 부량에서

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

생물학

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

컴퓨터를 이용한 대규모 시각화 및 췌장 아일릿 질량, 크기 유통과 건축의 부량

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Computational Reconstruction of Pancreatic Islets as a Tool for Structural and Functional Analysis

Structural properties of pancreatic islets are key for the functional response of insulin, glucagon, and somatostatin-secreting cells, due to their implications in intraislet communication via electric, paracrine, and autocrine signaling. In this protocol, the three-dimensional architecture of a pancreatic islet is firstly reconstructed from experimental data using a novel computational algorithm. Next, the morphological and connectivity properties of the reconstructed islet, such as the number and percentages of the different type of cells, cellular volume, and cell-to-cell contacts, are obtained. Then, network theory is used to describe the connectivity properties of the islet through network-derived metrics such as average degree, clustering coefficient, density, diameter, and efficiency. Finally, all these properties are functionally evaluated through computational simulations using a model of coupled oscillators. Overall, here we describe a step-by-step workflow, implemented in IsletLab, a multiplatform application developed specifically for the study and simulation of pancreatic islets, to apply a novel computational methodology to characterize and analyze pancreatic islets as a complement to the experimental work.

In this protocol, the pancreatic islets are reconstructed and analyzed using computational algorithms implemented in a dedicated multiplatform application.

구조 및 기능 분석을위한 도구로서의 췌장섬의 전산 재구성

Structural properties of pancreatic islets are key for the functional response of insulin, glucagon, and somatostatin-secreting cells, due to their ...

생체공학

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology have been developed and utilized in vivo, they are limited in terms of allowing single cell resolution and continuous longitudinal recordings. Because of the transparency of the cornea, the anterior chamber of the eye (ACE) in mice is well suited to study human and mouse pancreatic islet cell biology. Here is a description of how this approach can be used to perform continuous longitudinal recordings of grafting and revascularization of individual human islet grafts. Human islet grafts are inserted into the ACE, using NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mice as recipients. This allows for the investigation of the expansion of recipient versus donor cells and the contribution of recipient cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft. Further, a step-by-step approach for image analysis and quantification of the islet volume or segmented vasculature and islet capsule forming recipient cells is outlined.

The goal of this protocol is to continuously monitor the dynamics of the human pancreatic islet engraftment process and the contributing host versus donor cells. This is accomplished by transplanting human islets into the anterior chamber of the eye (ACE) of an NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mouse recipient followed by repeated 2-photon imaging.

생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging study, with an abdominal imaging window, enabled visualization of the cellular dynamics in abdominal organs in vivo. However, due to the soft sheet-like architecture of the mouse pancreas that can be easily influenced by physiologic movement (e.g., peristalsis and respiration), it was difficult to perform stabilized longitudinal in vivo imaging over several weeks at the cellular level to identify, track, and quantify islets or cancer cells in the mouse pancreas. Herein, we describe a method for implanting a novel supporting base, an integrated pancreatic intravital imaging window, that can spatially separate the pancreas from the bowel for longitudinal time-lapse intravital imaging of the pancreas microstructure. Longitudinal in vivo imaging with the imaging window enables stable visualization, allowing for the tracking of islets over a period of 3 weeks and high-resolution three-dimensional imaging of the microstructure, as evidenced here in an orthotopic pancreatic cancer model. With our method, further intravital imaging studies can elucidate the pathophysiology of various diseases involving the pancreas at the cellular level.

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo high-resolution imaging of the pancreas was facilitated with the pancreatic intravital imaging window.

췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

요약

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당뇨병 연구에서 β-세포 질량 분포의 평가를위한 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영 부근

인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

쥐 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창

쥐 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창

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마우스의 췌장 베타 세포 질량의 원위치 부량에서

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구조 및 기능 분석을위한 도구로서의 췌장섬의 전산 재구성

생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

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