저자는 박사 앤 푸와 기술 지원에 대 한 조셉 Canzano, 박사 제니퍼 Treweek 귀중 한 조언, 그리고 닥터 크리스틴 Overton 및 MCT 스탠포드 대학 선명도 워크샵을 통해 교육에 대 한 박사 칼 Deisseroth 감사합니다. JDRF nPOD 및 장기 조달 조직 조직 샘플을 제공합니다. 이 작품은 JDRF (47-2014-1), 헴 슬 리 자선 신탁 (HCT 2015-PG-T1D052) 및 MCT에 NIDDK 1OT2 TR001773에 의해 투자 되었다.

모든 실험은 플로리다의 대학 기관 검토 위원회 및 연방 정부의 지침에 따라 실시 했다.
주의: Paraformaldehyde 및 아크릴은 독성 irritants입니다. 적절 한 개인 보호 장비 (실험실 외 투, 장갑, 눈 보호)와 증기 두건에서 시 약을 처리 합니다.
1. 포름알데히드 고정 조직 deparaffinization (신선한 조직 작업 하는 경우 2 단계로 건너)
<ol><li>새로운 면도날 또는 메스를 사용 하 여 조직의 표면에 수직인는 파라핀을 극복. 조직 풀어 마무리의 가장자리에는 파라핀을 잘라. 부드럽게 느슨하게 하 고 허가를 받아야하는 광학 조직을 제거 겸 자 또는 주걱을 사용 합니다. 부드럽게 주걱 (그림 1A)를 사용 하 여 조직에서 초과 파라핀 다쳤어요.</li>
	<li>크 실 렌 (3 x 3 x 3 m m 부분의 조직에 대 한 약 30 mL)와 함께 유리 용기를 실 온 (RT)에서 24 시간이 솔루션 조직을 품 어.</li>
	<li>1.2.1와 같은 볼륨으로 신선한 자일 렌으로 다른 유리 용기를 채우십시오. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어</li>
	<li>1.2.1와 같은 볼륨으로 원뿔 관으로 100% 에탄올을 놓습니다. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어</li>
	<li>1.2.1와 같은 볼륨으로 원뿔 튜브에 95% 에탄올을 놓습니다. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어</li>
	<li>1.2.1와 같은 볼륨으로 원뿔 관으로 70% 에탄올을 놓습니다. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어</li>
	<li>린스 0.01 M 인산에서 조직 버퍼링 식 염 수 (PBS) 및 조직 파라핀 (그림 1B, 오른쪽 패널)의 무료는 실시간 확인에서 24 h에 대 한 equilibrate를 원뿔 튜브에 0.01 M PBS에서.</li>
</ol>2. 준비 4 %Paraformaldehyde (PFA) 정착 제
<ol><li>플라스틱 10 mL 16% PFA 50 mL 원뿔 튜브로 4 mL 0.1 M PBS, 추가 하 고 추가 26 mL 증류수 이온 (ddH2O). 뚜껑 닫고 잠시 혼합.</li>
	<li>4%의 더 큰 볼륨 미리와 aliquots에서 냉동 PFA는 만들 수 있습니다. 4 ° C에서 1 주 및 1 개월-20 ° c.에 aliquots는 실 온 (RT)에서 1 일에 대 한 좋은</li>
</ol>3. 췌 장 고정
<ol><li>갓된 4%에서 췌 샘플 (1 x 1 x 2 cm ≤) 수정 PFA 48 h 4 ° C에서. 샘플 1 x 1 x 2 cm를 사용 하 여 메스 또는 면도칼으로 작은 해 부 보다 큰 경우 개 더 이상으로 보다 1 ㎝ 두께. 각 씻어 적어도 15 분 동안 0.01 M PBS의 세 가지 변화에서 조직 샘플을 세척 하 고 사용까지 0.01 %PFA / 0.01 M PBS 또는 0.5% 나트륨 아 지 드/0.01 M PBS에에서 15 mL 원심 분리기 튜브에 저장.</li>
	<li>고정, 후 추가 처리를 위해 1-2 m m 두꺼운 섹션으로 조직 섹션. 하도 단면에 vibratome를 사용 합니다. 참고: 섹션의 마지막 수 시작 샘플의 크기에 따라 달라 집니다.</li>
</ol>4. 하이드로 겔에 조직 포함
<ol><li>다음과 같이 4% 아크릴/1 %paraformaldehyde (A4P1) 하이드로 겔 단위체 솔루션 200ml를 준비:<ol>
<li>마그네틱 볶음 판 위에 양동이에 얼음에 플라스 크를 놓습니다. 플라스 크는 평평 앉아 있는지 확인 하 고 자기 볶음 바 추가 합니다.</li>
		<li>다음 순서로 추가: 147.8 mL 감기 (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL 0.1 M PBS, 20 mL 감기 (4-8 ° C) 40% 아크릴 솔루션, 12.2 mL 16 %PFA 솔루션, 및 250 mg 버지니아-044 초기자. 적어도 10 분 동안 자기 볶음 바 전체 히드로 솔루션을 혼합 하 고 단계에 대 한 얼음에 솔루션을 떠나.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하이드로 겔 솔루션을 포함 하는 플라스 크가 옆에 얼음에는 장소 15 mL 원뿔 튜브. 단량체 솔루션의 14 mL 튜브에 플라스틱 고 1-2 m m 두께 고정된 조직 샘플의 한 조각을 추가 합니다. 다음 모자는 튜브.</li>
	<li>4 ° C에서 3 일 동안 단위체 솔루션에서 샘플을 품 어 고 빛 으로부터 보호 합니다. Aliquot 어떤 나머지 모노 머 솔루션 및 나중에 사용-20 ° C에서 저장.</li>
</ol>5. 드 모노 머 솔루션 및 유해는 하이드로 겔
<ol><li>가스 N28을 사용 하 여 하이드로 겔 단위체 솔루션에서 산소를 제거 합니다.<ol>
<li>얼음 양동이 준비 하 고 얼음에 하이드로 겔 단위체 솔루션에는 샘플을 배치.</li>
		<li>샘플, 파라핀, 필름과 타이머 당 2-3, 18-게이지 피하 주사 바늘을 수집 합니다. 질소 흐름 수 있도록 질소 탱크에 있는 튜브를 연결 합니다. 얼음에 샘플을 유지 하면서 신중 하 게 한쪽에 샘플을 포함 하는 원뿔 튜브의 뚜껑을 뚫 고 때까지 통해 피하 바늘은 액체 단량체 솔루션의 표면 아래를 누릅니다.</li>
		<li>펑크는 캡의 반대 측에 다른 피하 주사를 사용 하지만 침수 될 그것을 허용 하지 마십시오. 참고: 두 번째 바늘 튜브를 환기 합니다.</li>
		<li>피하 주사는 히드로 아래 물속에 질소 탱크에서 튜브를 연결 하 고 천천히 때까지 액체를 통해 꾸준히 버블링은 질소를 켭니다.</li>
		<li>10 분 동안 액체를 통해 거품을 질소를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>산소 제거 되 면 신속 하 게 두 바늘을 제거 하 고 커버 튜브와 환경 사이 가스의 어떤 더 교류를 방지 하기 위해 파라핀 영화와 모자. 3 h는 히드로 유해를 37 ° C에서 인큐베이터에 degassed 샘플을 놓습니다.</li>
</ol>6. 조직 개간
<ol><li>500 mL 지우기 솔루션 (pH 8.5에서 4 %SDS)를 준비 합니다. DdH2O ~ 300 mL, 50 mL 0.1 M PBS와 20 g SDS 분말 자석 저 어 바 교 반 하면서 추가 합니다. 수산화 나트륨과 염 산이 pH 8.5 사용 하 여 솔루션을 조정 합니다. 마지막 볼륨은 500 mL까지 ddH2O를 추가 합니다.</li>
	<li>중 합, 후 멀리 초과 하이드로 겔을 부 어 하 고 화학 폐기물 용기에 그것을 삭제 합니다. 부드럽게 샘플에서 멀리 하이드로 겔을 닦아 하 고 화학 폐기물 용기에 폐기 종이 타월을 사용 합니다.</li>
	<li>각 세척 단계 샘플 0.01 M PBS의 3-5 교류에 (삭제 세척 액체 화학 폐기물에) 15 분 동안 씻어. 버퍼를 비운의 40 mL 50 mL 원뿔 튜브에 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>37 ° C에서 개간 버퍼에 샘플을 품 어 하 고 매일 신선한 개간 버퍼에 샘플을 변경 합니다.<ol>
<li>적절 한 청소를 보장 하기 위해 개간 버퍼 (~ 8 주가 3 mm x 3 mm x 3 mm 샘플) 샘플 크기에 따라 2-8 주에 대 한 샘플을 둡니다.</li>
		<li>모니터링 조직 개간 하 고 완료 되 면 중지 합니다. 샘플 확인 하기 위해 적절 한 개간 빛까지 개최 하 여 적절 하 게 투명 인지 확인 (일반적으로 일부 황갈색 색소에에서 남아 exocrine 지역). 참고:-선택된 샘플 가장자리에 닳은 나타나고 텍스처 집게로 집어 매우 부드러운 될 것입니다. 균등 하 게 취소를 샘플에 대 한 일반적입니다. 또한, 조직 설치 미디어 (삽입, 그림 1C)에 배치 될 때까지 완전히 투명 하 게 되지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 여러 면역 형광 검사
<ol><li>씻어 60 rpm에서 통에 샘플 RT에서 하루 동안 40 mL 0.01 M PBS (4-5 버퍼 변경 총, 40 mL에 각 세척, 최종 세척까지 모든 h 변경) 종종 신선한 버퍼에 변경. 실시간에서 밤새 계속 최종 세척 하자</li>
	<li>협정 얼룩 버퍼를 준비 합니다. 500 mL 0.01 M PBS, 50 mg 나트륨 아 지 드와 0.5 mL TritonX-100 추가. 잘 믹스.</li>
	<li>1 차 항 체와 함께 샘플을 품 어.<ol>
<li>2 mL 플랫 바닥 튜브에 버퍼를 얼룩 기본 협정을 2% 정상 혈 청 (동일한 종으로 이차 항 체)를 추가 (1 mL 전체 볼륨 샘플/튜브 당 권장).</li>
		<li>2% 세럼/협정 버퍼 얼룩에 1 차적인 항 체를 추가 합니다. 협정 얼룩에 대 한 1 차적인 항 체의 양 x 약 5를 사용 하 여 표준 immunohistochemistry (즉 경우 항 체를 위한 표준 immunohistochemistry, 협정 얼룩에 대 한 사용 1: 100 희석된 1: 500) 사용 될 것 이다.</li>
		<li>워시 버퍼에서 샘플을 제거 하 고 종이 타월에 초과 버퍼에서 소량 다음 주 항 체 솔루션 튜브에는 주걱을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-4 일 60 rpm에서 통에 RT에서 품 어. 4-5 시간 신선한 버퍼를 변경 하 고 마지막 세척 단계 7.1에서 하룻밤 사이에 떠나는 0.01 M PBS에서 60 rpm에서 통에 RT에서 샘플을 철저히 씻으십시오.</li>
	<li>이차 항 체와 함께 샘플을 품 어.<ol>
<li>2 mL 플랫 바닥 튜브에 버퍼를 얼룩 기본 협정을 2% 정상 혈 청 (동일한 종으로 이차 항 체)를 추가 (1 mL 전체 볼륨 샘플/튜브 당 권장).</li>
		<li>1: 200 (1 mL 버퍼에서 5 µ l)의 농도에 2 차 항 체를 추가 합니다. 참고: 작은 형식 항 체는, 뿐만 아니라 매우 크로스 흡착 항 체 경우 하나 이상의 기본 항 체를 사용 하 여.</li>
		<li>워시 버퍼에서 샘플을 제거 하 고 종이 타월에 초과 버퍼에서 소량 다음 이차 항 체 솔루션 튜브에는 주걱을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 일 동안 60 rpm에서 통에 RT에서 incubate 고 빛에서 샘플을 보호 합니다.</li>
	<li>샘플을 철저 하 게 세척, 단계 7.1 시간 4-5 신선한 버퍼를 변경 하 고 떠나는 마지막 0.01 M PBS에서 60 rpm에서 통에 RT에서 하룻밤 사이에 세척, 세척 하는 동안 빛에서 보호.</li>
</ol>8. 영상에 대 한 샘플 장착
<ol><li>굴절률 정합된 솔루션 (RIMS) 버퍼를 준비 합니다.<ol>
<li>신중 하 게 50 mL 원뿔 튜브에 전송 및 비 이온 밀도 그라데이션 매체 (예: Histodenz)의 11 g으로 무게.</li>
		<li>~ 5 mL 0.02 M 인산 버퍼 (PB)8 분말 비 이온 밀도 그라데이션 매체에서 공기를 해제 하는 주걱을 사용 하 여 추가 합니다. 참고: 솔루션은 아주 점성, 잘 혼합.</li>
		<li>10 ml 더 많은 PB를 사용 하 여 볼륨을가지고, 주걱으로 혼합 하 고 튜브에는 주걱을 초과 다쳤어요.</li>
		<li>해산 때까지 37 ° C에서 바퀴를 품 어, 반전 하 고 필요에 따라 부드럽게 혼합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>테두리에 샘플을 전송 합니다. 이렇게, 1 mL를 플라스틱 2 mL 평면 하단 튜브로 바퀴. 워시 버퍼에서 샘플을 제거 하 고 종이 타월에 초과 버퍼에서 소량 다음 테두리 솔루션 튜브에는 주걱을 사용 합니다.<ol>
<li>부드럽게 잠수함 테두리에 샘플 튜브를 누릅니다. RT에 빛에서 이미징 하기 전에 2-4 일에 대 한 보호는 벤치에 테두리에 샘플을 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지, 적은 양의 8 잘 coverslip 아래쪽 챔버 슬라이드에 테두리를 배치 합니다. 코트 바닥을 충분히 추가, 더 많은 샘플 거꾸로 범위에 이미지를 더 어렵게 하는 float 하면. 우물에 샘플을 추가 하 고 슬라이드 이미징에 대 한 모자.</li>
</ol>9입니다. 영상
<ol><li>Confocal 현미경 검사 법 및 이미징 소프트웨어<ol>
<li>여기 및 협정 샘플 얼룩 사용 fluorophores의 방출 스펙트럼에 대 한 적절 한 레이저를 선택 합니다. 채널 간의 모든 중복 제거 수집 소프트웨어의 설정을 조정 합니다. (두 fluorophores 비슷한 흥분 스펙트럼 때) 필요한 경우 별도 트랙 사용 합니다.</li>
		<li>이미지 수집 설정<ol>
<li>최대 수집 속도, 16 비트, 4 이상의 평균, 및 1024 x 1024 해상도 선택 하거나 더 나은 합니다.</li>
			<li>개체 수 이미지를 확대 합니다. 참고:이 하 사진 표백 줄일 또한 파일 크기와 다운스트림 편집 수집 시간을 줄일 것 이다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Z-스택 설치.<ol>
<li>사용 되 고 목표에 대 한 최적의 단면을 선택 합니다. Deconvolution 나중에 필요한 경우 사용 하 여 z-단계 1 µ m 등 최적의 보다 작은.</li>
			<li>Z-스택 보정을 사용 합니다.<ol>
<li>직물의 표면에 가장 가까운 시작 및 목표 z-비행기를 통해 초점을 맞추고 이득을 증가 하 고 수정 추가. 정정에 대 한 레이저 설정을 변경 하지 마십시오!</li>
				<li>취득 한 평균, 512 x 512 해상도와 최대 수집 속도 테스트 스택. 최종 높은 해상도 z-스택을 취득 하기 전에 각 색상에 대 한 전역 동등한 밝기는 되도록 3d에서 이미지를 확인 하십시오.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lightsheet 영상<ol>
<li>샘플 이상적으로 적어도 24 h. 이미지에 대 한 테두리에 equilibrated 되었습니다 이미징 챔버에 신선한 테두리에 샘플을 전송 고 적어도 하루에 대 한 챔버에 equilibrate 수 있게 확인 하십시오.</li>
		<li>이미징에 대 한 샘플을 탑재<ol>
<li>샘플을 탑재를 작은 (블랙) 모 세관을 선택</li>
			<li>퍼 티 또는 접시를 사용 하 여 모 세관의 끝에 슈퍼 접착제를 적용 하는 동안 샘플을. 감동 만큼 가능한 조직의 표면 모 세관에 조직 접착제.</li>
			<li>이미징에 대 한 예제를 삽입 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>이미지 광학 허가 샘플 피벗을 사용 하 여 스캔 옵션에 대 한 5 X 또는 적합 한 25 X 목표를 사용 하 여. 숨김 또는 흐리게 경우 샘플을 회전 다시 시도, 또는 바퀴에 equilibrate 계속 샘플을 보자. 참고: 1 스택 5 분, 설정에 따라 일반적으로 취득 수 있습니다.</li>
		<li>보기 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 스택 편집.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

새로운 광학 개간 방법의 동물 모델에는 중앙의 전례 없는 대규모 시험 및 주변 신경 시스템을 허용 하고있다. 인간의 췌 장의 전반적인 신경 분포 패턴 조직 밀도 높은 품질 biospecimens 인수에 어려움으로 인해 크게 탐험 되지 않습니다. 이 프로토콜은 고정 또는 파라핀 끼워 넣어진 보관 샘플에서 인간의 췌 장 조직에 대 한 프로토콜을 삭제 하는 최적화 된 조직에 제공 합니다.
시간을 지우기 샘플 크기, 통 유형, 기간, 저장 기간에 따라 달라 집니다 고 다음 고려 사항은 중요 한 그래서 1-8 주를 요구할 수 있습니다. 가능 하면 장기 보관 개간 시간 증가 하기 때문에 4 %PFA 고정 후 곧 조직을 지우려면 최상 이다. 청소 시간을 최소화 하기 위해 하이드로 겔 단위체에 PFA의 금액 1%로 고정 단계에서 사용 되는 인간의 췌 장 4%에서 감소 했다. 다른 조직, 특히 마우스 조직에 대 한 PFA 항을 유지 하기 위해 충분 한 하이드로 겔 강성을 제공 하기 위해 필요한 금액은 실험적으로 결정 되어야 합니다. 적절 한 개간 때문에 항 체 침투 제대로 삭제 된 조직에 감소 되 고 2 차 항 체에 의해 얼룩 표면 증가 또한 필수적 이다. 청소 솔루션을 변경 모든 다른 일 (또는, 심지어 매일)이 pH 상수와 세제를 신선한 유지 좋습니다. 반대로, 부정적인-지우기 세포 형태에 미치는 영향 및 조직 friability 증가. 이후 일부 췌 장 샘플 취소 하지 섬유 증 만성 췌 장 염에서의 지역 등 고유한 병 리 또는 다른 병 리 균등 하 게, 그것은 자주이 프로세스를 모니터링 하는 것이 중요. Vibratome 두꺼운 섹션의 사용 하 여 균일 한 두께 만들기 위해 사용할 수 있습니다 아직 필요 하지 않습니다. 최대한 빨리 빛 샘플, 쉽게 통과 샘플 세제에서 제거 됩니다 개간 과정 모니터링 샘플 충분히 지워집니다 보장 합니다.
항 체 침투 및 표면 얼룩 협정 예제와 함께 고려해 야 할 중요 한 문제가 있습니다. 좋은 항 체 침투를 위해, 그것은 적어도 2 일 동안 1 차 항 체와 함께 샘플을 품 어 중요입니다. 다양 한 항 체 다른 보급률 있고 개별적으로 최적화 해야 하지만 대부분 항 체, 4 일 1 m m3 샘플에서 전체 침투에 대 한 충분 한 기간. 표면 얼룩이 지는 문제는, 특히 Lightsheet 이미징에 대 한 샘플, 절반 절단 될 수 있습니다 또는 표면 얼룩 후 멀리 해 부. 작은 형식 항 체 사용 가능한 경우 조직 침투8을 지원 하기 위해 예상 될 것 이다. Preconjugated 항 체 같은 결합형된 복제 뿐만 아니라 작동 표시 되지 않습니다 및 일반적인 바인딩 및 빈약한 조직 침투에서 높은 배경 수 만약 그들이 모든 일을 관찰. Preconjugated 항 체와 함께 향상 된 성공, 증가 혈 청 및 TritonX-100 농도 얼룩이 지기에서 버퍼 긴 외피를 사용 (> 4 일). 얼룩, 후 몇 일 동안 바퀴에 샘플의 인큐베이션이 중요 합니다. PBS 및 테두리 외피에 허가 조직 팽창 발생 다시 원래 크기로 축소 합니다. Lightsheet 영상와 특히 샘플 완전히 이미징 하기 전에 equilibrated 되어야 한다.
Confocal 현미경에 샘플 이미지 때 수정에 새 위치를 선택 때마다가 설정 해야 합니다. 다양 한 수집 깊이 강도 조직 전체를 얼룩에 최적의 이미지를 조직의 각 영역에 대 한 조정이 필요로 합니다. 마찬가지로, 사용 하는 2 차 항 체는 신중 하 게 고려 되어야 한다. 스펙트럼 unmixing fluorophores 밝은 신호를 필터링 하는 confocal 현미경에 방출 되도록 낮은 여기 또는 오버랩 적절 하 게 선택 되어야 한다 그래서 협정 샘플, 도전 이다. 사진-표백 하지 않고 최고의 품질 이미지를 얻을 수 있다 그래야 각 응용 프로그램에 대 한 균형 해상도, 이미징 속도 및 소음 감소 사이 삼진 해야 합니다. 해상도 1024 x 1024 보다 큰 인간의 눈으로 감지 하지만 얼룩의 정량화는 필요한 경우 특정 응용 프로그램에 필요한 있을 수 있습니다.
광학 개간 기술을 선택할 때 그리고 다른 전통적인 방법을 통해 광학 개간을 선택할 때 고려해 야 할 많은 것 들이 있다. 낮은 풍부 항 따라서 있다 항 원 탐지에 대 한 제한 협정 방법을 사용 하 여 감지 하지 않을 수 있습니다. 특정 항 원 면역 항 원 (CD3, CD4, CD8, 등) 같은 협정 방법으로 파괴 하 고 그들을 감지 사용할 수 있는 고품질 항 체에도 불구 하 고 감지 되지 않습니다. 이 방법의 또 다른 한계는 기증자 췌 얼룩을 지운 후 때까지 분별 하기 어려운 사이 고유의 가변성. 각 기증자 조직 명확 하 고 절차, 사이 유사 하 게 얼룩 경향이 있다 하지만 다른 기증자 조직 널리 다양 한 청소 시간 및 조직의 형태학 품질 개간 후. 비록이 철저 하 게 조사 하지는 하나 환자 췌 샘플의 많은 수에 대 한 적절 한 액세스를 가질 수 있다면 보관 조직을 사용 하는 능력이이 제한을 완화 수 있습니다. 여기 보고 협정 프로토콜 저렴 하 고 쉽게 표준 실험실 장비로 구현 될 발견 됐다. 선택된 샘플 전통적인 confocal 현미경 검사 법, 2 광자 및 Lightsheet 기술을 통해 영상에 적합 되었고 고해상도 신경 및 인간의 췌의 큰 섹션에 독도의 3D 이미지를 제공. 이 절차의 미래 응용 프로그램 태아 췌 장 외 분 비 및 내 분 비 구획 및 타입-1에에서 섬 연구 및 2 형 당뇨병의 개발에 대 한 연구를 포함합니다.

최근까지, 큰 조직 또는 전체 장기의 3 차원 (3D) 재건 힘 드는 직렬 단면, 얼룩, 및 여러 섹션의 이미지 재건을 통해 수행 되었다. 이러한 방법은 직렬 섹션, 항 체, 및 비 산 방지 조직 내의 깊은 이미징 빛 가난한 조직 침투의 많은 수에 대 한 신뢰를 포함 하 여 몇 불리가 있었다. 있도록 큰 빛과 항 체 침투, 연구원 지질 빛 산란의 대부분을 제거 하는 동안 단백질 항 원을 보존 하기 위해 화학 방법을 개발. 여러 메서드는 엄밀한 이미징 조직 Clear Lipid-Exchanged 아크릴 때 교배 히드로 (선명도), 수동 선명도 기법 (협정), 및 관류 기반 에이전트 출시 원래의 (동위) ( 1,2 검토 관련 ,,34,,56). 선명도 메서드는 포름알데히드, 아크릴, 및 두번째 히드로 지질 제거 SDS 솔루션2전기 이동 법을 사용 하 여 다음을 사용 하 여 단백질의 안정화를 기반으로 합니다. 이 방법은 수동 삭제에 대 한 수정 나중 되었고 고급 이미징7. 추가 최적화 주도하 고 두번째의 paraformaldehyde 히드로 솔루션 (1-4%)의 다양 한 비율로 최적의 항 안정화를 협정 8이라는 기법에 대 한 짧은 청소 시간. 이러한 광학 개간 기술을 개발 초기 시도 관련 작업을 담금질된 생 형광 단백질 유전자 변형 마우스 모델에서 어려운 유기 또는 다른 화합물. 이러한 추가 메서드 포함 비늘, 가리지 두뇌/신체 칵테일과 Computational 분석 (큐빅), 스위치 및 Dimensional Imaging of Solvent-Cleared 기관 (디스코) 방법, 모두와 함께 다양 한 장점과 단점9, 10,,1112. 원래 선명도 방법은 지질이 풍부한 마우스 뇌 조직에서 개발 되었다 및 광학 개간 방법 인간의 조직7,,811,13,14에서에서 테스트 제한 했다 .
광학 개간 방법 그대로 마우스 중앙 신경 시스템에서 긴 거리 추적 신경에 이상적입니다. 췌 잘 자율 신경 및 감각 신경 시스템에 의해 innervated입니다. 전체 기관 (1-2%)의 아주 작은 부분을 구성 하는 췌 장 내 분 비 실, 독도 Langerhans 및 독도 크기 (50-250 µ m), 내 분 비 세포 비율, 및 ( 15에서에서 검토 한 결과 당뇨병에 특히 밀도에 알고 있다 ,16). 프로토콜 개발, 인간의 췌 장에 대 한 여러 가지 광학 개간 방법을 테스트 하 고 협정 절차 신경 및 독도의 우수한 형태 보존 시간 (~ 2 주)를 최고의 균형을 발견. 여기에 설명 된 마지막 최적화 절차는 대 한 신경 섬 네트워크의 묘사에 대규모 (밀리미터 거리) 및 여러 그대로 췌 장 독도의 고해상도 3D 이미징. 후 샘플으로 저장 중립 버퍼링 된 포 르 말린 고정 파라핀 왁 스에 포함 된 기술은 인간의 췌 장 바로 다음 고정 또는 적당 하다. 샘플은 여 confocal 영상에 대 한 적합 한 또는 lightsheet 현미경 검사 법.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S375-500</td>
			<td>PB buffer (RIMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71507-250</td>
			<td>PB buffer (RIMS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-5</td>
			<td>Immersion fixation, hydrogel, storage solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0140</td>
			<td>Hydrogel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bis-acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td>Hydrogel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 initiator</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>VA044</td>
			<td>Hydrogel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-5</td>
			<td>Clearing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8032</td>
			<td>Sample storage buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-840-91</td>
			<td>Degassing hydrogel solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 tank</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>various</td>
			<td>Degassing hydrogel solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100 ml</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat, normal serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>Use as 2% in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2158-100G</td>
			<td>RIMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>710</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSheet microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Z1</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-4820R-A488</td>
			<td>Host: Rabbit 
			Dilution: 1:100 
			Comments: Did not work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0754</td>
			<td>Host: Mouse 
			Dilution: 1:200 
			Comments: Did not work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>Host: Rabbit 
			Dilution: 1:50 
			Comments: Worked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565891</td>
			<td>Host: Mouse 
			Dilution: 1:50 
			Comments: Worked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2760S</td>
			<td>Host: Rabbit 
			Dilution: 1:200 
			Comments: Did not work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10988</td>
			<td>Host: Mouse 
			Dilution: 1:200 
			Comments: Worked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0564</td>
			<td>Host: Guinea Pig 
			Dilution: 1:200 
			Comments: Worked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCAM (CD56)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M730429-2</td>
			<td>Host: Mouse 
			Dilution: 1:50 
			Comments: Did not work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCAM (CD56)-FITC conjugate</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M730429-2</td>
			<td>Host: Mouse 
			Dilution: 1:50 
			Comments: Did not work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripherin</td>
			<td>EnCor</td>
			<td>RPCA-Peri</td>
			<td>Host: Rabbit 
			Dilution: 1:100 
			Comments: Worked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGP9.5</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z5116</td>
			<td>Host: Rabbit 
			Dilution: 1:50 
			Comments: Did not work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secretogranin 3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA006880</td>
			<td>Host: Rabbit 
			Dilution: 1:200 
			Comments: Worked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth muscle actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5228; C6198 (Cy5)</td>
			<td>Host: Mouse 
			Dilution: 1:200; 1:200 
			Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substance P</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>8450-0505</td>
			<td>Host: Rat 
			Dilution: 1:200 
			Comments: Worked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>Host: Rabbit 
			Dilution: 1:200 
			Comments: Worked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab76442</td>
			<td>Host: Chicken 
			Dilution: 1:100 
			Comments: Worked, but weak staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vasoactive Intestinal Peptide (VIP)</td>
			<td>Immunostar</td>
			<td>20077</td>
			<td>Host: Rabbit 
			Dilution: 1:100 
			Comments: Worked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>139103</td>
			<td>Host: Rabbit 
			Dilution: 1:50 
			Comments: Worked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td>Host: Goat 
			Dilution: 1:200 
			Comments: AlexaFluor conjugates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td>Host: Goat 
			Dilution: 1:200 
			Comments: AlexaFluor conjugates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td>Host: Goat 
			Dilution: 1:200 
			Comments: AlexaFluor conjugates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td>Host: Goat, Donkey 
			Dilution: 1:200 
			Comments: AlexaFluor conjugates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td>Host: Goat 
			Dilution: 1:200 
			Comments: AlexaFluor conjugates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution 3d imaging of the human pancreas neuro-insular network

전통적인 조직학 방법을 사용 하 여, 연구원은 그들의 능력을 이미지 전체에 방해는 조직이 나 장기 대규모 3d에서. 조직학 단면도 일반적으로 < 20 µ m로 포 르 말린 고정 파라핀 섹션 유리 슬라이드에 또는 < 부동성 고정된 섹션에 대 한 500 µ m. 따라서, 광범위 한 노력은 직렬 단면화 및 샘플에 대 한 3D를 다시 대규모 이미지 재건 방법 > 전통적인 방법을 사용 하 여 500 µ m. 또한, 내 조직, 특히 지질, 고분자에서 빛 없앤다 방지 깊이 영상 > 가장 confocal 현미경으로 150 µ m. 빛 분산을 줄이고 간단한 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 깊은 조직 이미징 수 있도록, 다양 한 광학 개간 방법 그는 설치류와 인간의 조직 샘플에 대 한 관련 고정 침수에 의해 개발 되어 왔다. 여러 가지 방법을 관련 고 아크릴 아 미드와 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)와 지우기 조직 단백질 가교를 사용 합니다. 다른 광학 개간 기술 사용 다양 한 용 매 다양 한 장점과 단점 각 수정 했다. 여기, 인간의 췌 장 신경 분포의 연구와 인간의 독도의 신경 분포의 심문을 위해 특별히 최적화 된 수동 광 개간 방법 설명 되어 있습니다.

이러한 착 절차는 독도 관련 된 자율 고 감각 네트워크를 검사 하는 인간의 췌의 대규모 시험을 제공 하기 위해 개발 되었다. 선명도7,17, iDISCO 포함 하 여 여러 절차를 테스트 하 고 최고의 발견 협정 방법으로 협정8 인간의 췌 장 및 confocal 영상에 적합.
1 차 항 체 처음 테스트에 적합 한 긍정적이 고 부정적인 제어 샘플 인간의 췌 샘플 고정 (뇌, 마우스 다른). 각 실험실 많은 번호와 조직 소스에 따라 항 체 희석 최적화를 기대할 수 있지만 주 항 체 및 제안된 희석 재료의 테이블에 나열 됩니다. 1 차적인 항 체 로트 변형 영향을 얼룩 강렬과 특이성, 고 전 시 약으로 얼룩 강도의 동일한 정도 달성 하기 위해 확인을 요구 수 있습니다.
인간의 췌에서 독도 인슐린, 글 루카 곤, 및 secretogranin 3 (그림 2)에 의해 구분 된 했다. Schwann 세포 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP, 그림 2 및 그림 3A)를 사용 하 여 구분 된 했다. 신경 부 교감 신경 마커 vasoactive 창 자 펩 티 드 (VIP)에 대 한 항 체로 얼룩진 Lightsheet (그림 3B)에 몇 군데 있었다. 교감 신경은 티로신 hydroxylase (표시 되지 않음)에 대 한 얼룩으로 볼 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig1.jpg"> 그림 1입니다. 인간의 췌 광학 개간. (A) 면도날 잘라내어 조직 단면도 제거 하 고 조직 (하단 패널)에서 멀리 초과 파라핀 된다고 하기 전에 파라핀 끼워 넣어진 조직 (상단 패널)의 섹션을 느슨하게 사용 됩니다. 대표 조직 샘플 (오른쪽 B, C 가운데) 광 개간 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 파라핀 끼워 넣어진 조직의 전후 (B 왼쪽된, C 위쪽) 에 표시 됩니다. 취소, 고정 조직 (B, C 최고) 와 종종 조직 후 완전히 투명 하지 않습니다 붓기 수 있습니다 (C, 중간 패널)평가. 허가 조직 바퀴 (C, 하단 패널)에서 평형 후 완전히 투명 하 게 된다. 바 규모: 500 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig2.jpg"> 그림 2입니다. 인간의 신경 섬 네트워크. NPOD 장기 기증자 또는 보관 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 설명 된 대로 인간의 췌 샘플 삭제 했다. (A-D) Schwann 세포 (GFAP + 흰색) 하 고 내 분 비 세포 (빨간색) 인슐린과 글 루카 곤 (녹색)으로 얼룩진 표시 됩니다. (A) Confocal 현미경 검사 법 및 최대 강도 투영 (MIP) 섬 주변에서 혈관 옆 전기가 하 고는 독도에 신경에 Schwann 세포 GFAP (+)의 추적을 보여줍니다. 삽입 된 높은 해상도 고 GFAP + Schwann 세포와 내 분 비 세포 사이 접촉을 보여줍니다 보여줍니다. (B) 패널의 3D 이미지 (규모: x = 50 µ m, y = 20 µ m, z = 25 µ m) a. 파라핀 협정 샘플 confocal 현미경 검사 법을 통해 이미지 표시 됩니다 고 최대 강도 프로젝션 (C) 과 3 차원 (D)에 제시, 확장: x, y = 50 µ m, z = 25 µ m). 스케일 바 , C: 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig3.jpg"> 그림 3. 3D 시각화 및 바느질. 3 바느질된 이미지 스택은 Schwann 세포 GFAP confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 스테인드 및 이미지 분석 소프트웨어에 neurite 추적기 플러그인을 사용 하 여 추적의 인수 했다. (A) 추적의 3D 채우기가 표시 됩니다 (막대를 확장: x = 150 µ m, y = 200 µ m (0.2 m m), z = 120 µ m) (B) A 협정 샘플과 VIP 항 체로 얼룩진 했다 lightsheet 현미경을 사용 하 여 몇 군데. 스택이 > 1 mm 깊이 신경 섬유에 높은 해상도에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. 섬유 포장 (D, 전경) 덕트와 신경 절 (G, 배경)를 볼 수 있습니다 (큰 그리드: x, y, z = 200 µ m; 눈금 표시: x, y, z = 40 µ m). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

high-resolution-3d-imaging-of-the-human-pancreas-neuro-insular-network

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K 조회수.  University of Florida. 여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.

비디오: High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

연구

생체공학

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

고해상도 3D 영상의 전 VIVO</em마이크로 중부 표준시로> 생물 학적 샘플

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

증식하는 연속 고해상도 현미경으로 관찰 신진 효모의 노화

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

인간의 유선 상피의 호르몬 응답 3D 문화 모델

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

근적외선 Photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3D 문화에서 선택적 세포 제거

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

절연 및 전체 돼지 췌 장 Decellularization

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...