일은 FDOH-7ZK15, NIAID 1R21AI128188-01 일부 지원 했다. 이 간행물에 보고 된 연구 알레르기의 국가 학회 및 감염 증 그리고 부분에서 생물 의학 연구 프로그램의 플로리다의 건강 부에 의해 부분에서 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 NIH 또는 플로리다 보건 공식 의견을 대표 하지 않는다. 동적 조합 화학 LLC는 그들의 지원 및이 프로젝트에 기여 인정 받고 있습니다.
뎅기열 1 바이러스 (스트레인 BOL-KW010) 친절 하 게 하 여 플로리다 학과의 건강 국 실험실을 제공 했다. Zika 바이러스, chikungunya 바이러스의 아시아 혈통 기꺼이 제공 되었다 센터 질병 관리 및 예방에 대 한. Chikungunya 바이러스의 인도양 혈통 UF-FMEL에 로버트 Tesh (신흥 바이러스와 Arboviruses, Galveston, 텍사스에서 텍사스 대학 의료 지점 통해 세계 참조 센터)에 의해 친절 하 게 제공 되었다. 우리를 통해 감염 연구 S. 벨라미, B. Eastmond, S. 오티 스, 디 벨 레즈, K. Wiggins, R. ZimLer, 그리고 K. Zirbel 감사합니다. 우리는 또한 Q-종이 제공 하기 위한 M. S. 김 감사 합니다.

참고: 모기는이 연구에 직접 사용 하는 유일한 동물 이었다. 누구의 혈액 감염 된 모기를 피드 하는 데 사용 되었다, 닭을 관리 하는 절차 플로리다 대학 기관 동물 관리 및 사용 Committee.Virus 전파 IACUC 프로토콜 # 201507682로 승인 했다 및 모기 감염 연구 했다 층 RT-램프 실험 FfAME와 건배, 플로리다에서 파이어 버드 바이오 과학 LLC BSL-2 실험실에서 수행한 Vero 비치에서 플로리다 의학 곤충학 실험실의 BSL-3 시설에서 수행
1. 디자인의 뇌관과 가닥 프로브를 전치
<ol><li>광범위 한 연구소 데이터베이스23;에서 뎅기열 1 바이러스 시퀀스를 추출 Zika 및 NIAID 바이러스 병원 체 데이터베이스와 분석 리소스24chikungunya 시퀀스.<ol>
<li>여러 시퀀스 정렬 (MSAs) 시퀀스에 대 한 관심 소프트웨어 근육 v3.8.3125를 사용 하 여 만듭니다. 생성 된 MSAs를 사용 하 여 대상의 보존된 영역 내 램프 뇌관 세트에 대 한 검색 하 고 관련 없는 또는 의도 하지 않은 대상, 대상의 하위 사이의 구분 등을 피하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>설명된 온라인 (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/)로 램프 뇌관에 대 한 설계 규칙을 따라 하 고 바이러스 발산26커버에 뇌관에서 혼합된 기지의 사용을 허용. 뇌관 세트의 분을 피하기 위해, NCBI 폭발27을 사용 하 여 NCBI RNA 바이러스 데이터베이스에 생성 된 램프 뇌관을 비교 합니다. 뿐만 NCBI 폭발을 사용 하 여 분석 결과 다중화에 dimerize 것 뇌관을 제거 하기 위해 각 집합을 비교 합니다.</li>
	<li>어떤 바이러스 성 게놈 시퀀스 및 모기 게놈 시퀀스에 대 한 가닥을 전치 프로브의 더블-좌초 부분 화면. 각각 5'-끝 fluorescein amidite (FAM), 16 진수 염료, Zika, chikungunya, 뎅 그 열의 1, 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) 염료와 대상 바인딩 프로브를 수정 합니다.<ol>
<li>긍정적인 통제 뇌관을 소변 샘플에 대 한 설정 포함 됩니다. 인간의 미토 콘 드리 아 DNA를 대상으로 램프 뇌관 디자인. 레이블 가닥 displacing 프로브 TET 5'-끝에. 각각 부분적으로 보완 붙일 레이블 끄는 프로브 3'-끝 (표 1)에 (예를 들어, 아이오와 블랙 FQ)을 끄는 프로브 표시.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 바이러스 격리 및 감염 모기 샘플
<ol><li>사용은 Zika 바이러스 (푸에르토리코 스트레인), Chikungunya 바이러스 (라 레위니옹 또는 영국령 버진 아일랜드 스트레인)와 뎅기열 serotype-1 (키 웨스트 스트레인)의 분리합니다. 상 패 분석 결과28 또는 정량 RT-PCR29를 사용 하 여 바이러스 titers를 확인 합니다. 바이러스 성 RNAs를 상용 RNA 추출 키트를 사용 하 여 압축을 풉니다. 참고: 표 2 이 연구에 사용 된 각 바이러스 분리의 바이러스 titers을 나타냅니다.</li>
	<li>의해 Yaren 외. Ae aegypti 여성 Zika과 chikungunya 바이러스20의 감염에 대 한 자세한 프로토콜에 대 한 문서를 따르십시오. Zika 바이러스에 감염 된 모기 샘플의 바이러스 titer 표 2 를 참조 하십시오.</li>
</ol>3. RT-램프 Thermolabile Uracil DNA Glycosylase와 결합
<ol><li>
뇌관 믹스 준비 X 10입니다.
	<ol>
<li>각 뇌관의 100 µ M 재고 솔루션을 준비 하 고 (단계 1 참조) 프로브 nuclease 무료 수를 추가 하 여. 잘 소용돌이 그리고 저장소 사용까지-20 ° C에서.</li>
		<li>각 Zika, 뎅기열 1 또는 미토 콘 드리 아 DNA 대상 혼합 16 µ L FIP, 16 µ BIP, L의 10 X 뇌관 믹스에 대 한 f 3, b 3, LF, 파운드, 파운드-형광의 3 µ L의 2 µ L의 5 µ L의 2 µ L의 2 µ L 분류 조사, 끄는 프로브 4 µ L 그리고 50 µ L 100 µ L 볼륨의 총을 주고 nuclease 무료 물.</li>
		<li>10 X 뇌관 믹스 Chikungunya, FIP, 16 µ L BIP, F3, B3, 파운드, LF의 2 µ L의 5 µ L의 2 µ L의 2 µ L의 16 µ L을 혼합에 대 한 조사, 끄는 조사의 4 µ L 및 100 µ L 볼륨의 총을 주고 nuclease 무료 물 50 µ L LF-형광의 3 µ L 표시. 참고: 최종 형광 프로브 및 400의 사용 300 nM 위에서 설명한 프로브 농도 끄는 프로브의 nM. 붙일 레이블된 프로브 및 200의 사용 80 nM 또는 실시간 분석을 위한 그것의 끄는 프로브의 nM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>뇌관 믹스 X 10의 5 µ L을 추가 (3-플렉스, 뇌관 믹스 배 각 10의 5 µ L 추가) 등온 증폭 버퍼 X 10의 5 µ L (1 X 버퍼 구성: 20 mM Tris HCl 버퍼 pH 8.8, 50 m m KCl, 10mm (NH4)2등4, 8 mM MgSO4 0.1% 트윈-20, 1 mM DTT), dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP의 10 m m, 5mm dTTP 및 dUTP)의 7 µ L, 16 대의 DNA 중 합 효소, 역전사, 재조합 ribonuclease 억제제의 80 단위, 2 단위 thermolabile UDG, vi의 다양 한 금액의 1-2 µ L의 15 단위 ral RNAs, 및 0.25 mL PCR에서에서 50 µ L까지 총 볼륨을가지고 물 튜브 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>물으로 바이러스 성 RNA 볼륨을 대체 하 여이 단계에서 부정적인 제어 분석을 포함 합니다. 1 시간 45 분 65-68 ° C 사이 샘플을 품 어 다음 ethidium 평범한 사람 (0.4 µ g/mL)를 포함 하는 1 X TBE 버퍼에 2.5 %agarose 젤에 각 샘플의 5 µ L을 실행 하 여 분석 합니다. 25 사용 하 여 혈압 또는 젤에 마커로 50 bp DNA 사다리. 참고: 한 비 대상 서식 파일의 추가 선택 사항입니다.</li>
	<li>병원 성 RNA를 검출, 테스트 각 뇌관 세트 및 그것의 아니오 템플릿 제어 각 RT 램프 뇌관 세트는 다양 한 온도 (65 ° C 68 ° c) 또는 마그네슘에서 작동 하도록 설계 되었습니다 때문에, 온도 및 마그네슘 농도 변화 하 여 농도 (최종 6 ~ 10 mM)입니다. 실 온에서 실험을 준비 합니다.</li>
</ol>4. RT-램프 바이러스 성 RNA 아군 소변을 사용 하 여
<ol><li>총 반응 볼륨의 50 µ L에서 소변 (0%, 10%, 20%, 그리고 50%)의 최종 농도 변화에 실시간 램프 뇌관을 테스트 합니다. 10% 마지막 소변 농도, 소변의 5 µ L를 바이러스 성 RNA의 1 µ L를 추가 합니다. 20% 최종 소변 농도, 바이러스 성 RNA의 1 µ L 소변 10 µ L를 추가 합니다. 50% 마지막 소변 농도, 소변의 25 µ L를 바이러스 성 RNA의 1 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>실시간 모니터링 RT 램프의 소변의 10%에 대 한 실시간 PCR 악기를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 다른 fluorophore 필터.<ol>
<li>Zika 위해 팸 표시 amplicons에서 형광 신호를 읽고, 483에서 533까지 필터 사용 하 여 nm; 523에서 568에 이르기까지 필터를 사용 하는 16 진수 표시 amplicons chikungunya에 대 한, 대 한 nm; TAMRA 표시 된 뎅기열 1 amplicons, 558에서 610에 이르기까지 필터 사용 nm; TET 표시 된 미토 콘 드리 아 dna amplicons, 568 523에서까지 필터 사용 nm. 참고: 팸은 495의 여기 및 방출 최대 및 520 nm, 각각. 16 진수는 538의 여기 및 방출 최대 및 555 nm, 각각. TAMRA는 559의 여기 및 방출 최대 및 583 nm, 각각. TET는 522의 여기 및 방출 최대 및 539 nm, 각각.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사용 96 잘 접시와 인감 투명 한 플라스틱 시트와 플레이트 65-68 ° C에서 60-90 분에 대 한 샘플을 품 어 그리고 기록 형광 각 30 s 빛 자전거 타는 사람을 사용 하 여. 처음 80 nM 붙일 레이블 프로브, 그리고 붙일 레이블 프로브 테스트 300 nM를 사용 합니다.<ol>
<li>직렬로 추가 하 여 각 대상에 대 한 검출 한도 10%의 마지막 소변 농도에 바이러스 성 RNAs 희석 결정 합니다. 참고: 실시간 RT-램프를 사용 하 여 최적의 온도, 마그네슘 농도, 붙일 레이블된 프로브 농도, 반응 시간 결정.</li>
	</ol>
</li>
	<li>눈으로 가닥 displaceable 프로브에 의해 생성 된 형광 시각화, 470에 여기 빛 cycler에서 파란색 LED 광원을 사용 nm (내장 블루 광원으로 어떤 젤 전기 이동 법 상자 것입니다 작업 참조 하십시오 자료의 테이블), 이미지를 기록 하 고 함께 어둠 속에서 실 온에서 휴대 전화 카메라. 참고: 사용 300 nM 붙일 레이블된 프로브 때 모든 3의 시각화 푸른 LED를 사용 하 여 눈으로 색의 필요 합니다.</li>
</ol>5. Q-종이 기술을 사용 하 여 Zika 감염 모기의 탐지 RT-램프
<ol><li>약간의 수정을30이전 게시 된 방법에 따라 4 급 암모늄 수정 필터 종이 (Q-종이)를 준비 합니다.<ol>
<li>정품 인증에 대 일 분 NaOH 용액의 1.8%의 50 mL에 3.5 c m의 직경을 가진 섬유 필터 종이 원 ( 재료의 표참조)의 1 g을 담가.</li>
		<li>진공 여과 의해 활성화 된 종이 동그라미를 수집 하 고 그들에 담가 (2, 3-epoxypropyl) trimethylammonium 염화 (0.28 g)의 수 용액 40 mL 하룻밤 실 온에서. 참고: 필터 종이 0.28 1 (2, 3-epoxypropyl) trimethylammonium 염화의 대량 비율을 유지.</li>
		<li>진공 여과 의해 결과 양이온 종이 수집 하 고 1%의 아세트산 50 mL와 중화.</li>
		<li>종이 세 번 에탄올으로 세척 하 고 지속적인 공기 흐름이 후드 건조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>종이 펀치 또는 위를 사용 하 여 작은 사각형 (3 x 4 mm)으로 Q 종이 시트를 잘라. Ae aegypti 여성 모기 잠재적으로 감염 된 Zika 각 종이에 마이크로 유 봉과 호감.</li>
	<li>1 M 수성 암모니아 용액 (pH ≈ 12)의 각 종이 20 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 기다립니다. 다음에 각 종이 한 번 50% EtOH 20 µ L 20 µ L nuclease 무료 물 한 번 씻으십시오. BSL-2 biosafety 1 시간 약에 대 한 캐비닛에 종이 건조 참고:이 시점에서 샘플을 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 사용까지 하룻밤.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여, 각 종이에 RT 램프 반응 혼합물의 100 µ L 하 고 45 분 완전히 솔루션;에 종이 잠수함을 확실히 확인에 대 한 65-68 ° C에서 품 어 그것은 부동 하지 해야 합니다. 읽기와 블루 LED 광원을 사용 하 여 Zika 바이러스와 오렌지색 이나 노란색 필터에서 발생 하는 형광을 기록.</li>
</ol>6. 동결은 반응 볼륨의 100 µ L에 대 한 실시간-램프 시 약의
<ol><li>섹션 3.1에 따라 10 X 램프 뇌관 혼합물을 준비 하 고 포함 하는 섹션 3.2에 따라 dUTP dNTP 혼합물을 준비. 뇌관의 혼합물 및 dNTPs-20 ° C에서 사용까지 저장 합니다.</li>
	<li>1 M Tris HCl pH 7.5, 1 M KCl, 0.5 M EDTA, 10%의 100 µ L의 2 µ L의 500 µ L의 100 µ L를 혼합 하 여 글리세롤, 제거 효소 투 버퍼의 10 mL를 준비 Triton X-100, 100 µ L 0.1 M DTT의과 nuclease 무료 물 9.198 mL. 4 ° c.에 투 석 버퍼 저장 참고: 필터링 (0.2 미크론 필터) 사용 및 4 ° c.에서 그들을 저장 하기 전에 모든 버퍼 시 약 솔루션 확인<ol>
<li>외 막 10 kDa 차단 제한 사용 하 여 ( 재료의 표참조). 투 석 버퍼의 350 µ L, DNA 중 합 효소의 32 단위 4 µ L, 역전사, 30 단위로 2 µ L 및 RNase 억제제의 80 단위 2 µ L 장소 외 막 및 4 ° c.에서 5 분 14000 x g에서 원심 분리기</li>
		<li>외 막 및 원심 분리기 (14000 x g) 또 다른 5 분 빈 컬렉션 튜브에 대 한 투 석 버퍼의 또 다른 350 µ L을 추가 하 고이 단계를 반복 다음 3 분 (14000 x g) 원심.</li>
		<li>차입, 막 반전 하 고 새로운 컬렉션 튜브에. 1000 x g 2 분 측정 차입 볼륨;에 스핀 만약 투 석 버퍼를 추가 하 여 8 µ L까지 볼륨을가지고 8 µ L 보다 작은. 4 ° C에서 차입을 저장 하 고 즉시 다음 단계를 수행 하십시오. 참고:이 프로토콜은 단일 튜브 동결은, 하지만 같은 한 멤브레인을 사용 하 여 한 번에 적어도 10 반응 튜브를 준비 하 고 투 석 버퍼의 동일한 금액을 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>경우 10 X 램프 뇌관의 10 µ L을 혼합 singleplex (3-플렉스, 뇌관 믹스 배 각 10의 10 µ L 추가) dNTP 혼합물의 14 µ L, dialyzed 효소 혼합의 8 µ L, thermolabile UDG의 2 대의 2 µ L 및 물 (3-플렉스에 대 한 무료 nuclease의 66 µ L 46 µ L를 사용 하 여) 0.5 mL microcentrifuge 튜브와 뚜껑 열어 두고. 대신, 다른 뚜껑 증기 탈출 수 있도록 바늘으로 구멍을 추가 합니다.</li>
	<li>즉시-80 ° C 2 h에서 튜브를 고정 하 고 lyophilize 4 h. 커버 튜브 빛 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일로 동결은 챔버. 시 약, 건조 하면 구멍이 뚜껑을 제거, 원래 뚜껑 닫고 어둠 속에서 동결 건조 된 약 4 ° C에서 튜브를 저장 합니다. 참고: 시 약 수 수 lyophilized, 필요한 경우.</li>
</ol>7. 테스트 동결 건조 된 소변 및 모기 샘플 Zika 포함 시 약 실시간 램프
<ol><li>키트에서 다음 항목을 사용 하 여 참조 테이블의 자료Zika에 대 한: 오렌지 필터 (긴 패스 필터, 컷에 ~ 540 nm), 상자, 관찰 2 AAA 배터리 3 차원 인쇄 관찰 상자 동결 건조 된 반응 관 ZV Zika 검출, 분류 및 1.1 1.5 mL 나사 상단에 X 재 버퍼 튜브합니다.</li>
	<li>DNA 중 합 효소와 함께 제공 되는 등온 증폭 버퍼 X 10의 5.5 mL를 혼합 하 여 재 버퍼 X 1.1의 50 mL를 준비 ( 재료의 표참조), 100 mM MgSO4의 3.3 mL, 110 µ L의 0.5 M DTT, 그리고 nuclease 무료 물 41.09 mL. 잘, 1.5 mL 나사 탑 튜브에이 솔루션의 aliquot 1 mL를 혼합 하 고 사용까지 4 ° C에서 저장.</li>
	<li>각 반응 관 (0.5 mL)를 1.1 X 재 버퍼의 90 µ L를 추가 합니다. 액체 (디졸브 간단히 다음 흔들어, 혼합과 그들 스핀 (1000 x g) 다운) 동결 건조 된 시 약을 포함 하는 관의 바닥을 채우고 있는지 확인 합니다. (자세한 내용은 4.1 절 참조) 반응 관에 바이러스 성 RNA와 아군 소변 샘플의 10 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>모기를 테스트 하는 경우 사각형을 추가 질문 종이의 소변 샘플 대신 물 정화 모기 시체 (로 준비 단계에서에서 설명한 섹션 5.2 및 5.3), 10 µ L 함께 들고. 참고: 또는, 소변 대신 타 액 이나 혈 청 샘플의 10 µ L를 추가 합니다. 샘플 추출 된 DNA 또는 RNA는, rehydrated 혼합물으로 2-5 µ L의 샘플을 추가 하 고 nuclease 무료 물 10 µ L 최종 샘플 볼륨의로 완료.</li>
	</ol>
</li>
	<li>반응 관의 뚜껑을 닫습니다. 전 65-68 ° c.에 설정 열 블록/욕조 (또는 인큐베이터)에 넣어 30-45 분, 하지만 더 이상의 1 시간을 품 어. 부 화, 후 열에서 튜브를 제거 합니다. 오염을 방지 하기 위해 미래 분석 실험의,이 관 폐쇄 유지 확인 합니다.</li>
	<li>관찰 상자; 있는 장소 반응 관 온도 주위 온도 (선호 25 ° C) 떨어질 것 이다. 관찰 상자 뒷면에 있는 스위치를 켭니다. 오렌지 필터를 통해 샘플을 관찰 하 고 휴대 전화 카메라 이미지 보기의 필드의 80%를 채우고 거리에서 개최 되는 이미지를 캡처하십시오. 참고: 더 나은 시각화 낮은 조명 환경에서 이루어집니다.</li>
	<li>시각화 완료 되 면, 스위치를 해제 합니다. 나중 시각화 필요한 경우 냉동, 가령 어둠 속에서 밀봉 된 튜브를 저장 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multiplexed+xMAP+Luminex+array+panel+for+detection+of+twenty+two+medically+important+mosquito-borne+arboviruses+based+on+innovations+in+synthetic+biology.">High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology.</a> J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).</li><li>Yaren, O., Benner, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop+Mediated+Amplifications+with+Nucleoside+Analogs.">Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs.</a> US Provisional patent. , (2016).</li></ol>

저자 및 그들의 기관의 몇몇이 분석 결과와 관련 된 지적 재산권을 소유.

Zika, chikungunya, 뎅기열 등 모기 매개 바이러스 위협 공중 보건 및 최근 Zika 확산 강조 저가 포인트의 케어 탐지 대안 모기 감시 뿐만 아니라 환자 진단에 대 한 필요 합니다. 등온 증폭 방법 저렴 한 대안 PCR 기반 시스템으로 개발 되었다. 특히, RT-램프-기반 플랫폼 다양 한 병원 체 검출 적용 되었습니다. 그러나, 등온선 플랫폼의 사용 주로 단일 대상 검색 제한 되었습니다. 보고 하는 방법 여기를 사?...

모기 품 어진 바이러스 감염, 뎅기열, Zika 바이러스, chikungunya, 등 상승 및 수요 즉시 관리 전략에 있다. 뎅 그 열과 chikungunya 바이러스는 이미 많은 Zika 서반구1확산 지금 열 대 지역에서 발병. Zika 바이러스, 뎅기열, 같은 Flaviviridae 가족의 멤버 이며 한 아시아와 아프리카 유전 계보2개의 아프리카 출신 이다. Zika 바이러스의 식별 거슬러 1947, 비록 인간에서 Zika 감염 태평양 및 아메리카에서 신흥 전에 반세기에 대 한 산발적 남아. 2007 년에 미크로네시아 야프 섬에 발생 하는 발열 Zika의 첫 번째 보고 발발 뒤 2013과 2014 년에 프랑스령 폴리네시아. 아메리카에 있는 첫 번째 주요 발발 2015 년에서 브라질에서 발생 했습니다.
Zika, chikungunya, 뎅 기 바이러스는 주로 Aedes aegypti Aedes albopictus에의해 전송 됩니다. 그러나, Zika 추가 다운스트림 인간에 인간 전송 가능성, 아마 성적 접촉, 어머니 태아 상호 작용, 및3,,45모유를 통해 확산 되 고 있다. Zika 발열만 가벼운 질병을 처음으로 알려졌다. 그러나, 그것은 나중 어른에 Guillain-바레 증후군, 신생아, 그리고 지난 달에 년 수 있습니다 만성 musculoskeletal 질환 microcephaly 연관. Zika 질병의 진단 Zika 감염의 증상은 다른 모기 확산 바이러스6의 것과 유사 하기 때문에, 도전적 일 수 있습니다. 이러한 바이러스의 일반적인 공동 감염 확인 차별 진단 더욱 도전7,8. 따라서, Zika와 다른 바이러스 핵 산의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 검색 실시간으로, 제어 및 예방 측정을 시작 하 고 환자 치료9를 관리 하는 역학을 이해 하는 것 필요 합니다.
이 바이러스에 대 한 현재 진단 테스트는 혈 청 학적인 검사, 바이러스, 바이러스 시퀀싱, 고립과 반전 전사 PCR (RT-PCR) 포함 됩니다. 표준 혈 청 학적인 접근은 종종 부적 절 한 감도에서 고통 그리고 결과 다른 flaviviruses에 의해 이전에 감염 환자에서 분에 의해 복잡 하 게 될 수 있습니다.
따라서, 핵 산 테스트 감지 하 고이 바이러스를 차별화 하는 가장 신뢰할 수 있는 방법에 남아 있다. Zika 다른 모기 품 어진 바이러스의 검출은 일반적으로 RT-PCR 또는 생물 학적 체액, 혈 청, 소변, 타 액, 정액, 모유, 그리고 대뇌 유체10,11등의 다양 한 실시간 RT-PCR를 사용 하 여 수행 됩니다. 소변과 타 액 샘플은 그들은 전시 적은 PCR 저해, 높은 바이러스 부하, 오랜 시간, 그리고 수집 및 처리12,13의 증가 용이성에 대 한 바이러스 존재 하기 때문에 혈액, 동안 일반적으로 선호. 그러나, RT-PCR 기반 진단 테스트를 구성 하는 광범위 한 샘플 준비 단계와 덜 포인트의 케어에 대 한 최적의 만드는 비싼 열 사이클링 장비.
반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프) 높은 감도 및 특이성14강력한 RT-PCR 대 안으로 떠오르고 있다, 생물에 금지 물질에 대 한 관용 샘플링15, 그리고 단일 온도 크게 낮춘 다 시험의 복잡성 및 관련 된 비용, 낮은 자원 환경에 적합 하에 작업. RT-램프, 고전적인 구현 6 뇌관 대상 RNA 내에서 8 가지 영역에 바인딩되는 구성 되어 있습니다. 60 ° C 및 70 ° C, 사이 일정 한 온도에서 실행 하 고 활동을 전치 하는 강한 가닥으로는 역전사 효소 및 DNA 중 합 효소를 사용 하 여.
RT-램프의 초기 단계 동안 앞뒤로 내부 뇌관 (FIP, BIP, 그림 1A) 외부 앞뒤로 뇌관 (f 3와 B3) 함께 아령 구조 지 수 램프 증폭의 씨앗 구조를 형성합니다. 증폭 루프 앞뒤로 뇌관 (LF와 파운드), 아령의 단일 좌초 지역 바인딩할 설계에 의해 더욱 가속 그리고 여러 반복 concatemers의 형성에서 결과16루프. 클래식 램프에 따라 탁도 분석 실험 또는 Zika, 다중화의 어느 정도 포인트의 케어 탐지 원하는17,18,19대 한 DNA intercalating 염료에 의해 판독은 완전히 적합 하지 않습니다. 멀티플렉싱은 하지 쉽게 얻을 이러한 시스템은 오프 대상 확대로 인해 가양성을 생성 하는 경향이.
이러한 문제를 관리 하기 위해 문학 클래식 RT 램프 아키텍처20,,2122"물가 전치 프로브"의 형태로 추가 구성 요소를 추가 합니다. 각 프로브는 시퀀스 관련 이중 가닥 지역 및 단일 가닥 못쓰게 지역. 단일 가닥 지역 조사는 5'-fluorophore, 태그입니다 그리고 보완 조사 3'-끝 끄는 수정 됩니다. 대상의 부재에서 아무 형광 근접에 fluorophore 및 끄는 보완 조사 가닥의 교 잡 때문에 관찰 된다. 대상 존재 형광 프로브의 단일 가닥 부분 대상에서의 보완을 하 고 중 합 효소를 전치 하는 물가 의해 확장 됩니다. 반전 뇌관에 의해 더 중 합 효소 확장 하면 형광 (그림 1B)의 방출을 허용의 보완 붙일 레이블된 스트랜드에서 끄는 가닥의 분리. 이 디자인으로, 신호는 긍정 신호의 가능성을 감소 아령 형성 후 생성 됩니다.
더블-좌초 부분의 물가 전치 프로브 어떤 시퀀스 수 있으며 멀티플렉싱 적용 될 때 동일한 시퀀스가 다른 fluorophore-끄는 쌍 함께 사용할 수 있습니다. 이 아키텍처, 바이러스에 오염 된 소변, 혈 청, 또는 모기 샘플 종이에 지기까지 직접 샘플 준비 없이 분석 결과를 소개 했다. 3 색 형광 지요 인간의 눈에 보이지는 30-45 분 내에서 생성 된 고 신호 3D 인쇄 관찰 상자 블루 LED와 오렌지 필터를 사용 하 여 시각화 했다. RT-램프 시 약 freeze-drying 냉장에 대 한 필요 없이 리소스 설정을 낮은이 키트의 배포를 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS</td><td>Major Science</td><td>MBE-150</td><td>Gel electrophoresis</td></tr><tr><td>G:BOX F3</td><td>Syngene</td><td>G:BOX F3</td><td>Gel imaging</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrument II, 96-well</td><td>Roche Applied Science</td><td>05 015 278 001</td><td>Real-time PCR</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td>ultrafiltraton membrane for dialysis</td></tr><tr><td>Eppendorf 5417C Centrifuge</td><td>Marshall Scientific</td><td>EP-5417C</td><td>centrifuge</td></tr><tr><td>Myblock Mini Drybath</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH200</td><td>drybath</td></tr><tr><td>FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7934020</td><td>lyophilizer</td></tr><tr><td>all priers and probes</td><td>IDT</td><td>custom</td><td>RT-LAMP primers and probes</td></tr><tr><td>dNTP set</td><td>Bioline</td><td>BIO-39049</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyuridine Triphosphate (dUTP)</td><td>Promega</td><td>U1191</td><td></td></tr><tr><td>Bst&amp;nbsp;2.0 WarmStart&amp;nbsp;DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0538L</td><td>enzyme</td></tr><tr><td>WarmStart RTx Reverse Transcriptase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0380L</td><td>enzyme</td></tr><tr><td>RNase Inhibitor, Murine</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314L</td><td>enzyme</td></tr><tr><td>Antarctic Thermolabile UDG</td><td>New England Biolabs</td><td>M0372L</td><td>enzyme</td></tr><tr><td>50bp DNA Step Ladder</td><td>Promega</td><td>G4521</td><td>marker</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td><td>Roche Applied Science</td><td>4729692001</td><td>real-time RT-LAMP analysis</td></tr></tbody></table>

multiplexed isothermal amplification based diagnostic platform to detect zika, chikungunya, and dengue 1

Zika, 뎅기열, chikungunya 바이러스는 전송 모기에 의해 유사한 환자 증상을 가진 질병을 일으키는. 그러나, 다른 다운스트림 환자 환자 전송 잠재력와 매우 다른 환자 치료를 필요로 합니다. 따라서, 최근 Zika 발생 긴급 환자에서 이러한 바이러스를 신속 하 게 차별 하는 도구를 개발 하 게 하 고 모기, 올바른 환자 치료를 선택 하 고 이해 하 고 실시간으로 자신의 역학 관리 갇혀.
불행 하 게도, 그 수신 2016 비상을 포함 하는 현재 진단 테스트 사용 권한 및 긴급 상태, 바이러스 성 RNA 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR) 계측을 요구 하 여 훈련, 사용자 감지 및 상당한 샘플 준비입니다. 따라서, 그들은 "승인 된" 기준 실험실, 요구 시간에 전송 되어야 합니다. 실제로, 2016 년 8 월, 센터 질병 통제 (CDC)에 대 한 요청 했다 임산부 누가 왔다 모기에 의해 물리 고 그들이 감염 했다 허용 되지 않는 2 ~ 4 주 학습 전에 기다려야 Zika 나타내는 발진을 개발. 우리는 아주 많이 테스트 사이트, 몇 가지 리소스와 훈련 하지만 반드시 허가 된 직원에 의해 할 수 있는 필요 합니다.
이 비디오는 많은 샘플 준비 없이 소변 또는 (환자)에 대 한 혈 청 또는 짓 눌린된 모기 시체 (대 한 환경 감시), 이러한 규격을 만족 하는 분석 결과 보여 줍니다. 모기 시체 4 급 암모늄 그룹 (Q-종이) 암모니아 처리 뒤에 생물 학적 관리를 들고 종이에 캡처됩니다. 이 다음 직접, RNA 격리 없이 넣고 냉동의 아무 사슬 필요 동결된 시 약을 포함 하는 분석 결과 튜브. 수정 된 형태의 특정 대상 붙일 태그가 displaceable 프로브 루프 중재 등온 증폭 반전 녹음 방송 3 색 형광 신호 판독, 30 분에 생성합니다. 이 오렌지 필터 휴대용, 배터리 구동 장치 시각 이다. 밀봉 된 튜브와 dUTP 증폭 혼합물에 존재 thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG)를 사용 하 여 앞으로 오염 방지 된다.

처음에, 각 RT 램프 뇌관 (표 1)는 해당 바이러스 성 RNA 기판 뿐만 아니라 부정적인 컨트롤의 젤 전기 이동 법으로 평가 됐다. RT-램프 뇌관 Chikungunya에 대 한 대상 NS5 (RNA 의존 RNA 중 합 효소) Zika 및 뎅기열 1, 지역과 nsP2 지역 (비 구조 단백질 P2) 하도록 설계 되었습니다. 서식 파일 총 RNA 바이러스 주식 교양된 아프리카 녹색 원숭이 신장 (Vero) 세포에서에서 추출 했...

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Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

multiplexed-isothermal-amplification-based-diagnostic-platform-to

Research

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Biochemistry

14.2K 조회수.  Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME). 현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

비디오: Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth defects. The goal of this protocol is to quickly detect ZIKV in both human and mosquito samples. The current gold standard for ZIKV detection is quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR); reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) may allow for a more efficient and low-cost testing without the need for expensive equipment. In this study, RT-LAMP is used for ZIKV detection in various biological samples within 30 min, without first isolating the RNA from the sample. This technique is demonstrated using ZIKV infected patient urine and serum, and infected mosquito samples. 18S ribosomal ribonucleic acid and actin are used as controls in human and mosquito samples, respectively.

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

This protocol provides an efficient and low-cost method to detect Zika virus or control targets in human urine and serum samples or in mosquitoes by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). This method does not require RNA isolation and can be done within 30 min.

반대로 Zika 바이러스 및 내부 관리 유전자 소변, 혈 청, 그리고 모기 샘플에 대 한 분석 결과 전사 루프 중재 하는 등온 증폭 (RT-램프)

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

연구

유전학

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

생체공학

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika 바이러스 특정 진단 Epitope 발견

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

면역학 및 감염병학

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider implications for the well-being of societies and economic stability. Recent years have seen several new isothermal diagnostic modalities emerge to meet the need for rapid, low-cost molecular diagnostics. We have contributed to this effort through the development and patient validation of toehold switch-based diagnostics, including diagnostics for the mosquito-borne Zika and chikungunya viruses, which provided performance comparable to gold-standard reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) based assays. These diagnostics are inexpensive to develop and manufacture, and they have the potential to provide diagnostic capacity to low-resource environments. Here the protocol provides all the steps necessary for the development of a switch-based assay for Zika virus detection. The article takes readers through the stepwise diagnostic development process. First, genomic sequences of Zika virus serve as inputs for the computational design of candidate switches using open-source software. Next, the assembly of the sensors for empirical screening with synthetic RNA sequences and optimization of diagnostic sensitivity is shown. Once complete, validation is performed with patient samples in parallel with RT-qPCR, and a purpose-built optical reader, PLUM. This work provides a technical roadmap to researchers for the development of low-cost toehold switch-based sensors for applications in human health, agriculture, and environmental monitoring.

Access to decentralized, low-cost, and high-capacity diagnostics that can be deployed into the community for decentralized testing is critical for combating global health crises. This manuscript describes how to build paper-based diagnostics for viral RNA sequences that can be detected with a portable optical reader.

종이 기반 토홀드 스위치 진단의 개발 및 환자 검증을 위한 설계-구현 연구

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) formats. The flavivirus non-structural (NS) proteins are thought to co-translationally assemble on the endoplasmic reticulum (ER) membranes, forming the replication complex (RC). The NS3 and NS5 are the most studied enzymes of the RC and constitute the main targets for drug development due to their crucial roles in viral genome replication. NS3 protease domain, which requires NS2B as its cofactor, is responsible for the cleavage of the immature viral polyprotein into the mature NS proteins, whereas NS5 RdRp domain is responsible for the RNA replication. Herein, we describe in detail the protocols used in replicon-based screenings and enzymatic assays to test large compound libraries for inhibitors of the Zika virus (ZIKV) replication. Replicons are self-replicating subgenomic systems expressed in mammalian cells, in which the viral structural genes are replaced by a reporter gene. The inhibitory effects of compounds on viral RNA replication can be easily evaluated by measuring the reduction in the reporter protein activity. The replicon-based screenings were performed using a BHK-21 ZIKV replicon cell line expressing Renilla luciferase as a reporter gene. To characterize the specific targets of identified compounds, we established in-vitro fluorescence-based assays for recombinantly expressed NS3 protease and NS5 RdRp. The proteolytic activity of the viral protease was measured by using the fluorogenic peptide substrate Bz-nKRR-AMC, while the NS5 RdRp elongation activity was directly detected by the increase of the fluorescent signal of SYBR Green I during RNA elongation, using the synthetic biotinylated self-priming template 3&#8242;UTR-U30 (5&#39;-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3&#39;).

In this work, we describe the protocols used in replicon-based and viral enzyme-based assays to screen for inhibitors of Zika virus replication in a high-throughput screening format.

지카 바이러스 복제억제제에 대한 화면에 높은 처리량 항 바이러스 적 소사

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel pathogens, such as SARS-CoV-2. Multiplex serological testing can be particularly useful because it can simultaneously analyze antibodies to multiple antigens that optimizes pathogen coverage, and controls for variability in the organism and the individual host response. Here we describe a SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescent microsphere-based assay that can detect both IgM and IgG antibodies to three major SARS-CoV-2 antigens-the spike (S) protein, spike angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) receptor-binding domain (RBD), and nucleocapsid (Nc). The assay was shown to have comparable performance to a SARS-CoV-2 reference assay for IgG in serum obtained at &#8805;21 days from symptom onset but had higher sensitivity with samples collected at &#8804;5 days from symptom onset. Further, using soluble ACE2 in a neutralization assay format, inhibition of antibody binding was demonstrated for S and RBD.

A flow analysis system for bead-based multiplexed assays which provides a two-reporter readout was used for the development of multiplex serological and antibody neutralization assays that can simultaneously measure neutralizing IgG and IgM antibodies for SARS-CoV-2.

멀티플렉스 비드 기반 유량 분석 시스템을 위한 신속한 멀티플렉스 듀얼 리포터 IgG 및 IgM SARS-CoV-2 중화 분석

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

생물학

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that enable sensitive and simultaneous labeling of viral nucleic acid and protein. Conventional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) methods are often not compatible with immunostaining. We have therefore developed an imaging approach, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), which enables simultaneous single-cell visualization of DNA, RNA, and protein. Compared to conventional DNA FISH, MICDDRP utilizes branched DNA (bDNA) ISH technology, which dramatically improves oligonucleotide probe sensitivity and detection. Small modifications of MICDDRP enable imaging of viral proteins concomitantly with nucleic acids (RNA or DNA) of different strandedness. We have applied these protocols to study the life cycles of multiple viral pathogens, including human immunodeficiency virus (HIV)-1, human T-lymphotropic virus (HTLV)-1, hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), Zika virus (ZKV), and influenza A virus (IAV). We demonstrated that we can efficiently label viral nucleic acids and proteins across a diverse range of viruses. These studies can provide us with improved mechanistic understanding of multiple viral systems, and in addition, serve as a template for application of multiplexed fluorescence imaging of DNA, RNA, and protein across a broad spectrum of cellular systems.

Presented here is a protocol for a fluorescence imaging approach, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), a method capable of simultaneous fluorescence single-cell visualization of viral protein and nucleic acids of different type and strandedness. This approach can be applied to a diverse range of systems.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...