Name: a multi-detection assay for malaria transmitting mosquitoes
Uploaded: 2015-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
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우리는 박사 감사합니다. 탄자니아에서 모기 표본을 제공 글래스고 대학의 UC 데이비스 박사 카타리나 Kreppel에서 앤서니 코르 넬과 로라 노리스. 우리는 잠비아에서 모기 샘플을 공유하기 위해 공중 보건의 존스 홉킨스 대학원에서 양 Smita 다스 박사 더글러스 노리스 감사합니다. 우리는 또한 분석 디자인 교육에 대한 동물 유전학 연구소 이씨 V. 밀론 감사합니다. 이 작품은 R01AI 078183과 R21AI062929을 부여 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. PCR 증폭 <ol><li> 1.5 ㎖ 마이크로 튜브의 모든 PCR 프라이머를 (보충 테이블 S1 참조) 섞는다. 각각의 SNP는 두 개의 프라이머 (순방향 및 역방향)가 있습니다. 각 PCR 프라이머의 주식 농도를 100 μM로 유지되어 있는지 확인합니다. (보충 표 S2 참조) 벤치에서 오류와 시간을 피펫 팅 줄이기 위해 500 ~ 1,000 반응에 대한 충분한 프라이머 믹스를 확인합니다. 원하는 경우, -20 ° C에서 튜브 및 상점 당 100 ~ 200 반응의 분량을 준비합니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜 (표 1)에 설명 된대로 PCR 칵테일을 준비합니다. 96 반응의 부피는 20 %의 돌출부를 포함한다. 소용돌이 2,000 x g에서 30 초간 가볍게 PCR의 칵테일을 함유하는 원심 분리기 튜브. </li><li> 각각의 우물에 PCR 칵테일 3 μl를 96 웰 플레이트에 분주 비 스커트. 리피터 피펫은이 프로세스에 대해 시간을 절약 할 수 있습니다. </li><li> 각 웰에 모기의 적절한 게놈 DNA의 2 μl를 추가합니다. 주 : m으로부터 게놈 DNA를 얻는 공정<html> osquito 조직 (머리 / 흉부, 복부 또는 전신)는 다른 문헌 29 ~ 32에 설명되어 있습니다. (머리 / 흉부에 말라리아를) 감염 모기의 혈액 (복부)에서 말라리아와 사람들을 구별하기 위해 적절한 DNA 추출 프로토콜을 선택합니다. 우리는 일반적으로 모기의 신체 부위 (머리 / 흉부 또는 복부)에서 추출 된 DNA를 사용하므로 DNA 농도는 0.05-2ng / μL에 따라 다릅니다. 총 DNA 입력이 제조업체의 권장 사항 (5-10ng / RXN)보다 낮지 만, 우리는 일반적으로 강력한 SNP가 전체 게놈 증폭없이 DNA 샘플의 98 %에서 호출 얻을. </li><li> 370 x g에서 1 분간 혼합 또는 소용돌이, 원심 분리기 부드럽게, 플레이트를 밀봉합니다. </li><li> PCR 증폭을 수행하기 위해 다음과 같은 열 순환기 프로토콜을 사용한다 : (1) 94 ° C 2 분 동안, (2) 94 ° C 30 초, (3) 1 분 30 초 동안 56 ° C, (4) 72 ° C (5) 단계를 반복합니다 (2) - (4) 45 사이클, (6) 1 분, 4 ℃로 유지 72 ° C. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. SAP 치료 <ol><li> 96 웰 플레이트에서 SAP 효소 용액을 제조 하였다 (표 2 참조). 접시에 96 샘플을 처리합니다. 96 반응의 부피는 20 %의 돌출부를 포함한다. </li><li> 소용돌이 2,000 × g으로 30 초 동안 SAP 효소 가볍게 솔루션과 원심 분리기 튜브. 각 웰에 SAP 효소 용액 2 μl를 분주한다. 다시 말하지만, 리피터 피펫은이 프로세스에 대해 시간을 절약 할 수 있습니다. </li><li> 370 x g에서 1 분간 혼합 또는 소용돌이, 원심 분리기 부드럽게, 플레이트를 밀봉합니다. 40 분 (1) 37 ° C, (2) 85 ° C를 5 분 동안 효소를 불 활성화 (3) 4 ° C를 유지, 다음과 같이 판을 품어. 이 단계의 완료시 계속하기 전에 -20 ° C에서 접시를 저장합니다. 이주 내에 저장 판을 처리합니다. </li></ol> 3. SNP 확장 <ol><li> 샘플 플레이트 SAP 처리 후에 고정되는 경우, 진행하기 전에 실온으로 해동 할 수있다. </li><li> 확장 프라이머 믹스 (보충 표 S2)를 준비합니다. 각각의 SNP는 하나의 엑스 테가nsion 프라이머. 500 μM에서 각 확장 프라이머의 주식 농도를 유지합니다. 선택적으로, -20 ° C에서 튜브 및 매장 당 100 ~ 200 반응에 나누어지는. </li><li> 96 반응 부피가 20 %의 돌출부를 포함 표 3에 기술 된 바와 같이 확장 믹스를 준비한다. </li><li> 소용돌이 2,000 × g으로 30 초 동안 연장 가볍게 칵테일과 원심 분리기 튜브. 각 웰에 확장 칵테일 2 μl를 분배. 다시 말하지만, 리피터 피펫은이 프로세스에 대해 시간을 절약 할 수 있습니다. </li><li> 370 x g에서 1 분간 혼합 또는 소용돌이, 원심 분리기 부드럽게, 플레이트를 밀봉합니다. 도 1에 도시 된 바와 같이 열 순환 플레이트. 이때, 질량 분석을 진행 또는 이주에 -20 ° C에서 최대 플레이트를 저장한다. </li></ol> 4. 컨디셔닝 SNP 확장 제품 질량 분석기 분석을 최적화하는 <ol><li> 샘플 플레이트 SNP 확장 후에 특히 동결이 진행하기 전에 실온으로 해동 할 수있다. </li><li> 그 접점에서 수지의 15 mg을 이동연장 된 스푼을 사용하여 딤플 접시에 INER. 딤플 판의 우물에 수지를 확산 스크레이퍼를 사용합니다. 수지를 확산 딤플 접시에 걸쳐 좌우로 스크레이퍼 스윕. 수지는 각 웰에가 있는지 확인합니다. </li><li> 스크레이퍼를 사용하여 딤플의 접시를 초과하는 수지를 쳤어요. 수지가 적어도 20 분 동안 플레이트 딤플 스탠드하자. 수지, 딤플 플레이트에 서 샘플 플레이트의 각 웰에 HPLC 등급의 물을 41 μL를 추가시키는있다. </li><li> 조심스럽게 딤플 판에 샘플 판 거꾸로 놓으십시오. 딤플 판의 우물 시료 판의 우물을 정렬 딤플 판의 작은 둥근 게시물에 대한 샘플 판 재설정해야합니다. </li><li> 수지는 샘플 플레이트의 우물에 딤플 판에서 쓰러 함께 샘플 플레이트와 딤플 판을 잡고 천천히을 뒤집어. 수지는 샘플 플레이트에 빠지고 있도록 딤플 판을 누릅니다. 디에 있는지 모든 수지 확인mple 플레이트는 샘플 판 우물에 빠지고. 30 초 동안 3,200 XG에서 접시를 원심 분리기. </li><li> RT에서 5 분 동안 회전에서 샘플 판을 돌립니다. 로테이터는 샘플 판을 장축을 약 360도 회전한다. </li><li> 5 분 동안 3,200 XG에서 샘플 판을 원심 분리기. 이 단계 후에, 다음 단계로 진행하기 전에 이주 -20 ° C에서 샘플 플레이트를 저장한다. </li></ol> 5. MALDI-TOF 질량 분석 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 같은 SpectroCHIP로 bioarray에 조절 된 SNP 확장 제품을 전송합니다. 우리는이 단계 MassArray Nanodispenser를 사용합니다. </li><li> 전송이 완료되면, 분석 및 플레이트가 분석 데이터베이스에 설정되는 방법을 정의한다. 각각의 판은, 특정 분석 설계 (보충 표 S3)에 링크 고유 식별자를 갖도록 분석과 판의 이름을 지정합니다. </li><li> 분석 접시가 정의 된 후, 질량 분석계를 사용하여 스펙트럼을 획득. </li></ol><ol><li> 이러한 타이 퍼 분석기 나 TyperViewer (Sequenom)로서 실시간 PCR 분석 데이터 해석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행한다. 각 웰에 대한 샘플 레이아웃, 질량 스펙트로 포함 .XML 형식으로 데이터를 구하는, 이름을 포함 마커 정보, 대응하는 SNP의 각 변이체에 대한 예상 질량, 및 오류 또는 각각의 반응과 관련된 경고 메시지. 결과 질량 스펙트로 그램 그림 2를 참조하십시오. </li><li> . 각 유전자형 허용 공차 / 차이 (잡음비 크기 또는 신호) 검출 임계 값을 설정하여 SNP 유전자형 클러스터링 분석을 수행 3 04707-KDR # 2 SNP 유전자형 클러스터의 예를 보여준다. </li><li> 스프레드 시트 프로그램에 결과 SNP 유전자형 호출을 보냅니다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

- 비행 (MALDI-TOF) 질량 분석 33-37 시간 PCR 증폭, 새우 알칼리 포스 파타 아제 (SAP) 반응, SNP 확장, 확장 제품 에어컨, 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 : MDA는 5 개의 주요 단계로 구성되어있다. 첫 번째 PCR 증폭 단계는 충분한 주형 DNA가 SNP 확장 단계에서 사용할 수 있도록 각각의 SNP를 측면에서는 DNA를 증폭한다. SAP 반응은 다음과 SNP 확장 단계를 방해 할 수있는 사용하지 않은 dNTPs를 중화. ...

학질 모기의 arabiensis, 학질 모기의 coluzzii 아노 펠 레스 gambiae 아프리카 1 말라리아 전송을 담당하는 주요 벡터입니다. 이 세 종은 형태 학적으로 2 구별 만 분자 분석 3-9으로 구별 할 수있다. 또한, 정기적으로 역학 및 인구 유전학 연구를 지원하기 위해 실시 많은 다운 스트림 분석이있다. 이들은 분화 섬 10-12 (1) 유전자형 분석, (2) 아미노산 코돈 파라 유전자의 위치 번째 1014 비 동의어 SNP를 인식 유전자형 분석 (녹다운 저항 또는 KDR, SNP) (13)를 포함 -18, (3) 기생충 검출 PCR 19-23, 모기 midguts 24, 25에서 호스트 별 DNA (4) 검사. 우리의 목표와 하나의 멀티 플렉스 반응으로 모든 분석을 결합한 다중 탐지 분석 (MDA)을 개발아프리카에서 말라리아 벡터의 역학적으로 중요한 특성을 alyzing. MDA 분석 여러 (1) 종을 검출하기위한 마커 (A.의 arabiensis, A.의 gambiae, A.의 coluzzii, 또는 3 개)의 기타 (없음) KDR의 SNP로 표현, (2) 살충제 저항을 포함 (L1014F 및 L1014S 모두) 두 가지 주요 말라리아 기생충, (3)의 존재, 말라리아 원충 및 P. 삼일 열, 하나의 조류와 여섯 포유류 호스트에서 (4) 혈액 소스. 전통적으로, 이러한 분석은 분리 된 중합 효소 연쇄 반응을 수행 하였다. 이러한 모든 분석은 종래의 PCR 플랫폼을 사용을 완료하면, 그것은 8-10 PCR 반응 분석을 수행하고 전기 영동 단계를 수반하는 요구한다. 여기에 제시된 MDA 방식은 전체에서 약 5 시간 소요하면서 문서화 결과에 준비에서 각 PCR 반응은, 4 ~ 5 시간이 걸립니다. 이 단독으로 노동 비용을 90 % 절감하는 것과 같습니다. MDA는 여기에 제시된 5 달러 비용샘플 당 모두 33 개의 SNP 유전자형합니다. 이것은 상당히 저렴 샘플 당 약 $ 1.50의 요금으로 하나의 아가 로스 젤 기반 분석,보다. MDA 의해 덮여 모든 특성을 검출 분석은 샘플 당 $ 12-15의 비용 8-10 별도 아가 로스 겔 - 기재 분석법의 최소 필요하다. 또한, MDA 크게 각 기생충 또는 호스트 소스 검출에 대해 적어도 3 개의 마커를 이용하여, 거짓 포지티브 또는 네거티브의 발생 가능성을 감소시킨다. 우리가 활용 플랫폼은 말라리아 벡터에 한정되지 않고, 의약, 수의학, 및 기초 생물학 26-28 같은 다양한 애플리케이션에 사용될 수있다. 심층 많은 샘플 (100 단위의 순서) 번호를 포함하는 관련 연구 또는 집단 유전학 연구는 동시에 여러 마커에 대한 비용 효과 분석 검사를 필요로한다. 둘 이상의 별개 PCR 분석법을 이용하는 대부분의 연구는 더 낮은 비용으로 더 빠른 결과를 위해 MDA를 구현할 수있다. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>MassARRAY Analyzer Compact</td><td>Sequenom</td><td>MT9</td><td>MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.</td></tr><tr><td>MassARRAY Nanodispenser</td><td>Sequenom</td><td>RS1000</td><td>Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP</td></tr><tr><td>iPLEX Gold Genotyping Reagent Set</td><td>Sequenom</td><td>10158</td><td>Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.</td></tr></tbody></table>

a multi-detection assay for malaria transmitting mosquitoes

과 아노 펠 레스 gambiae 종 단지는 아프리카에서 모기를 전송하는 주요 말라리아가 포함되어 있습니다. 이들 종은 의료 중요하기 때문에, 여러 가지 특성은 전형적 역학 연구에 도움 분자 분석법을 이용하여 특성화된다. 이러한 특성은 종 식별, 살충제 저항, 기생충 감염 상태, 호스트 환경 설정을 포함한다. 과 아노 펠 레스 gambiae 복합체의 형태 학적 집단 구별하기 때문에, 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 전통적 종을 식별하는 데 사용된다. 종이 알려지면, 여러 하위 분석은 정기적으로 추가 특성을 규명하기 위해 수행된다. 예를 들어, 파라 유전자 KDR이라고도 돌연변이는 DDT 및 피레스 로이드 계 살충제에 대해 내성을 부여. 또한, 효소 면역 분석법 (ELISA를) 또는 변형체 기생충 DNA 검출 PCR 분석법 모기 조직 기생충 존재를 검출하기 위해 사용된다. 마지막으로, combinatioPCR과 제한 효소 다이제스트의 N은 호스트 별 DNA의 모기 bloodmeal을 선별하여 호스트 환경 설정 (예를 들어, 동물의 혈액 대 인간) 규명하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 96 시간에 384 샘플에 대해 단일 ​​멀티 플렉스 반응 유전자형 33SNPs으로 상기 분석을 모두 겸비한 다중 검출법 (MDA)을 개발 하였다. MDA 종, 말라리아 검출 및 호스트 혈액 식별을위한 여러 마커를 포함하기 때문에, 오탐 (false positive) 또는 네거티브를 생성하는 가능성은 크게 특성 당 하나의 마커를 포함 이전 분석에서 감소한다. 이 강력하고 간단한 분석은 비용 효율적으로 기존 분석의 시간의 틈새에서 이러한 주요 모기의 특성을 감지 할 수 있습니다.

종 식별 : 샘플이 세 종 중 하나가 아닌 경우 다음과 같은 5 개의 SNP 함께. 세 가지의 SNP (01073-213, 04679-157과 10,313 세 종 (A.의 arabiensis, A.의 coluzzii와 A.의 gambiae) (표 4)를 식별 -052)는 증폭 실패합니다. 살충제 저항을 추론하기위한 KDR 유전자형 : 파라 전압 관문 나트륨 채널의 1014 번째 ?...

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A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

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13.1K 조회수.  School of Veterinary Medicine, University of California - Davis. Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

연구

면역학 및 감염병학

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito.    This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed.  The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

모기와 감염 표현형 결정에서 Plasmodium falciparum 감염에 대한 프로토콜

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

생물학

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different downstream patient-to-patient transmission potentials, and require very different patient treatments. Thus, recent Zika outbreaks make it urgent to develop tools that rapidly discriminate these viruses in patients and trapped mosquitoes, to select the correct patient treatment, and to understand and manage their epidemiology in real time.
Unfortunately, current diagnostic tests, including those receiving 2016 emergency use authorizations and fast-track status, detect viral RNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which requires instrumentation, trained users, and considerable sample preparation. Thus, they must be sent to &#34;approved&#34; reference laboratories, requiring time. Indeed, in August 2016, the Center for Disease Control (CDC) was asking pregnant women who had been bitten by a mosquito and developed a Zika-indicating rash to wait an unacceptable 2 to 4 weeks before learning whether they were infected. We very much need tests that can be done on site, with few resources, and by trained but not necessarily licensed personnel.
This video demonstrates an assay that meets these specifications, working with urine or serum (for patients) or crushed mosquito carcasses (for environmental surveillance), all without much sample preparation. Mosquito carcasses are captured on paper carrying quaternary ammonium groups (Q-paper) followed by ammonia treatment to manage biohazards. These are then directly, without RNA isolation, put into assay tubes containing freeze-dried reagents that need no chain of refrigeration. A modified form of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with target-specific fluorescently tagged displaceable probes produces readout, in 30 min, as a three-color fluorescence signal. This is visualized with a handheld, battery-powered device with an orange filter. Forward contamination is prevented with sealed tubes, and the use of thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in the presence of dUTP in the amplification mixture.

Current multiplexed diagnostics to detect Zika, chikungunya, and dengue viruses require complex sample preparation and expensive instrumentation, and are difficult to use in low resource environments. We show a diagnostic that uses isothermal amplification with target-specific strand displaceable probes to detect and differentiate these viruses with high sensitivity and specificity.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

생화학

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) spectrometer in conjunction with Multivariate Data Analysis (MVDA). 3D7 P. falciparum were cultured to 10% parasitemia ring stage parasites and used to spike fresh donor isolated RBCs to create a dilution series between 0&#8211;1%. 10 &#181;L of each sample were placed onto the center of the ATR diamond window to acquire the spectrum. The sample data was treated to improve the signal to noise ratio and to remove the contribution of water, and then the second derivative was applied to resolve spectral features. The data were then analyzed using two types of MVDA: first Principal Component Analysis (PCA) to determine any outliers and then Partial Least Squares Regression (PLS-R) to build the quantification model.

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

Here, we present a protocol for the detection and quantification of Plasmodium falciparum in infected aqueous red blood cells using an attenuated total reflection infrared spectrometer and multivariate data analysis.

검색 및 변형 체 falciparum 에 수성 적혈구 총 반사 적외선 분광학 감쇠 및 복수 데이터 분석의 정량화

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

화학

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA sequence variation on a large scale. Specifically, detecting insertions and deletions (indels) at gene-edited sites generated by CRISPR guide RNA (gRNA)/Cas9-mediated non-homologous end-joining (NHEJ) is important for assessing the fidelity of the mutagenesis and the frequency of unintended changes. We describe here a protocol for digital-droplet PCR (ddPCR) that is well-suited for high-throughput NHEJ analysis. While this method does not produce data that identifies individual sequence variation, it provides a quantitative estimate of the sequence variation within a population. Additionally, with appropriate resources, this protocol can be implemented in a field-site laboratory setting more easily than next-generation or Sanger sequencing. ddPCR also has a faster turn-around time for results than either of those methods, which allows a more quick and complete analysis of genetic variation in wild populations during field trials of genetically-engineered organisms.

This protocol provides the steps from DNA extraction to experimental set-up for digital droplet PCR (ddPCR), including analysis for the identification and quantification of non-homologous end-joining (NHEJ) events at target sites following gRNA-induced Cas9 cleavage and DNA repair. Other uses of this method include applications such as polymorphism detection and gene-editing variant verification.

유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

유전학

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been accompanied by increased genomic information about Plasmodium parasite species responsible for malaria, including characteristics of geographical populations as well as variations associated with reduced susceptibility to anti-malarial drugs.
One common genetic variation, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), offers attractive targets for parasite genotyping. These markers are useful not only for tracking drug resistance markers but also for tracking parasite populations using markers not under drug or other selective pressures.
SNP genotyping methods offer the ability to track drug resistance as well as to fingerprint individual parasites for population surveillance, particularly in response to malaria control efforts in regions nearing elimination status.
While informative SNPs have been identified that are agnostic to specific genotyping technologies, high-resolution melting (HRM) analysis is particularly suited to field-based studies. Compared to standard fluorescent-probe based methods that require individual SNPs in a single labeled probe and offer at best 10% sensitivity to detect SNPs in samples that contain multiple genomes (polygenomic), HRM offers 2-5% sensitivity. Modifications to HRM, such as blocked probes and asymmetric primer concentrations as well as optimization of amplification annealing temperatures to bias PCR towards amplification of the minor allele, further increase the sensitivity of HRM. While the sensitivity improvement depends on the specific assay, we have increased detection sensitivities to less than 1% of the minor allele.
In regions approaching malaria eradication, early detection of emerging or imported drug resistance is essential for prompt response. Similarly, the ability to detect polygenomic infections and differentiate imported parasite types from cryptic local reservoirs can inform control programs.
This manuscript describes modifications to high resolution melting technology that further increase its sensitivity to identify polygenomic infections in patient samples.

While high resolution melting analysis offers the ability to differentiate between single nucleotide polymorphisms in a heterogeneous population, mutant allele amplification bias can increase its ability to detect alleles present at relatively low percentages within a sample. This protocol describes improvements that improve the sensitivity of high resolution melting analysis.

방법은 말라리아에 단일 염기 다형성 유전자형 녹는 고해상도의 감도를 증가

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Anopheles 모기 벡터에서 플라스모듐 팔시파룸 감염 검출을 위한 표준 막 공급 분석

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.