이 작품은 교육과 연구, 프로젝트 MorphiQuant-3 차원에 대 한 독일 연방 내각에서 그랜트 FKZ 13GW0044에 의해 지원 되었다. 기술 지원에 감사 Carolin Bartels 하 고.

<ol>
	<li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+third+dimension:+Volume+electron+microscopy+comes+of+age.">Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li><li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience.">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience.</a> J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography.">Array tomography.</a> J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).</li><li>Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Lucas, M. S., G&#252;nthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+Microscopes:+3D+Correlative+Light+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Complex+Biological+Structures.">Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures.</a> Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).</li><li>De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopy:+ultrasructure+lights+up!.">Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up!.</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li><li>Verkade, P., M&#252;ller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III. 140, 1-352 (2017).</li><li>Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescing+the+Electron:+Strategies+in+Correlative+Experimental+Design.">Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design.</a> Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).</li><li>Wacker, I., Schr&#246;der, R. R., Schroeder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+goes+3D:+Exploring+the+potential+of+array+tomography+versus+FIB+nanotomography+for+a+CADASIL+sample.">Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample.</a> Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).</li><li>Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schr&#246;der, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+imaging:+a+new+concept+for+targeted+imaging+of+large+volumes+from+cells+to+tissues.">Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues.</a> BMC Cell Biol. 17 (1), 38 (2016).</li><li>Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Front Neural Circuits. 8, (2014).</li><li>Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+Production+of+Arrays.">Array Tomography: Production of Arrays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).</li><li>Fahrenbach, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+serial+thin+sectioning+for+electron+microscopy.">Continuous serial thin sectioning for electron microscopy.</a> J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).</li><li>Harris, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+serial+sectioning+for+transmission+electron+microscopy.">Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy.</a> J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), e38011 (2012).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+Tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li></ol>

키트는 기판 홀더의 기능 모델의 공급에 대 한 Boeckeler 계기에 의해 환급 받았다. 마 탈 러 ZEISS 현미경 GmbH,이 문서에 언급 된 현미경 시스템의 제조 업체의 직원입니다. 또한, ZEISS ZEISS 아틀라스 솔루션 패키지 다양 한 현미경과 거짓말-sem의 악기에 대 한 큰 영역, 3D 이미징 응용 프로그램에 대 한 특정 솔루션을 제공합니다. 다른 모든 저자를 사용 없다 공개 수 있습니다.

대상 멀티 모달 계층에 의해 조직 내에서 특정 셀에 대 한 워크플로 시연 했다: 수 지에 포함 된 샘플 사용자 정의 설계 기판 소유자를 사용 하 여 전도성 기판에 배치 되는 직렬 섹션의 배열로 나누기입니다. fluorophore로 후는 FLM에서 이미징, 재건된 볼륨 대상 셀을 선택 하는 데 사용 됩니다. 후 추가 얼룩 대비 소개 중 금속 라운드, 이러한 목표는 SEM는 자동화 된 소프트웨어 플랫폼을 사용 하 여 나노 스케일 해상도에서 몇 백 섹션에 몇 군데는.
생산 몇 가지 긴 리본을 조밀 하 게 포장된 배열, 기판 홀더 여기에 설명 된 것과 비슷한가 필요 합니다. 유능 하 고 환자 사람 연결 하 여러 리본 실리콘 기판, 반 칼 보트에 열 중 하 고 리본 기판에 앉아있을 때까지 점차적으로 수 위를 낮추는 방법으로 배열을 검색할 수 있습니다. 그러나,에 있는 우리의 경험, 기판은 칼 보트 (1.3.2 프로토콜에서에서 참조 참고)의 어떤 부분을 만질 때 형성을 무 너 뜨 리는 경향이 있다. 또한,이 절차는 훨씬 더 어려운 ITO 코팅 기판: (1) 때문에 이토 유리의 투명도, 그것 보고 어렵습니다 물의 가장자리 리본 끝; 첨부 해야 (2) ITO 코팅 표면 고광택된 실리콘 웨이퍼 보다 훨씬 거칠어 있기 때문에, 리본 리프트- 작은 조각 몇 가지 섹션으로 구성 된 플 로트 수 있습니다, 따라서 섹션의 순서를 파괴 하는 동안 휴식 하는 경향이.
전체 워크플로 FLM 데이터에 상관 없이 가능한 이기도합니다. 이 경우에, sem에서 데이터 컬렉션 여러 세션에서 할 수 있습니다. 초기 3D 재구성 또는 적어도 낮은 또는 중간 해상도 데이터의 평가 대상 식별 해야 할 수 있습니다. 또한, 기존의 조직학 얼룩 명시 LM에 대 한 (안 필요한 FLM)을 적용할 수 있습니다. 물론, 다른 옵션6,7,8 은18에 초기 논문에서 이미 시연으로 배열에 라벨 또는 유전자 형광 성 단백질 (XFPs) 인코딩 또는 미리 라벨을 포함 하는 항 체 와 샘플 준비 중 형광의 보전.
설명한 방법의 일반적인 제한은 특정 두께의 섹션 및 3D 볼륨의 결과 개별 샘플링을 사용 하 여: SEM 섹션 표면 (d에서에서 유일한 데이터 수집 이후 Z 해상도 섹션의 두께 만큼 좋은 수 선택 기본 에너지/방문 에너지에 epending). 이 결과 3D 볼륨 이방성 복, 예를 들어있다는 뜻., 100 nm3 경우 100 x 5 x 5 nm 섹션과 이미지 픽셀 크기가 5 nm 사용 됩니다. 1 µ m 아래 크기 범위에서 아주 작은 요소,이 대 한 진정한 ultrastructural 충분 한 않을 수 있습니다. 더 기술적인 한계 이미징 자동 SEM에서 사용 하는 무대의 정확도 이다. 이 때문에, 전체 대상 지역 몇 군데 되도록 무대 정확도의 규격 보다 더 큰 ROI를 선택할 필요가 있다.
블록-얼굴 이미징 방법 SBF SEM과 거짓말-sem의에 비해, 상호에 위에서 설명한 대로 이방성 복의 결정적인 단점이 있다. 거짓말-SEM, 5 nm3 x 5 x 5의 등방성 복 적절 한 드리프트 보정 장소에 있을 때 얻을 수 있습니다.
배열의 준비 하는 동안 섹션의 손실로 인해 재건 볼륨에서 간격 SBF SEM와 거짓말-SEM. 발생 하지 문제가 있을 접착제에 의해 좋은 리본 안정화, 일반적으로 이것이 리본의 마지막 부분에 대 한 문제: 나이프는 속눈썹을 사용 하 여에서 그것을 풀어 놓을 때 손상 될 수 있습니다. 그러나, 우리의 경험의 모든 20-50 단원의 한 부분 손실 않습니다 하지 영향 이미지 등록.
다른 한편으로, 배열 후 얼룩 가능성 좋은 신호 및 SEM 이미징, 여기에 표시 된 루트 팁 냉동 고압 등 약하게 금속된 샘플에도 대비 수 여. 따라서, 수많은 화학 고정 및 금속 단계에 의해 최적의 ultrastructural 보존 타협을 필요는 없습니다. 또한, 중간 정도의 경화와 병 리 실험실에서 일상적인 샘플 우수한 데이터10제공합니다. 일반적으로 이러한 포스트 포함 대비 향상 SBF SEM과 거짓말-sem의 대 한 불가능 하다. 또한, 이러한 메서드는 파괴 하 고, 이후 즉, 이미징, 계층적 다른 해상도 및 사이트에서 이미징 또는 시간에서 나중에 지점에서 반복된 이미징 동안 샘플 사용 불가능 합니다. 원칙적으로, 무제한 볼륨, 큰 FOVs (예를 들어, connectomics에서 전체 마우스 두뇌에 대 한 여러 밀리미터까지)으로 구성 된 모자이크, 바느질에 의해 만들어지고 섹션의 거 대 한 숫자에 거짓말-SEM, 100 µ m x 100 µ m 넘어 FOVs에에서 의해 취득 될 수 있다 일상적인 악기와 함께 달성 하기 어렵다입니다.
SBF SEM과 거짓말-sem의 위에서 언급 한 방법 모두 단면화 및 완전 자동화 된 방식으로 같은 악기 내 이미징 수행 이후 설명에 워크플로 추가 자동화 확실 한 장점 것입니다. 단면 자동화의 한 종류 존재: Kapton 테이프를 사용 하 여 기판 등으로 배열 한 FLM에서 이미지 어렵다 하지만 The ATUMtome12 생성 하 고 수집 섹션의 수천 수 있습니다. 여기에 사용 되는 ITO 코팅 coverslips에 최고 해상도 영상 가능 해야 합니다. 자동화에 대 한 추가, 매우 바람직한 대상 FLM 데이터 스택 기록 될 것 이다. 다른 한편으로, 자동화 비쌀 수 있다 고 기판 홀더를 제외 하면 여기에 제시 된 워크플로 조건 (하드웨어)만 계측 일상적인 EM 실험실 또는 핵심 시설, 낮은 만들기에서 일반적으로 사용할 수 있는 액세스 수준.

조직 ultrastructural 해상도 큰 볼륨을 재구성을 위해 SEM에 따라 다른 이미징 방식의 번호 사용된1되었습니다: 포괄적인 리뷰는 사용할 수 있는 예., SBF SEM2, 거짓말-sem의3및 배열에 대 한 (에서)4의 tomography 후자의 방법 샘플 자료는 다양 한 기판에 직렬 섹션으로 유지 되지만, SBF SEM과 거짓말-sem의 파괴적인 방법이 있습니다, 샘플 블록에 노력 하 고 이미징 동안 그것을 사용. SEM에 수 지의 충전 때문에 그들은 또한 강력 하 게 금속된 샘플 블록5에 따라 다릅니다.
다른 한편으로, 특정 세포 또는 조직 샘플 내 관심의 구조 식별 특히 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인)6,,78에서 이익 수 있습니다. FLM을 사용 하 여 대상에 대 한 걸이 형광 신호9를 끄다 것 때문에 많은 양의 중 금속의 응용 프로그램을 하겠습니다. 이러한만 약간 금속된 샘플에 대 한에 배열 될 수 있습니다 쉽게 후 무거운 금속으로 얼룩진 LM 이미징 후 이후 선택 방법입니다. 또한, 샘플의 거의 모든 종류에서 사용할 수 있습니다, 그리고 심지어 일상적인 샘플의 병리학에서 보물 가슴10.
또 다른 큰 장점은 계층적11 또는 다중 해상도 이미지12에 대 한 잠재력은: 모든 고해상도 이미지를 필요는 없습니다, 목표는 다른 형식 (예를 들어, FLM) 또는 선택할 수 있습니다 저해상도 SEM 이미지입니다. 만 재미 있는 지역 조직 또는 세포 인구에서 고해상도의 이미징 디지털 데이터 저장 공간을 절약 하 고 쉽게 처리 하는 작은 이미지 데이터 세트를 생성. 여기, AT 워크플로 오히려 약하게 금속된 샘플을 사용 하 여 설명 된다: 식물의 뿌리 (애기 thaliana) 냉동 고압 친수성 수 지에 포함 된.
배열 준비, 스테인드, 그리고 FLM에 SEM, 몇 군데 고 이미지 스택을 등록 하는 방법을 설명 합니다. 또한, FLM 볼륨의 3D 개조를 사용 하 여 나노 해상도 sem 이미징에 대 한 특정 셀을 선택 하는 방법을 보여 줍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>RMC</td>
			<td>PT-PC</td>
			<td>Alternative: Leica UC7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate holder</td>
			<td>RMC</td>
			<td>ASH-100</td>
			<td>Alternative: home built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Zepto 40kHz</td>
			<td>Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner 
			Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield fluorescence light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer.Z1</td>
			<td>Alternatives: 
			Leica, Nikon, Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter set</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>43 HE (Cy3/DsRed)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Neofluar 40x</td>
			<td>&#160;0.75 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decent workstation able to handle GB-sized image data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FESEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Ultra 55&#160;</td>
			<td>Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T585-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 45&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming 90&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DTB90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumbo diamond knife for sectioning</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DUJ3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (pieces)</td>
			<td>Si-Mat</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>Doping: P/Bor, orientation: &#60;100&#62;, thickness: 525 &#177; 25 &#181;m, resistivity: 1-30 &#937;-cm 
			http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO-coated coverslips</td>
			<td>Balzers</td>
			<td>Type Z</td>
			<td>22 &#215; 22 &#215; 0.17 mm 
			https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium carrier</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>76 &#215; 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer forceps</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>34A.SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0103-2E1/2-PO-1</td>
			<td>Dumoxel-H 2E 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond scriber</td>
			<td>Plano</td>
			<td>T5448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash/very soft cat&#39;s hair&#160;</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td>Alternative: Plano</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>Selfmade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattex contact adhesive</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PCL3C</td>
			<td>Kraftkleber Classic (the yellowish one)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixogum</td>
			<td>Marabu</td>
			<td>290110001</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>851</td>
			<td>for fixing substrate to carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>07029.4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4436</td>
			<td>thinner for glue mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotihistol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6640</td>
			<td>alternative, limonene based thinner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas 5 AT 
			(module for Zeiss SEM)</td>
			<td>Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidiumiodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranylacetate</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) Nitrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaOH solution</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>01030.3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Duran</td>
			<td>23 755 56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stubs</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon pads</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper tape</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3397</td>
			<td>double-sided adhesive, conductive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver paint</td>
			<td>Plano</td>
			<td>G3692</td>
			<td>Acheson Elektrodag 1415M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions/mixtures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive mixture for coating blocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. 
			(Alternative for xylene: Rotihistol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds lead citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL: 
			Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. 
			Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. 
			Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. 
			Fill up with dH2O to 50 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide staining solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. 
			Vortex for adequate mixing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous uranyl acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes

혼합된 셀 인구 또는 조직 내에서 ultrastructural 해상도에서 특정 셀을 대상으로 하는 것은 계층적 이미징 빛과 전자 현미경의 조합을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 수 지에 포함 된 샘플 배열 ultrathin 섹션의 수백의 리본 메뉴의 구성으로 구분 되며, 실리콘 웨이퍼 또는 導 코팅된 coverslips의 조각에. 어레이 낮은 해상도 fluorophores 후 스마트폰 카메라 또는 급속 한 큰 지역 개요에 대 한 가벼운 현미경 (LM) 또는 넓은 분야 형광 현미경 (형광 가벼운 현미경 검사 법 (FLM)) 같은 디지털 소비자를 사용 하 여 몇 군데. 중 금속으로 얼룩 후, 후 배열 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 몇 군데는. 대상 선택 FLM에 의해 생성 된 3 차원 복원 또는 아무 형광 마커를 사용할 수 있는 경우 중간 해상도 SEM 이미지 스택에서 만든 3D 개조에서 가능 하다. Ultrastructural 분석에 대 한 선택된 대상 마지막으로 고해상도에서 SEM에 기록 됩니다 (몇 나노미터 이미지 픽셀). 리본 처리 도구 어떤 ultramicrotome에 개조 될 수 있는 시연입니다. 그것은 배열 생산 및 단면 칼 보트에서 기판 제거와 함께 도움이 됩니다. Sem에서의 배열 자동된 이미징 허용 하는 소프트웨어 플랫폼을 설명 합니다. 직렬 블록-얼굴 SEM (SBF-SEM) 집중 된 이온 빔 SEM (거짓말-SEM) 등의 큰 볼륨 그들 데이터를 생성 하는 다른 방법에 비해이 방법은 두 가지 주요 이점이 있다: (1) 수 지에 포함 된 샘플은 보존, 이기는 하지만 썬 업 버전. 그것은 다른 방법으로 얼룩진 고 다른 해상도로 촬영 될 수 있습니다. (2)로 섹션 후 얼룩이 질 수 있다, sem의 이미징에 대 한 대비를 소개 하는 조직 블록 전도성 렌더링 중 금속으로 샘플 강하게 블록 스테인드를 사용 하 여 필요는 없습니다. 이것은 메서드를 사용 하면 다양 한 재료와 생물학 질문에 적용할 수 있습니다. 특히 사용된 자료 예를 들어, 생 은행 및 병 리 실험실에서 수 있습니다 직접 포함 되며 3d에서 재구성.

워크플로 수 지 블록에 포함 된 샘플 (그림 1) 시작을 여기 설명 합니다. 샘플 준비 하는 동안 일부 중 금속은 조직에 도입 되어야 하지만 그것은 오히려 강한 금속에 대 한 최적화 된 프로토콜을 사용 하 여 필요가 없습니다. 그림 1A (유채과 야채) 블록-스테인드 통상 1% OsO4 와 1 %uranyl 아세테이트, 그림 1B 에서 애기 루트는 약하게만 메탈 0.5 %uranyl 아세테이트를 사용 하 여 식물 뿌리를 보여 줍니다. 형광 담금질 하는 경향이 일부 중 금속 후자 샘플 유형 상호 접근에 대 한 가장 적합 하다. 몇 백 섹션의 배열 수 있는 전용된 기판 홀더 (그림 2)와 (그림 1C)을 생산. 형광 라벨 후 같은 배열 표준 넓은 필드 FLM (그림 1D)에 몇 군데 다음 헤비 메탈 솔루션 스테인드 되며 다른 해상도 (그림 1E-G) SEM에 몇 군데.
배열, 재현할 수 세대에 대 한 중요 한 도구는 기판에 톰의 칼 보트에서 여러 리본을 배치 하는 경우에 특히는 기판 홀더 (그림 2A, 저자의 연구실에 맞춤형)와 점보 다이아몬드 현미경 슬라이드 (그림 2B)에 맞게 충분히 큰 보트 칼. 리본의 좋은 관측 수 평면 초승달 모양 필요 하 고 플라즈마 기판의 청소에 의해 달성 될 수 있다: 증류수의 작은 물방울 그림 2C (치료 기판)에서 기판에 렌즈 모양의 구조를 형성 한다 박막 (그림 2D, 플라즈마 활성화 기판) 하지만. 이러한 조건 하에서 ITO 코팅 coverslip의 마른 부분에 부착 된 리본은 쉽게 시각화 (그림 2E)와 관찰 하 고 수 물에서 기판의 리프트 아웃 동안 제어.
예를 들어, 배열 propidium 요오드 화물 식물 세포 벽을 물 들일 표준 넓은 필드 FLM (그림 3A)와 몇 군데 있었다. 이후 섹션은 100 nm 두께, 심지어 과도 같이 얼룩 약간 모호 하 게 소개. 등록 후, 완전히 복원 된 볼륨에 포함 된 두 개의 셀 3d에서 고해상도 이미징 이미지 스택 (그림 3B)에서 선정 되었다 (참고 추가 영화 S1). 추가 uranyl 아세테이트 및 리드 시트르산과 얼룩, 다음 배열 몇 군데는 SEM. 개요, 60 nm 이미지 픽셀; 기록 표시 그림 3 C 이미지의 중앙에 어두운 광장 어디 자동 초점 기능, 실행 하 고 추가 복용량 약간의 오염에 지도 위치를 나타냅니다. ROIs 그 직렬 섹션 (조각 51 248 435 조각의 총에서)에 적합 한 5 nm 이미지 픽셀 크기 다음 기록 된 FLM 스택에서 선택한 두 개의 대상 셀을 포함 하 (그림 3D; 보충 영화 S2참고).
여기에 설명 된 sem에서 배열의 자동화 된 계층적 이미징 소프트웨어/하드웨어 플랫폼 솔루션 ZEISS 아틀라스 5로 이루어졌다. 전체 배열에 대 한 개요와 SE 검출기를 사용 하 여 만들어진 첫째, 매우 큰 (1000 nm) 이미지 픽셀 및 매우 낮은 유지 시간 (그림 4A). ROI만 조직 개요 첫 번째 섹션에 배치 하 고 배열의 다른 모든 섹션에 전파 했다. 이 섹션 세트 60 nm 이미지 픽셀 (그림 4B) 긴 망설임 시간을 사용 하 여 다음 기록 했다. 마지막으로, 두 대상 셀에 1을 더한 단계 부정확, 담당 하는 세포를 둘러싼의 "레이어"를 포함 하는 사이트 집합 다음 매개 변수를 설정 했다: ESB (에너지 선택적 후방 산란) 검출기, 5 nm 이미지 픽셀, 아주 긴 (40 µs) 면만 시간 ( 그림 4C). 이러한 이미지를 확대 subcellular 세부 사항 (그림 4D) 그들 (V), 미토 콘 드리 아 (M), 핵 (N), 및 바인딩과 그물 (화살표) 등을 보여 줍니다. 또한 하나의 목표 셀의 subcellular 세부 사항에 전체 배열에 대 한 개요에서 확대에 대 한 보충 영화 s 3 을 참조 하십시오.
여기 (200 섹션)에 표시 된 배열 플러스 추가 250 섹션 중 약 8 h 생산 했다, LM, 그리고 언젠가 FLM에 (수동으로) 기록에 대 한 얼룩 한 밤. 후 얼룩 개별 배열 수에 따라 총에서 약 1-2 시간 걸립니다. Sem의 녹음에 대 한 몇 시간 아틀라스 실행 설정 및 자동된 녹음은 3-4 h 중간 해상도 (60 nm 픽셀 크기) 섹션 세트 (200 섹션, 450 x 200 µ m2) 및 고해상도 (5 nm 픽셀 크기)에 대 한 약 5 일 투자 수익 (200 섹션, 55 x 30 µ m2) 두 개의 대상 셀을 포함 하. Note는 여기에 표시 된 샘플의 낮은 금속 내용으로 인해 매우 느린 검색 속도 고해상도 투자 수익에 대 한 40 µs의 드웰 타임 (현재 사용할 수 있는 탐지기)에 대 한 암시는 좋은 신호 대 잡음 검출을 도달 하는 데 사용할 했다.
일부의 단계에서 전체 워크플로 경향이 함정: 이상적으로 리본 더 많거나 적은 직선과 (그림 5A) 올바른 순서로 배치 해야. 그러나, 구부러진 (그림 5B), 곡선된 (그림 5D), 또는 심지어 깨진된 리본 종종 생산 됩니다. 이 비대칭 또는 unevenly 침투 샘플에서 뿐만 아니라 잘못 된 트리밍 (선도 및 정확 하 게 병렬), 또는 비-균일 하 게 적용된 접착제, 발생할 수 있습니다. 특히 성가신 샘플은 부드럽고 매우 하드 구성 요소가 포함 된. 후자의 구성 요소 (그림 5C) 여기에 표시 된 식물 뿌리의 세포 벽과 같은 침투 하기 어려울 수 있습니다. 이 경우, 주름 (화살촉) 가변 압축 및 단면 동안 휴식에 의해 쉽게 발생할 수 있습니다. 대 한 sem에서 이미지, 자동 곡선된 리본 되지 않습니다 큰 문제 이후는 ROIs 리본의 곡률에 맞게 회전 될 수 있습니다.
프로토콜에서 다른 중요 한 단계 얼룩: 부적절 한 세척 잔류물 (그림 5E, F), 섹션에서 발생할 수 있고 최악의 경우 ( 그림 5 층에 두 개의 대상 셀 중 하나에 원) 가장 흥미로운 영역을 커버. 또한, 먼지 (그림 5D, 강하게 산란 입자) 더러운 기판 캐리어와 함께 칼 보트, 예를 들면에 소개는 심각한 문제가 발생할 수 있습니다: FLM, 먼지는 높은 형광 수 (cf. 보충 영화에에서 몇 조각 S1) 일부 등록 알고리즘 작동 하지 않습니다에 같은 정도. 그러나, TrakEM17 에 "정렬" 기능 추가 영화 s 1에서 같이 이러한 스택을 처리할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> 그림 1: 워크플로 상호 계층적 이미징. 수 지 블록 (A, 강력 하 게 증 착된 샘플)에 포함 된 샘플에서 시작, 샘플 첫 손질된 (B, 약하게 금속된 샘플) 이며 다음 배열 직렬 섹션 (C)의 여러 개의 리본으로 구성 된, 여기에 배치 된 ITO 코팅 coverslip ultramicrotome는을 사용 하 여 생산 됩니다. 형광 염료와 염색, 후 이미지의 넓은 필드 FLM (D)에 기록 됩니다. 소금 추가 라운드 중 금속 얼룩 후 스택은 몇 군데 SEM (E-G)에서 다른 해상도 (이미지 픽셀 크기). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> 그림 2: 배열의 준비 도구. 표준 ultramicrotome (A)에 연결 하는 움직임의 7 축 micromanipulators에서 조립 하는 기판 홀더: 나사, 동그라미, 강조는 (1) 수직 및 수평 운동 (2) 및 (3) 기판 캐리어의 기울이기 . 여기 슬라이드 크기의 알루미늄 캐리어 (B)에 장착 된 플라즈마 활성화 실리콘 웨이퍼의 조각으로 대형 기판 (화살표)를 맞게 특대 보트 점보 다이아몬드 칼. 20 µ L 방울 증류수 치료 실리콘 웨이퍼 기판 (C) 또는 플라즈마 활성화 기판 (D)에 배치. 4 리본 칼 보트에 떠 있는 그들의 낮은 끝에 의해 이토 코팅 coverslip에 연결 된. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> 그림 3: LM 데이터와 sem의 데이터의 상관 관계. FLM (A, B)와 (A, C) 개요 및 대상 셀 (B, D) 기록 및 SEM (C, D). (B) 소프트웨어 줌 이며 원래 데이터 기록 했다 1,388 x 1040 화소 카메라 칩에 40 X 객관적 렌즈와 60 nm 이미지 픽셀 크기, 및 (D) (C)는 기록 하는 동안 5 nm 이미지 픽셀 크기를 보여주는 진정한 해상도 SEM.에 있는 증가 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> 그림 4: 계층적 ZEISS 아틀라스 5 제공을 사용 하 여 sem에서 이미지 배열 개요 1000 nm 이미지 픽셀 SE 검출기 (A)를 사용 하 여 기록. 섹션은 모든 섹션에서 조직에 배치 하 고 60 nm 이미지 픽셀 (B) 기록 수익 설정 합니다. 사이트 설정 직렬 수익 대상 셀에 배치 하 고 5 nm 이미지 픽셀 (C)와 함께 기록 합니다. (D) 같은 고해상도 이미지로 확대, 그들 (V), 핵 (N), 미토 콘 드리 아 (M), 및 바인딩과 그물 (화살표) 같은 세포내 막 구획 표시 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> 그림 5: 전형적인 문제. 1. 단면 과정에서 발생 하는: 구부러진 (B) 또는 곡선된 리본 (D), 또는 심지어 주름 (C) 리본 이토 코팅 coverslips 이상적으로 직선 (A), 하지만 불규칙 압축 단면 중에 발생할 수 있습니다. 2. 단면 및 얼룩 동안 기판 및 물, 예를 들면에 리본 처리로 인 한: 빛 입자를 기판 (D)에 뿌리고, 섹션 e에서(원), 또는 먼지에 물방울의 가장자리 조직 부족 때문에 밖으로 얼룩져 (F) 얼룩 후 세척. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 S1: FLM 이미지 스택. 435 이미지 피지16 TrakEM17 를 사용 하 여 정렬 하 고 동영상 파일 (.avi)로 저장 됩니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 S2: SEM 이미지 스택. 210 이미지 피지16 TrakEM17를 사용 하 여 정렬. 이 데이터 집합의 원래 스택 (300 이미지) 15 기가바이트 했다. 3.3 GB에서 스택 (정렬 하 고 두 셀을 대상만을 자르기) 후 소형화, 그것은 x에 확장 했다 y 0.2의 요인에 의해 피지를 사용 하 여 및 다음.avi 동영상으로 저장. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 S3:는 SEM.에서 다른 해상도 수준으로 확대 영화에서 만들어지고.mp4 형식에서 아틀라스 5 소프트웨어에서 내보낸. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

이 프로토콜 이미징 나노 해상도 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 조직에서 특정 셀을 대상. 가벼운 현미경 목표를 식별 하 고는 SEM.에서 계층적 방식으로 다 수 생물학 물자 수 지 포함에서 직렬 섹션의 처음 몇 군데

큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

multimodal-hierarchical-imaging-serial-sections-for-finding-specific

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K 조회수.  Universität Heidelberg. 이 프로토콜 이미징 나노 해상도 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 조직에서 특정 셀을 대상. 가벼운 현미경 목표를 식별 하 고는 SEM.에서 계층적 방식으로 다 수 생물학 물자 수 지 포함에서 직렬 섹션의 처음 몇 군데

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Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

연구

발생학

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the development of hypertension during obesity. The extent of hypertrophy and hyperplasia depends on depot location, sex, and the type of Adipocyte Progenitor Cell (APC) phenotypes present. Techniques used for APC and preadipocytes isolation in the last 10 years have drastically improved the accuracy at which individual cells can be identified based on specific cell surface markers. However, isolation of APC and adipocytes can be a challenge due to the fragility of the cell, especially if the intact cell must be retained for cell culture applications.
Magnetic-activated Cell Sorting (MCS) provides a method of isolating greater number of viable APC per weight unit of adipose tissue. APC harvested by MCS can be used for in vitro protocols to expand preadipocytes and differentiate them into adipocytes through use of growth factor cocktails allowing for analysis of the prolific and adipogenic potential retained by the cells. This experiment focused on the aortic and mesenteric PVAT depots, which play key roles in the development of cardiovascular disease during expansion. These protocols describe methods to isolate, expand, and differentiate a defined population of APC. This MCS protocol allows isolation to be used in any experiment where cell sorting is needed with minimal equipment or training. These techniques can aid further experiments to determine the functionality of specific cell populations based on the presence of cell surface markers.

Here we report a method for isolation of Adipocyte Progenitor Cell (APC) populations from Perivascular Adipose Tissue (PVAT) using Magnetic-activated Cell Sorting (MCS). This method allows for an increased isolation of APC per gram of adipose tissue when compared to Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS).

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

둥근 벌레 예쁜꼬마선충에서 특정 신경 인구의 격리

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion is the merger of two or more cells to form a single cell. Here we provide a protocol for cell fusion of two different cell types. Fused hybrid cells are enriched by flow cytometry-based sorting, followed by fluorescence microscopy of hybrid cell structure and function. Fluorescently tagged proteins generated by genome editing are imaged inside fused cells, allowing cellular structures to be identified based on fluorescence emission and referenced back to the cell type of origin. This robust and general method can be applied to different cell types or organelles of interest, to understand cellular structure and function across a range of fundamental biological questions.

The purpose of this protocol is to fuse two different cell types to create hybrid cells. Fluorescence microscopy analysis of fused cells is used to track the cell of origin of cellular organelles. This assay can be used to explore how cellular structure and function respond to perturbation by cell fusion.

세포 구조 및 기능의 교란을 위해 게놈 편집 된 세포주 세포주 간의 세포 융합

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...