Name: in vivo clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells marked by five fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy
Uploaded: 2014-08-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy at JoVE.com

This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.

모든 마우스는 보관과 관리 및 건강의 국립 연구소의 실험 동물의 사용을위한 설명서에 따라 처리하고, NHLBI 동물 관리 및 사용위원회가 승인 한 프로토콜에 등록되었다. 여성 B6.SJL-Ptprc (D) Pep3의 (b) / 6~12주 이전 BoyJ (B6.SJL)와 C57BL / 6 마​​우스는 각각 기증자와받는 사람으로 사용되었다. 재료, 시약, 및 장비의 목록이 표 1에 제공된다. 마우스 HSPCs의 1 레고 형질 도입 및 골수 이식 공인 된 바이오 안전성 수준이 (BSL-2) 캐비닛 (조직 문화 후드)으로 설명 절차를 수행합니다. <ol><li> 레고 벡터 인코딩 5FPS의 생산 <ol><li> 렌티 바이러스 &quot;유전자 존재론&quot;(레고) 벡터 플라스미드를 사용 레고 Cer2 (하늘색), 레고-G2 (EGFP), 레고-V2 (금성), 레고-T2를 포함하여 구조적으로 강하게 SFFV 프로모터에서 다른 FP를 인코딩 각 (tdTomato), 친절 박사 보리스 Fehse (대학 의료 센터 함부르크 - 에펜 도르프, 함부르크, 독일)에서 제공하는 레고-C2 (mCherry); Addgene 5-7에서도보실 수 있습니다 지금. </li><li> 레고 벡터, 씨앗 10cm 요리 (각 벡터 (12) 요리를 사용) 24 시간 전에 I10 미디어 (10 % FCS와 글루타민 / 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 IMDM)의 8 ML의 형질에 5 × 10 6 293T 세포를 생산합니다. </li><li> 약간 수정 CAPHOS 키트 추천 정보를 사용하여 인산 칼슘과 함께 세포를 형질 감염 : <ol><li> 각 플레이트 믹스 15 μg 레고 벡터, 12 μg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 μg 이전-TAT, 50의 존재 ㎕의 2.5 M 염화칼슘이 1 μg pMD2.G-VSV-G 플라스미드, 및 물을 넣어 500 ㎕의 총 부피를 수득 하였다. </li><li> 2X HeBS (HEPES 완충 식염수) 500 μL와 석출물 DNA 플라스미드 및 이전 293T 세포의 각 플레이트에 첨가하여 실온에서 20 분 동안 배양한다. </li><li> 에 대한 세포를 품어37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 6 시간; 미디어를 제거하고 신선한 문화 매체 6 시간 포스트 형질을 추가합니다. </li></ol></li><li> 3 일간, 매일, 각 판에서 렌티 바이러스 입자를 포함하는 배양 상층 액을 수집합니다. 매일 다음 상층 액을 수집 각 플레이트에 신선한 I10 미디어를 추가 할 수 있습니다. <ol><li> 0.22 μm의 기공, 수영장을 통해 필터 및 71,900 XG, 4 ° C에서 2 시간 동안 SW28 로터에 초 원심 분리하여 상층 액을 집중한다. </li><li> StemSpan 매체의 1 mL의 상층 액을 재현 탁. -80 ° C에서 200 μL 및 저장소의 렌티 바이러스 주식을 나누어지는. </li></ol></li></ol></li><li> 렌티 바이러스 입자의 적정 NIH3T3 세포를 이용한 단위 / ml의 열 변환의 정량을 통해 수집 된 상층 액에서 레고 벡터 입자의 역가를 결정합니다. 역가 실험 대상의 감염 (MOI)의 원하는 상대 다수 발생하는 데 필요한 각 벡터 상청액의 부피 계산을 허용세포. <ol><li> 플레이트 일일 적정 전에 I10 미디어 2 ㎖ 잘 (12 웰 플레이트) 당 5 × 10 4 NIH3T3 세포. </li><li> (4 ㎎ / ㎖가 1,000 배입니다) 프로타민 황산 보충 I10 미디어에서 벡터 상층 액의 5 배 희석액을 준비합니다. </li><li> 세포에서 용지를 제거하고 농축 된 바이러스의 2, 0.8, 0.32 및 0.128 μL의 등가를 포함하는 상층 액을 희석 500 μL로 교체합니다. </li><li> 물론 하나의 제어를 카운트 전달시 웰당 본 셀의 수 (아니오)을 결정한다. </li><li> 6 시간 전달 후, I10 미디어 2 ㎖를 추가하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 3 일간 배양한다. </li><li> 각 웰 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 수확하고, 유동 세포 계측법, 형광을 통한 세포의 비율 (% FP)을 결정한다. </li><li> 아니 역가 (벡터 입자 / ㎖) = 1 ~ 50 % %의 FP의 결과로 각 웰 (희석)에 대해 얻어진 역가 평균, 다음과 같은 역가를 계산벡터 상층 액 (ML)의 X %의 FP / 볼륨. %의 FP가 1 ~ 50 % 사이 인 경우 각 희석 얻은 역가 평균값. </li></ol></li><li> 마우스 셀 컬렉션, 정화, 형질 도입 및 이식 (개략적으로 그림 1a에 도시는 Malide 등. 사에서 적응). <ol><li> 승인 된 절차에 의해 공여 쥐를 희생. 전방 및 후방 사지에서 수확 골수 : 철저하게 관절에 최대한 가깝게 각 뼈의 끝을 가로 질러 뼈의 모든 근육, 인대 및 초과 조직을 제거하고, 밖으로 골수를 씻어 humeri, 대퇴골 및 경골을 해부 I10 매체를 함유하는 주사기 27-0 G 바늘을 사용하여 뼈. </li><li> 500 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 전체 골수 세포 펠렛 및 50 ㎖의 ACK 버퍼로 두 번 적혈구를 용해. 10 ml의 I10 미디어에 재현 탁 세포. </li><li> 수정 키트 protoco에 따라 MACS 혈통 고갈 키트와 함께 계보 음 (선형 적) 전구 세포를 정화리터 : <ol><li> 안티 - 비오틴 마이크로 비즈의 30 μL 대신 10 μL / 10 7 세포를 사용하여; I2 미디어 (2 % FCS로 보충 IMDM) 대신 버퍼로 세척 단계를 완료합니다. </li><li> 비오틴 항체 칵테일 배양 및 안티 - 비오틴 마이크로 비즈 배양 사이에 하나 세척 단계를 삽입; 그리고 I10 대신 버퍼 열 평형. </li></ol></li><li> 10ng의 / ㎖ 뮤린 IL-3, 100 NG / ㎖ 뮤린 IL-11, 100 NG / ㎖ 인간 FLT-3 보충 StemSpan 매체에서 5 × 105 세포 / ml의 초기 농도에서 48 시간 동안 배양 선형 적 세포 리간드, 및 50 NG / ㎖ 뮤린 줄기 세포 인자. </li><li> StemSpan의 존재하에 4 × 105 세포를 12 웰 플레이트 각각 FP 50 % 발현 효율을 달성하기 위해 RetroNectin 코팅 및 감염 다중도 6-7의 (MOI)에서, 레고 상청액에 각각 형질 도입, 환승 1 미디어 및 사이토 카인은 위에서 설명한 4 μg / ml의 프로타민 황산. </li><li> 세포를 형질각 레고 벡터 개별적으로 단계 1.3.5에서 설명하고 전달 다음 세포를 혼합으로 (믹스라고) 또는 동시에 모두 5 레고 벡터 상층 액과 세포를 공동 - 형질 도입 (공동라고). 24 시간 후 세포를 제거 사이토 카인없이 StemSpan 미디어로 한번 씻어 이식 사이토 카인없이 StemSpan 미디어에서 그들을 재현 탁, 또는 공 초점 현미경 전에 추가 96 시간 동안 신선한 사이토 카인과 미디어, 문화로 전송 및 유동 세포 계측법. <ol><li> 1에 해당하는 마우스 당 셀 용량으로, 100 μL의 볼륨, 11 Gy의 단일 용량 사전 조사받는 사람 (6-18 시간 전에 이식을)받는 사람에 꼬리 정맥 주입을 통해 선형 적 HSPCs를 형질 주입하여 골수 이식을 수행 -2 × 105 선형 적 세포 본래 형질 도입을 위해 도금. 각 실험에서, 형질 도입 된 BM 도너 셀의 동일 인구 동물의 전체 코호트를 이식. </li><li> 유전자 변형 H의 체외 특성화하는 SPC는 배양 StemSpan에 추가 4-5일위한 사이토 카인은 세포로 보충하고 전달 효율을 유동 세포 계측법에 의해 분석하고, 색상의 다양성을위한 현미경. <ol><li> 개별 쥐를 희생하고 다양한 시간은 이식 후 1백20일 포인트 최대에, 영상에 대한 조직 및 기관을 검색 할 수 있습니다. <ol><li> 에탄올로 마우스의 털을 헤어 스프레이 보급을 피 복부 측의 피부를 절개. </li><li> 표준 절차 비장, 슬와 림프절, 폐, 심장, 피부, 지방 조직, 골격근, 신장, 간뿐만 아니라 덮개 뼈에 접근 헤드에 따라 해부 및 소비세. </li><li> 또한, 덮개 뼈를 사용하거나 라이브 동물의 피부와 림프절로 시간 2,8,9 또는 이미지 피상적 장기에 걸쳐 반복적으로 실시간 이미징을위한 뼈 창을 설정합니다. </li></ol></li><li> 50 ~ 100에서 35mm 숫자 0 커버 유리 배양 접시에서 개별 기관을 배치56 단계 : 2.5에 설명 된대로 단면 고정 또는 추가 처리없이 그대로 그들을 이미징 리터 PBS를. </li><li> 체적 영상의 경우, 차가운 PBS에 사용할 때까지 장기에 보관하십시오. 시간 경과 영상의 경우, 20 mM의 HEPES를 포함하는 10 % FBS 37 ° C에서 DMEM에 장기 이미징 즉시 진행 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2 공 초점과 두 개의 광자 현미경 및 이미지 분석 <ol><li> 멀티 라인 아르곤, 다이오드 561 nm의 헬륨 네온 594 nm의, 그리고 헬륨 네온 633 nm의 가시 레이저를 장착 한 라이카 SP5 5 개의 채널 공 초점 및 광자 시스템을 사용하여 현미경 이미징을 수행합니다. 680에서 분산 보정과 1,080 nm의 여기에 사파이어 (티 - 사) 레이저, 조정 : 2 광자 모드, 펄스 펨토초 티타늄에 사용합니다. t와 순차적으로 또는 동시에, 1,030-1,300 nm의 것이면 출력 파장 범위를 확장하는 적색 편이 (FPS tdTomato 및 mCherry), 광 파라 메트릭 발진 (OPO) 레이저를 포함하는 실험에 사용티 - 사행 레이저 그가. </li><li> - IRAPO-L HCX 25X / 0.95 NA 물 침지 목표 (WD = 2.5 mm), HC-PLAPO-CS 20 배 / 0.70 NA 건조 목적 (WD = 0.6 mm) 또는 HC-PL-IRAPO 40 배를을 사용하여 이미지의 다양한 조직 /1.1 NA 침수 목적 (WD = 0.6 mm). </li><li> 제어뿐만 아니라 단일 FP 레고 벡터로 형질 도입 된 BM 세포로부터 가시 스펙트럼의 5 nm의 대역폭에 발광 람다 스택 (xyλ)를 수집하는 공 초점 형광 스펙트럼을 구하는, BM을-이식하지. <ol><li> 라이카 LAS-AF의 v2.4.1 소프트웨어 프로세스 이미지는 모두 5 FP의의 참조 스펙트럼과 형광도의 등 (그림 2A)를 만들 수 있습니다. 개별 FP 스펙트럼 및 형광 밝기의 차를 이용하여 다음과 같이 다섯 순차 촬상 채널을 설정 세룰 리안 (79 %), 금성 (1백56퍼센트) tdTomato (283퍼센트) 및 mCherry (47 %)의 (EGFP의 백분율로서 표현) 세룰 리안 (458 / 468-482 nm의), EGFP (488 / 496-514 nm의), 비너스 (514 / 523-558 nm의), tdTomato (561 / 579-597 nm의), 그리고 mCherry (594 / 618-670 nm의) ( <str옹&gt; 그림 2B). </li><li> 각 개별 FP 형질 세포가 나머지 (그림 2C) 만 해당 채널에 표시하고 결석으로, 정확한 FP의 분리를 확인합니다. 또한,이 정의되어 멀티 채널 접근은 후속 컬러 클론 분석 및 추적을 가능하게하고 스펙트럼 이미징에 비해 획득 시간을 감소시키는 이점을 가지고 고유 한 5 - 채널 &quot;용 ColorPRINT&quot;를 생성한다. </li></ol></li><li> , 2 광자 모드에서, 네 개의 채널이 아닌 descanned 검출기 (NDD) 등으로 수집 맞춤 이색 미러 고효율 의해 분리 형광 방출은 다음과 같다 : 465 nm에서의 다이크로 익 미러이어서 568 nm에서의 다이크로 익 미러는, 다음 SHG 또는 자기 형광 및 하늘색, tdTomato 또는 mCherry위한 EGFP 또는 비너스 40분의 525 nm의 방출 필터 및 648 나노 미터의 다이크로 익 미러와 60분의 620 nm의 방출 필터는 45분의 452 nm의 방출 필터. <ol><li> 두 광자 현미경의 난에 의해 구조 정보를 공개ntrinsic 대비 (780 nm에서 흥분) 엘라스틴, NADH에서 조직자가 형광의 위에서 설명한대로 이미징 및 초 고조파 다시 산란에서 수집 한 920 나노 미터 또는 860 nm에서 (흥분 뼈와 섬유의 콜라겐의 신호 (SHG)를 생성 방향) 10, 11. </li></ol></li><li> 3 차원 볼륨 렌더링의 경우, 골수 및 다른 조직에 걸쳐 깊이의 범위 (150 ~ 300 μM) 위에 5 μm의 간격으로 Z-축을 따라 XYZ 이미지 시리즈 (보통 1 × 1 × 4 μm의 3 복셀 사이즈)를 수집하고, 소프트웨어의 타일 기능을 이용하여 큰 영역을 자동적으로 전체 흉골 fossae 약 2.5 × 1.2 mm 2 (XY) 및 300 μM (z) (도 2D-2E) 및 영화 일을 포함 스티치 볼륨을 생성하기 위해 위에. <ol><li> 이미지는이, 팔 절단을하지 않고 두개골을 통해 직접 골수 개관. </li><li> 다음 시상면 (양분)과 함께 제 흉골횡 방향으로 절단 얼굴 3,4,12을 통해이 흉골 해자와 이미지 사이의 조인트 (Takaku에서 적응 그림 1B의 개요 등 세). </li></ol></li><li> 4D 시간 경과 영상의 경우, 50 ~ 100 μL에서 35mm 숫자 0 커버 글라스 배양 접시에 포경 갓 절제 오금 림프절, 비장, 폐, 또는 두개골 뼈 샘플을 배치 37 ° C에서 20 mM의 HEPES를 포함하는 DMEM, 10 % FBS 와 ~ (Z-스택을 복용, 공 초점 여자 (458 나노 미터, 488 나노 미터, 514 나노 미터, 561 나노 미터, 594 나노 미터) 라이카 공진 스캐너 (8,000 Hz에서 / 초)와 결합 된이 광자 티 - 사 여기 (860 나노 미터)를 사용 최대 1 시간 동안 20 초 간격으로 80 μM). <ol><li> 동시에 세 가지 컬러 2P 이미징 사용 티 - 사를 들어 860에서 조정 nm 인 동시에 OPO의 (tdTomato에 1,130 nm에서 조정 또는 1,140 nm의 mCherry) 레이저 (동영상 2). </li></ol></li><li> 3D 볼륨과 4D 시간 시퀀스의 재건 및 분석 <ol><li> Imaris 64의 소프트웨어를 사용하여이전에 3,4 바와 같이, 버전 7.6 또는 볼륨 렌더링 (3D)로 RAW 이미지의 타일 - 스택을 변환하는 다른 소프트웨어 패키지 골수 및 다른 조직과 3D 회전 영화로 내보내려면 내부 형광 세포의 데이터이다 (동영상 1) 단계별 예 : <ol><li> Imaris에서, Z-스택 이미지를 엽니 다; 선택 3D 볼륨 가시화를 표시하기 위해 &quot;능가&quot;. </li><li> 360 °의 주위에 볼륨을 설정하는 &quot;이동&quot;를 사용합니다. </li><li> 애니메이션을 만들려면 &quot;애니메이션&quot;을 선택; 선택보기, 줌, 볼륨의 회전을 추가 할 키 프레임을 사용; 영화를 미리 필요한 편집하고 원하는 영화 형식으로 파일을 저장 (예 : AVI, MOV). </li></ol></li><li> 3D 셀과 클론 주파수, 위치, 크기 및 분포의 정량적 평가, 상기 프로세스에 대한 거리 MEAS 수행 MATLAB 애플리케이션 통합 Imaris XT 모듈을 사용하여 Z-스택(거리 변환 알고리즘을 사용하여) urements과 클러스터 분석과 같은 이전 설명 3,4. Imaris의 64 소프트웨어의 볼륨 렌더링 사 차원 (4D) 영화로 시간이 지남에 따라 이미지 스택의 시퀀스를 변환 및 회귀 움직임 알고리즘을 사용하여 입체적으로 세포 운동성의 반자동 추적 지점 및 표면 분석을 사용합니다. </li><li> 다음과 같이 세포의 멀티 스펙트럼 분석을 수행 : 멀티 컬러에 새로운 채널로 Imaris XT의 채널 연산을 통해 모두 5 채널을 추가하여 표시된 지점을 추출; 모든 반점 (셀) 5 컴포넌트 채널들 각각의 평균 형광 강도를 결정. 개별 셀의 각 FP (그림 2E 그래프)의 상대 % 즉, 고유의 &quot;용 ColorPRINT&quot;를 표시하는 그래프를 플롯 엑셀 소프트웨어의 값을 내 보냅니다. 티슈 드리프트에 설정된 데이터를 정정하고, 셀의 변위 속도와 시간의 경과, 트랙 길이, 경로 및 거리를 계산; 엑셀 사무실 용 수출 값그래프를 그리는 tware. 어도비 포토샵 CSS 5 소프트웨어 복합 수치를 조립합니다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li><li>Takaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis+in+3+dimensions+human+and+murine+bone+marrow+architecture+visualized+by+confocal+microscopy.">Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy.</a> Blood. 116, e41-e55 (2010).</li><li>Malide, D., Metais, J. 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저자는 경쟁 금융 이익을 선언하지 않습니다.

우리는 살아있는 조직에 메스하고 역동적 인 이미지를 달성하기 위해 직렬 공 촛점 및 2 광자 현미경 5FP 인코딩 레고 벡터와 영상으로 표시 조합에 의해 생성 된 큰 다양성을 결합, 여기에 최근 클론 세포 추적을위한 고안 강력한 방법의 세부 사항을 설명합니다. 이것은 5 &quot;뚜렷한&quot;8 비트 채널에서 촛점 스펙트럼 ID를 기록하여 마킹 FP 기반 컬러의 사용을 확장. 따라서 각 셀 내에서 세룰 리?...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

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Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

혈액 세포, 조혈 지칭의 제조는, 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)의 작은 집단에 의해 유지된다. 이러한 세포는 모두 자기 갱신 및 1,2 분화의 제어에 연루, 골아 세포, 간질 세포, 지방 조직, 혈관 구조로 이루어진 복합 미세 환경 틈새 골수 (BM) 내에 상주. 그대로 BM 직접 관찰 전통적으로 액세스 할 수없는 한 바와 같이, HSPC과 미세 환경 사이의 상호 작용은 생체 내에서 주로지지 않은 남아있다. 이전에, 우리는 공 초점 형광 및 반사 현미경 3를 사용하여 그대로 BM의 3 차원 구조를 시각화하는 방법을 설립했다. 우리는 BM-EGFP에 표시된 HSPCs의 확장을 특징으로하지만, 단지 하나의 FP 사용 클론 레벨에서 재생의 분석을 배제. 아주 최근에 우리는 구조적으로 FL을 표현 렌티 바이러스 유전자 존재론 (레고)의 장점 벡터를했다uorescent 단백질 수 (fps)을 효율적으로 세포 4,5를 표시합니다. 3 또는 5 벡터와 HSPC의 공동 형질이 여러 개인 HSPC 클론의 추적을 허용, 조합 색상의 다양한 팔레트를 생성합니다. 표시됨 HSPC는 조사 된 마우스의 BM 개별 HSPC 원점 복귀 및 생착를 추적하도록 허용 새로운 이미징 기술과 결합. 레고 벡터는 뼈와 기타의 명확한 시각화를 허용, (세루 리안, eGFP는, 금성, tdTomato 및 mCherry부터) 셋 또는 다섯 다른 FP의와 HSPC을 표시하고 공 촛점 및 2 광자 현미경에 의한 BM에서 시간이 지남에 따라 자신의 생착을 수행하는 데 사용 된 매트릭스 구조, 및 그 구성 요소의 미세 HSPC 클론 관계. HSPC 레고 벡터로 형질 C57BL / 6 마​​우스 BM의 계보 음성 세포로 정제하고, myelo - 절제 congenic 마우스로 꼬리 정맥 주사로 reinfused되었다. 흉골 BM 조직의 큰 볼륨을 모니터링함으로써 우리는 초기에 발생하는 골 내막 생착을 시각화BM 재생. 다양한 컬러 스펙트럼이있는 셀 클러스터는 뼈 가까이에 처음 등장하고 시간이 지남에 따라 중앙에서 진행. 흥미롭게도, 이상 삼주 후 골수 오히려 혈류를 통해 HSPCs 널리 보급보다 연속적으로 골수에서 개별 HSPCs에서 유래 조혈의 확산을 제안, 거시적 클론 클러스터로 구성되었다. 작은 색상의 다양성은 다수의 벡터와 세포를 다시 채우기 장기 열 변환하는데 어려움을 시사 늦은 시점에서 있었다. 또한 HSPCs는 마우스에서 비장에 대한 책임 또한 조혈 기관을 클러스터 형성. HPSC에서 파​​생 된 각각의 세포뿐만 아니라, 흉선에서 림프절, 비장, 간, 폐, 심장, 피부, 골격 근육, 지방 조직, 신장 해결 될 수있다. 3D 이미지는 조직의 최소한의 교란과 세포의 분포를 평가하는 정 성적 및 정량적으로 평가 될 수있다. 마지막으로, 우리는 설명공진 스캔 광자 공 촛점 시간 경과 영상을 결합하여 4D 라이브 동적 스터디의 개발 가능성. 이 방법론은 조직 재생 및 병리학의 연구에서 강력한 도구를 제공, 자신의 본래 3D 아키텍처 스펙트럼 표시 세포 인구의 비 침습적 높은 해상도, 다차원 세포 운명의 추적을 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Production of Viruses&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LeGO-Cer2</td><td>Addgene</td><td>27338</td><td>Expression of Cerulean</td></tr><tr><td>LeGO-G2</td><td>Addgene</td><td>25917</td><td>Expression of eGFP</td></tr><tr><td>LeGO-V2</td><td>Addgene</td><td>27340</td><td>Expression of Venus</td></tr><tr><td>LeGO-T2</td><td>Addgene</td><td>27342</td><td>Expression of tdTomato</td></tr><tr><td>LeGO-C2</td><td>Addgene</td><td>27339</td><td>Expression of mCherry</td></tr><tr><td>Calciumm Phosphate Transfection Kit</td><td>Sigma</td><td>CAPHOS-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture dish</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technology</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td><td>Sigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine</td><td>Gibco, Life Technology</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>L60</td><td></td></tr><tr><td>Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22 &amp;micro;m)</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Quality Biologicals Inc.</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit (mouse)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>LS columns + tubes</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Separation Filters (30 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500 ml)</td><td>StemCell Technologies Inc&amp;nbsp;</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-11 CF</td><td>R &amp;amp; D Systems Inc</td><td>418-ML-025/CF</td><td>100 &amp;micro;g/ml is 1,000x</td></tr><tr><td>Recombinant murine SCF</td><td>RDI Division of Fitzgerald Industries Intl&amp;nbsp;</td><td>RDI-2503</td><td>100 &amp;micro;g/ml is 2,000x</td></tr><tr><td>Recombinant murine IL-3</td><td>R &amp;amp; D Systems Inc</td><td>403-ML-050</td><td>20 &amp;micro;g/ml is 2,000x</td></tr><tr><td>FLT-3 Ligand</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-096-480</td><td>100 &amp;micro;g/ml is 1,000x</td></tr><tr><td>12-well plates, Costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A/B</td><td>Resuspend at 50 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Protamine Sulfate</td><td>Sigma</td><td>P-4020</td><td>4 &amp;micro;g/ml is 1,000x</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Confocal and Two-photon Microscopy&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro, Mediatech Inc.</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom culture dish P35G-0-20-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom culture dish P35G-0-14-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well</td><td>Thermo Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 22 mm No 2</td><td>Thomas Scientific</td><td>6662-Q55</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1,080 nm</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Compact OPO laser range 1,030-1,350 nm</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersion objective (WD=0.6 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris software version 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells marked by five fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy

우리는 개발과 쥐의 골수 이식 실험 모델을 이용하여 생체 내 조혈에서 공부하는 높은 공간 및 시간 해상도와 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)의 클론 추적을위한 방법론을 표시하는 형광을 확인. 형광 단백질 (fps)를 코딩하는 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 표시하는 유전자 조합이 고급 현미경 영상을 통해 세포 운명 매핑 할 수있었습니다. 다섯 가지 FP의 인코딩 벡터 : 세룰 리안, EGFP, 금성, tdTomato 및 mCherry 컬러 표시 세포의 다양한 팔레트를 만드는 동시에 HSPCs를 형질 도입하는 데 사용되었다. 공 초점 / 두 광자 하이브리드 현미경을 사용하여 영상의 동시 고해상도 고유 표시 세포의 평가와 조직 구조 구성 요소와 함께 자신의 자손을 할 수 있습니다. 체적은 스펙트럼 적 부호화 HSPC 유래 세포는 비 침습적 골수 손상을 포함하는 다양한 조직에서 검출 될 수있는 것으로 나타났다 (큰 영역 위에 BM 분석), 이식 다음 시간의 광범위한 기간 동안. 4D 비디오 속도 광자 공 촛점 시간 경과 영상을 결합 라이브 연구는 정량적 인 방법으로 동적 세포 및 클론 추적의 가능성을 보여줍니다.

전체 마운트 3D 공 초점 흉골 골수 시간 코스 / 2 광자 현미경 복원은 놀라운 특성을 가진 패턴으로 생착 및 이식 공동 5FPS의 확장을 밝혀 : 클론 명확하게 윤곽이 균일하게 넓은 초기 색상 팔레트 및 진행 표시 등장 시간이 지남에 따라 우선적으로 주로 하나의 색의 셀을 포함한다. 공 초점 현미경 설치 및 흉골 골수에서 영상 5FPS 마크 HSPC의 대표적인 예는 그림 2와 영화 1과 2에 나타내?...

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In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

13.1K 조회수.  NHLBI/NIH.  조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다. 

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A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

연구

발생학

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular niches modulating critical hematopoietic stem cell (HSC) functions1,2. Indeed, a more detailed picture of the hematopoietic microenvironment is now emerging, in which the endosteal and the endothelial niches form functional units for the regulation of normal HSC and their progeny3,4,5. New studies have revealed the importance of perivascular cells, adipocytes and neuronal cells in maintaining and regulating HSC function6,7,8. Furthermore, there is evidence that cells from different lineages, i.e. myeloid and lymphoid cells, home and reside in specific niches within the BM microenvironment. However, a complete mapping of the BM microenvironment and its occupants is still in progress.
Transgenic mouse strains expressing lineage specific fluorescent markers or mice genetically engineered to lack selected molecules in specific cells of the BM niche are now available. Knock-out and lineage tracking models, in combination with transplantation approaches, provide the opportunity to refine the knowledge on the role of specific &#34;niche&#34; cells for defined hematopoietic populations, such as HSC, B-cells, T-cells, myeloid cells and erythroid cells. This strategy can be further potentiated by merging the use of two-photon microscopy of the calvarium. By providing in vivo high resolution imaging and 3-D rendering of the BM calvarium, we can now determine precisely the location where specific hematopoietic subsets home in the BM and evaluate the kinetics of their expansion over time. Here, Lys-GFP transgenic mice (marking myeloid cells)9 and RBPJ knock-out mice (lacking canonical Notch signaling)10 are used in combination with IVFM to determine the engraftment of myeloid cells to a Notch defective BM microenvironment.

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital fluorescence microscopy (IVFM) of the calvarium is applied in combination with genetic animal models to study the homing and engraftment of hematopoietic cells into bone marrow (BM) niches.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

생체공학

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

작은 동물의 근육 Engraftment의 역학에 의해 추적 VIVO에서 형광 이미징

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

생물학

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

의학

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

면역학 및 감염병학

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

영상 모니터 세포 생물학과 여러 신경 인구의 계보 진행을 추적 하는 단일 셀 다음 라이브

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

신경과학

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

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