This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.

모든 마우스는 보관과 관리 및 건강의 국립 연구소의 실험 동물의 사용을위한 설명서에 따라 처리하고, NHLBI 동물 관리 및 사용위원회가 승인 한 프로토콜에 등록되었다. 여성 B6.SJL-Ptprc (D) Pep3의 (b) / 6~12주 이전 BoyJ (B6.SJL)와 C57BL / 6 마​​우스는 각각 기증자와받는 사람으로 사용되었다. 재료, 시약, 및 장비의 목록이 표 1에 제공된다. 마우스 HSPCs의 1 레고 형질 도입 및 골수 이식 공인 된 바이오 안전성 수준이 (BSL-2) 캐비닛 (조직 문화 후드)으로 설명 절차를 수행합니다. <ol><li> 레고 벡터 인코딩 5FPS의 생산 <ol><li> 렌티 바이러스 &quot;유전자 존재론&quot;(레고) 벡터 플라스미드를 사용 레고 Cer2 (하늘색), 레고-G2 (EGFP), 레고-V2 (금성), 레고-T2를 포함하여 구조적으로 강하게 SFFV 프로모터에서 다른 FP를 인코딩 각 (tdTomato), 친절 박사 보리스 Fehse (대학 의료 센터 함부르크 - 에펜 도르프, 함부르크, 독일)에서 제공하는 레고-C2 (mCherry); Addgene 5-7에서도보실 수 있습니다 지금. </li><li> 레고 벡터, 씨앗 10cm 요리 (각 벡터 (12) 요리를 사용) 24 시간 전에 I10 미디어 (10 % FCS와 글루타민 / 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 IMDM)의 8 ML의 형질에 5 × 10 6 293T 세포를 생산합니다. </li><li> 약간 수정 CAPHOS 키트 추천 정보를 사용하여 인산 칼슘과 함께 세포를 형질 감염 : <ol><li> 각 플레이트 믹스 15 μg 레고 벡터, 12 μg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 μg 이전-TAT, 50의 존재 ㎕의 2.5 M 염화칼슘이 1 μg pMD2.G-VSV-G 플라스미드, 및 물을 넣어 500 ㎕의 총 부피를 수득 하였다. </li><li> 2X HeBS (HEPES 완충 식염수) 500 μL와 석출물 DNA 플라스미드 및 이전 293T 세포의 각 플레이트에 첨가하여 실온에서 20 분 동안 배양한다. </li><li> 에 대한 세포를 품어37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 6 시간; 미디어를 제거하고 신선한 문화 매체 6 시간 포스트 형질을 추가합니다. </li></ol></li><li> 3 일간, 매일, 각 판에서 렌티 바이러스 입자를 포함하는 배양 상층 액을 수집합니다. 매일 다음 상층 액을 수집 각 플레이트에 신선한 I10 미디어를 추가 할 수 있습니다. <ol><li> 0.22 μm의 기공, 수영장을 통해 필터 및 71,900 XG, 4 ° C에서 2 시간 동안 SW28 로터에 초 원심 분리하여 상층 액을 집중한다. </li><li> StemSpan 매체의 1 mL의 상층 액을 재현 탁. -80 ° C에서 200 μL 및 저장소의 렌티 바이러스 주식을 나누어지는. </li></ol></li></ol></li><li> 렌티 바이러스 입자의 적정 NIH3T3 세포를 이용한 단위 / ml의 열 변환의 정량을 통해 수집 된 상층 액에서 레고 벡터 입자의 역가를 결정합니다. 역가 실험 대상의 감염 (MOI)의 원하는 상대 다수 발생하는 데 필요한 각 벡터 상청액의 부피 계산을 허용세포. <ol><li> 플레이트 일일 적정 전에 I10 미디어 2 ㎖ 잘 (12 웰 플레이트) 당 5 × 10 4 NIH3T3 세포. </li><li> (4 ㎎ / ㎖가 1,000 배입니다) 프로타민 황산 보충 I10 미디어에서 벡터 상층 액의 5 배 희석액을 준비합니다. </li><li> 세포에서 용지를 제거하고 농축 된 바이러스의 2, 0.8, 0.32 및 0.128 μL의 등가를 포함하는 상층 액을 희석 500 μL로 교체합니다. </li><li> 물론 하나의 제어를 카운트 전달시 웰당 본 셀의 수 (아니오)을 결정한다. </li><li> 6 시간 전달 후, I10 미디어 2 ㎖를 추가하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 3 일간 배양한다. </li><li> 각 웰 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 수확하고, 유동 세포 계측법, 형광을 통한 세포의 비율 (% FP)을 결정한다. </li><li> 아니 역가 (벡터 입자 / ㎖) = 1 ~ 50 % %의 FP의 결과로 각 웰 (희석)에 대해 얻어진 역가 평균, 다음과 같은 역가를 계산벡터 상층 액 (ML)의 X %의 FP / 볼륨. %의 FP가 1 ~ 50 % 사이 인 경우 각 희석 얻은 역가 평균값. </li></ol></li><li> 마우스 셀 컬렉션, 정화, 형질 도입 및 이식 (개략적으로 그림 1a에 도시는 Malide 등. 사에서 적응). <ol><li> 승인 된 절차에 의해 공여 쥐를 희생. 전방 및 후방 사지에서 수확 골수 : 철저하게 관절에 최대한 가깝게 각 뼈의 끝을 가로 질러 뼈의 모든 근육, 인대 및 초과 조직을 제거하고, 밖으로 골수를 씻어 humeri, 대퇴골 및 경골을 해부 I10 매체를 함유하는 주사기 27-0 G 바늘을 사용하여 뼈. </li><li> 500 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 전체 골수 세포 펠렛 및 50 ㎖의 ACK 버퍼로 두 번 적혈구를 용해. 10 ml의 I10 미디어에 재현 탁 세포. </li><li> 수정 키트 protoco에 따라 MACS 혈통 고갈 키트와 함께 계보 음 (선형 적) 전구 세포를 정화리터 : <ol><li> 안티 - 비오틴 마이크로 비즈의 30 μL 대신 10 μL / 10 7 세포를 사용하여; I2 미디어 (2 % FCS로 보충 IMDM) 대신 버퍼로 세척 단계를 완료합니다. </li><li> 비오틴 항체 칵테일 배양 및 안티 - 비오틴 마이크로 비즈 배양 사이에 하나 세척 단계를 삽입; 그리고 I10 대신 버퍼 열 평형. </li></ol></li><li> 10ng의 / ㎖ 뮤린 IL-3, 100 NG / ㎖ 뮤린 IL-11, 100 NG / ㎖ 인간 FLT-3 보충 StemSpan 매체에서 5 × 105 세포 / ml의 초기 농도에서 48 시간 동안 배양 선형 적 세포 리간드, 및 50 NG / ㎖ 뮤린 줄기 세포 인자. </li><li> StemSpan의 존재하에 4 × 105 세포를 12 웰 플레이트 각각 FP 50 % 발현 효율을 달성하기 위해 RetroNectin 코팅 및 감염 다중도 6-7의 (MOI)에서, 레고 상청액에 각각 형질 도입, 환승 1 미디어 및 사이토 카인은 위에서 설명한 4 μg / ml의 프로타민 황산. </li><li> 세포를 형질각 레고 벡터 개별적으로 단계 1.3.5에서 설명하고 전달 다음 세포를 혼합으로 (믹스라고) 또는 동시에 모두 5 레고 벡터 상층 액과 세포를 공동 - 형질 도입 (공동라고). 24 시간 후 세포를 제거 사이토 카인없이 StemSpan 미디어로 한번 씻어 이식 사이토 카인없이 StemSpan 미디어에서 그들을 재현 탁, 또는 공 초점 현미경 전에 추가 96 시간 동안 신선한 사이토 카인과 미디어, 문화로 전송 및 유동 세포 계측법. <ol><li> 1에 해당하는 마우스 당 셀 용량으로, 100 μL의 볼륨, 11 Gy의 단일 용량 사전 조사받는 사람 (6-18 시간 전에 이식을)받는 사람에 꼬리 정맥 주입을 통해 선형 적 HSPCs를 형질 주입하여 골수 이식을 수행 -2 × 105 선형 적 세포 본래 형질 도입을 위해 도금. 각 실험에서, 형질 도입 된 BM 도너 셀의 동일 인구 동물의 전체 코호트를 이식. </li><li> 유전자 변형 H의 체외 특성화하는 SPC는 배양 StemSpan에 추가 4-5일위한 사이토 카인은 세포로 보충하고 전달 효율을 유동 세포 계측법에 의해 분석하고, 색상의 다양성을위한 현미경. <ol><li> 개별 쥐를 희생하고 다양한 시간은 이식 후 1백20일 포인트 최대에, 영상에 대한 조직 및 기관을 검색 할 수 있습니다. <ol><li> 에탄올로 마우스의 털을 헤어 스프레이 보급을 피 복부 측의 피부를 절개. </li><li> 표준 절차 비장, 슬와 림프절, 폐, 심장, 피부, 지방 조직, 골격근, 신장, 간뿐만 아니라 덮개 뼈에 접근 헤드에 따라 해부 및 소비세. </li><li> 또한, 덮개 뼈를 사용하거나 라이브 동물의 피부와 림프절로 시간 2,8,9 또는 이미지 피상적 장기에 걸쳐 반복적으로 실시간 이미징을위한 뼈 창을 설정합니다. </li></ol></li><li> 50 ~ 100에서 35mm 숫자 0 커버 유리 배양 접시에서 개별 기관을 배치56 단계 : 2.5에 설명 된대로 단면 고정 또는 추가 처리없이 그대로 그들을 이미징 리터 PBS를. </li><li> 체적 영상의 경우, 차가운 PBS에 사용할 때까지 장기에 보관하십시오. 시간 경과 영상의 경우, 20 mM의 HEPES를 포함하는 10 % FBS 37 ° C에서 DMEM에 장기 이미징 즉시 진행 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2 공 초점과 두 개의 광자 현미경 및 이미지 분석 <ol><li> 멀티 라인 아르곤, 다이오드 561 nm의 헬륨 네온 594 nm의, 그리고 헬륨 네온 633 nm의 가시 레이저를 장착 한 라이카 SP5 5 개의 채널 공 초점 및 광자 시스템을 사용하여 현미경 이미징을 수행합니다. 680에서 분산 보정과 1,080 nm의 여기에 사파이어 (티 - 사) 레이저, 조정 : 2 광자 모드, 펄스 펨토초 티타늄에 사용합니다. t와 순차적으로 또는 동시에, 1,030-1,300 nm의 것이면 출력 파장 범위를 확장하는 적색 편이 (FPS tdTomato 및 mCherry), 광 파라 메트릭 발진 (OPO) 레이저를 포함하는 실험에 사용티 - 사행 레이저 그가. </li><li> - IRAPO-L HCX 25X / 0.95 NA 물 침지 목표 (WD = 2.5 mm), HC-PLAPO-CS 20 배 / 0.70 NA 건조 목적 (WD = 0.6 mm) 또는 HC-PL-IRAPO 40 배를을 사용하여 이미지의 다양한 조직 /1.1 NA 침수 목적 (WD = 0.6 mm). </li><li> 제어뿐만 아니라 단일 FP 레고 벡터로 형질 도입 된 BM 세포로부터 가시 스펙트럼의 5 nm의 대역폭에 발광 람다 스택 (xyλ)를 수집하는 공 초점 형광 스펙트럼을 구하는, BM을-이식하지. <ol><li> 라이카 LAS-AF의 v2.4.1 소프트웨어 프로세스 이미지는 모두 5 FP의의 참조 스펙트럼과 형광도의 등 (그림 2A)를 만들 수 있습니다. 개별 FP 스펙트럼 및 형광 밝기의 차를 이용하여 다음과 같이 다섯 순차 촬상 채널을 설정 세룰 리안 (79 %), 금성 (1백56퍼센트) tdTomato (283퍼센트) 및 mCherry (47 %)의 (EGFP의 백분율로서 표현) 세룰 리안 (458 / 468-482 nm의), EGFP (488 / 496-514 nm의), 비너스 (514 / 523-558 nm의), tdTomato (561 / 579-597 nm의), 그리고 mCherry (594 / 618-670 nm의) ( <str옹&gt; 그림 2B). </li><li> 각 개별 FP 형질 세포가 나머지 (그림 2C) 만 해당 채널에 표시하고 결석으로, 정확한 FP의 분리를 확인합니다. 또한,이 정의되어 멀티 채널 접근은 후속 컬러 클론 분석 및 추적을 가능하게하고 스펙트럼 이미징에 비해 획득 시간을 감소시키는 이점을 가지고 고유 한 5 - 채널 &quot;용 ColorPRINT&quot;를 생성한다. </li></ol></li><li> , 2 광자 모드에서, 네 개의 채널이 아닌 descanned 검출기 (NDD) 등으로 수집 맞춤 이색 미러 고효율 의해 분리 형광 방출은 다음과 같다 : 465 nm에서의 다이크로 익 미러이어서 568 nm에서의 다이크로 익 미러는, 다음 SHG 또는 자기 형광 및 하늘색, tdTomato 또는 mCherry위한 EGFP 또는 비너스 40분의 525 nm의 방출 필터 및 648 나노 미터의 다이크로 익 미러와 60분의 620 nm의 방출 필터는 45분의 452 nm의 방출 필터. <ol><li> 두 광자 현미경의 난에 의해 구조 정보를 공개ntrinsic 대비 (780 nm에서 흥분) 엘라스틴, NADH에서 조직자가 형광의 위에서 설명한대로 이미징 및 초 고조파 다시 산란에서 수집 한 920 나노 미터 또는 860 nm에서 (흥분 뼈와 섬유의 콜라겐의 신호 (SHG)를 생성 방향) 10, 11. </li></ol></li><li> 3 차원 볼륨 렌더링의 경우, 골수 및 다른 조직에 걸쳐 깊이의 범위 (150 ~ 300 μM) 위에 5 μm의 간격으로 Z-축을 따라 XYZ 이미지 시리즈 (보통 1 × 1 × 4 μm의 3 복셀 사이즈)를 수집하고, 소프트웨어의 타일 기능을 이용하여 큰 영역을 자동적으로 전체 흉골 fossae 약 2.5 × 1.2 mm 2 (XY) 및 300 μM (z) (도 2D-2E) 및 영화 일을 포함 스티치 볼륨을 생성하기 위해 위에. <ol><li> 이미지는이, 팔 절단을하지 않고 두개골을 통해 직접 골수 개관. </li><li> 다음 시상면 (양분)과 함께 제 흉골횡 방향으로 절단 얼굴 3,4,12을 통해이 흉골 해자와 이미지 사이의 조인트 (Takaku에서 적응 그림 1B의 개요 등 세). </li></ol></li><li> 4D 시간 경과 영상의 경우, 50 ~ 100 μL에서 35mm 숫자 0 커버 글라스 배양 접시에 포경 갓 절제 오금 림프절, 비장, 폐, 또는 두개골 뼈 샘플을 배치 37 ° C에서 20 mM의 HEPES를 포함하는 DMEM, 10 % FBS 와 ~ (Z-스택을 복용, 공 초점 여자 (458 나노 미터, 488 나노 미터, 514 나노 미터, 561 나노 미터, 594 나노 미터) 라이카 공진 스캐너 (8,000 Hz에서 / 초)와 결합 된이 광자 티 - 사 여기 (860 나노 미터)를 사용 최대 1 시간 동안 20 초 간격으로 80 μM). <ol><li> 동시에 세 가지 컬러 2P 이미징 사용 티 - 사를 들어 860에서 조정 nm 인 동시에 OPO의 (tdTomato에 1,130 nm에서 조정 또는 1,140 nm의 mCherry) 레이저 (동영상 2). </li></ol></li><li> 3D 볼륨과 4D 시간 시퀀스의 재건 및 분석 <ol><li> Imaris 64의 소프트웨어를 사용하여이전에 3,4 바와 같이, 버전 7.6 또는 볼륨 렌더링 (3D)로 RAW 이미지의 타일 - 스택을 변환하는 다른 소프트웨어 패키지 골수 및 다른 조직과 3D 회전 영화로 내보내려면 내부 형광 세포의 데이터이다 (동영상 1) 단계별 예 : <ol><li> Imaris에서, Z-스택 이미지를 엽니 다; 선택 3D 볼륨 가시화를 표시하기 위해 &quot;능가&quot;. </li><li> 360 °의 주위에 볼륨을 설정하는 &quot;이동&quot;를 사용합니다. </li><li> 애니메이션을 만들려면 &quot;애니메이션&quot;을 선택; 선택보기, 줌, 볼륨의 회전을 추가 할 키 프레임을 사용; 영화를 미리 필요한 편집하고 원하는 영화 형식으로 파일을 저장 (예 : AVI, MOV). </li></ol></li><li> 3D 셀과 클론 주파수, 위치, 크기 및 분포의 정량적 평가, 상기 프로세스에 대한 거리 MEAS 수행 MATLAB 애플리케이션 통합 Imaris XT 모듈을 사용하여 Z-스택(거리 변환 알고리즘을 사용하여) urements과 클러스터 분석과 같은 이전 설명 3,4. Imaris의 64 소프트웨어의 볼륨 렌더링 사 차원 (4D) 영화로 시간이 지남에 따라 이미지 스택의 시퀀스를 변환 및 회귀 움직임 알고리즘을 사용하여 입체적으로 세포 운동성의 반자동 추적 지점 및 표면 분석을 사용합니다. </li><li> 다음과 같이 세포의 멀티 스펙트럼 분석을 수행 : 멀티 컬러에 새로운 채널로 Imaris XT의 채널 연산을 통해 모두 5 채널을 추가하여 표시된 지점을 추출; 모든 반점 (셀) 5 컴포넌트 채널들 각각의 평균 형광 강도를 결정. 개별 셀의 각 FP (그림 2E 그래프)의 상대 % 즉, 고유의 &quot;용 ColorPRINT&quot;를 표시하는 그래프를 플롯 엑셀 소프트웨어의 값을 내 보냅니다. 티슈 드리프트에 설정된 데이터를 정정하고, 셀의 변위 속도와 시간의 경과, 트랙 길이, 경로 및 거리를 계산; 엑셀 사무실 용 수출 값그래프를 그리는 tware. 어도비 포토샵 CSS 5 소프트웨어 복합 수치를 조립합니다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li><li>Takaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis+in+3+dimensions+human+and+murine+bone+marrow+architecture+visualized+by+confocal+microscopy.">Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy.</a> Blood. 116, e41-e55 (2010).</li><li>Malide, D., Metais, J. 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저자는 경쟁 금융 이익을 선언하지 않습니다.

우리는 살아있는 조직에 메스하고 역동적 인 이미지를 달성하기 위해 직렬 공 촛점 및 2 광자 현미경 5FP 인코딩 레고 벡터와 영상으로 표시 조합에 의해 생성 된 큰 다양성을 결합, 여기에 최근 클론 세포 추적을위한 고안 강력한 방법의 세부 사항을 설명합니다. 이것은 5 &quot;뚜렷한&quot;8 비트 채널에서 촛점 스펙트럼 ID를 기록하여 마킹 FP 기반 컬러의 사용을 확장. 따라서 각 셀 내에서 세룰 리?...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

혈액 세포, 조혈 지칭의 제조는, 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)의 작은 집단에 의해 유지된다. 이러한 세포는 모두 자기 갱신 및 1,2 분화의 제어에 연루, 골아 세포, 간질 세포, 지방 조직, 혈관 구조로 이루어진 복합 미세 환경 틈새 골수 (BM) 내에 상주. 그대로 BM 직접 관찰 전통적으로 액세스 할 수없는 한 바와 같이, HSPC과 미세 환경 사이의 상호 작용은 생체 내에서 주로지지 않은 남아있다. 이전에, 우리는 공 초점 형광 및 반사 현미경 3를 사용하여 그대로 BM의 3 차원 구조를 시각화하는 방법을 설립했다. 우리는 BM-EGFP에 표시된 HSPCs의 확장을 특징으로하지만, 단지 하나의 FP 사용 클론 레벨에서 재생의 분석을 배제. 아주 최근에 우리는 구조적으로 FL을 표현 렌티 바이러스 유전자 존재론 (레고)의 장점 벡터를했다uorescent 단백질 수 (fps)을 효율적으로 세포 4,5를 표시합니다. 3 또는 5 벡터와 HSPC의 공동 형질이 여러 개인 HSPC 클론의 추적을 허용, 조합 색상의 다양한 팔레트를 생성합니다. 표시됨 HSPC는 조사 된 마우스의 BM 개별 HSPC 원점 복귀 및 생착를 추적하도록 허용 새로운 이미징 기술과 결합. 레고 벡터는 뼈와 기타의 명확한 시각화를 허용, (세루 리안, eGFP는, 금성, tdTomato 및 mCherry부터) 셋 또는 다섯 다른 FP의와 HSPC을 표시하고 공 촛점 및 2 광자 현미경에 의한 BM에서 시간이 지남에 따라 자신의 생착을 수행하는 데 사용 된 매트릭스 구조, 및 그 구성 요소의 미세 HSPC 클론 관계. HSPC 레고 벡터로 형질 C57BL / 6 마​​우스 BM의 계보 음성 세포로 정제하고, myelo - 절제 congenic 마우스로 꼬리 정맥 주사로 reinfused되었다. 흉골 BM 조직의 큰 볼륨을 모니터링함으로써 우리는 초기에 발생하는 골 내막 생착을 시각화BM 재생. 다양한 컬러 스펙트럼이있는 셀 클러스터는 뼈 가까이에 처음 등장하고 시간이 지남에 따라 중앙에서 진행. 흥미롭게도, 이상 삼주 후 골수 오히려 혈류를 통해 HSPCs 널리 보급보다 연속적으로 골수에서 개별 HSPCs에서 유래 조혈의 확산을 제안, 거시적 클론 클러스터로 구성되었다. 작은 색상의 다양성은 다수의 벡터와 세포를 다시 채우기 장기 열 변환하는데 어려움을 시사 늦은 시점에서 있었다. 또한 HSPCs는 마우스에서 비장에 대한 책임 또한 조혈 기관을 클러스터 형성. HPSC에서 파​​생 된 각각의 세포뿐만 아니라, 흉선에서 림프절, 비장, 간, 폐, 심장, 피부, 골격 근육, 지방 조직, 신장 해결 될 수있다. 3D 이미지는 조직의 최소한의 교란과 세포의 분포를 평가하는 정 성적 및 정량적으로 평가 될 수있다. 마지막으로, 우리는 설명공진 스캔 광자 공 촛점 시간 경과 영상을 결합하여 4D 라이브 동적 스터디의 개발 가능성. 이 방법론은 조직 재생 및 병리학의 연구에서 강력한 도구를 제공, 자신의 본래 3D 아키텍처 스펙트럼 표시 세포 인구의 비 침습적 높은 해상도, 다차원 세포 운명의 추적을 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Production of viruses</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-Cer2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27338</td>
			<td>Expression of Cerulean</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-G2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">25917</td>
			<td>Expression of eGFP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-V2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27340</td>
			<td>Expression of Venus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-T2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27342</td>
			<td>Expression of tdTomato</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-C2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27339</td>
			<td>Expression of mCherry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Calciumm Phosphate Transfection Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAPHOS-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Tissue culture dish</td>
			<td style="width:493px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:216px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">IMDM</td>
			<td style="width:493px;">Gibco, Life Technology</td>
			<td style="width:216px;">12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td style="width:493px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Pen Strep Glutamine</td>
			<td style="width:493px;">Gibco, Life Technology</td>
			<td style="width:216px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:493px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">SW28 Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:493px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">L60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um)</td>
			<td style="width:493px;">Millipore</td>
			<td style="width:216px;">SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:493px;">Quality Biologicals Inc.</td>
			<td style="width:216px;">118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Lineage Cell Depletion Kit (mouse)</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LS columns + tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-041-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Pre-Separation Filters (30um)</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:493px;">StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc&#160;</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">murine IL-11 CF</td>
			<td>R &#38; D Systems Inc</td>
			<td>418-ML-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">recombinant murine SCF</td>
			<td style="width:493px;">RDI Division of Fitzgerald Industries Intl&#160;</td>
			<td>RDI-2503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">recombinant murine IL-3</td>
			<td>R &#38; D Systems Inc</td>
			<td>403-ML-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">FLT-3 Ligand</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-096-480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">12-well plates, Costar</td>
			<td style="width:493px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:216px;">3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Retronectin</td>
			<td style="width:493px;">Takara Bio Inc</td>
			<td style="width:216px;">T100A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Protamine Sulfate</td>
			<td style="width:493px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">P-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Confocal and two-photon microscopy</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">DMEM</td>
			<td style="width:493px;">Lonza</td>
			<td style="width:216px;">12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">1M Hepes</td>
			<td style="width:493px;">Cellgro, Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:216px;">25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Glass bottom culture dish P35G-0-20-C</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Glass bottom culture dish P35G-0-14-C</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm</td>
			<td style="width:493px;">Coherent</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm</td>
			<td style="width:493px;">Coherent</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Imaris software version 7.6</td>
			<td style="width:493px;">Bitplane</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells marked by five fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy

우리는 개발과 쥐의 골수 이식 실험 모델을 이용하여 생체 내 조혈에서 공부하는 높은 공간 및 시간 해상도와 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)의 클론 추적을위한 방법론을 표시하는 형광을 확인. 형광 단백질 (fps)를 코딩하는 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 표시하는 유전자 조합이 고급 현미경 영상을 통해 세포 운명 매핑 할 수있었습니다. 다섯 가지 FP의 인코딩 벡터 : 세룰 리안, EGFP, 금성, tdTomato 및 mCherry 컬러 표시 세포의 다양한 팔레트를 만드는 동시에 HSPCs를 형질 도입하는 데 사용되었다. 공 초점 / 두 광자 하이브리드 현미경을 사용하여 영상의 동시 고해상도 고유 표시 세포의 평가와 조직 구조 구성 요소와 함께 자신의 자손을 할 수 있습니다. 체적은 스펙트럼 적 부호화 HSPC 유래 세포는 비 침습적 골수 손상을 포함하는 다양한 조직에서 검출 될 수있는 것으로 나타났다 (큰 영역 위에 BM 분석), 이식 다음 시간의 광범위한 기간 동안. 4D 비디오 속도 광자 공 촛점 시간 경과 영상을 결합 라이브 연구는 정량적 인 방법으로 동적 세포 및 클론 추적의 가능성을 보여줍니다.

전체 마운트 3D 공 초점 흉골 골수 시간 코스 / 2 광자 현미경 복원은 놀라운 특성을 가진 패턴으로 생착 및 이식 공동 5FPS의 확장을 밝혀 : 클론 명확하게 윤곽이 균일하게 넓은 초기 색상 팔레트 및 진행 표시 등장 시간이 지남에 따라 우선적으로 주로 하나의 색의 셀을 포함한다. 공 초점 현미경 설치 및 흉골 골수에서 영상 5FPS 마크 HSPC의 대표적인 예는 그림 2와 영화 1과 2에 나타내?...

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In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

13.1K 조회수.  NHLBI/NIH.  조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다. 

비디오: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

I am Christina Ceso. I am a postdoc in David's Den lab and I work on the hematopoietic stem cells. Today we are going to purify long-term recuperating hematopoietic stem cells and we'll transplant them into a mouse.We start by spraying the mice with alcohol so that first of all, the mind starts sterilized and also the hair doesn't interfere with the dissection. We use PBS with 2%serum for the dissection. I cut the back skin and I pull the skin apart in order to expose the tissue.In order to isolate the tibia, I hold the tibia with tweezers. I cut the tendon on top of the knee and I cut the muscles below the knee and after that I cut through the knee so that the TBI is not connected to the rest of the limb anymore and I pull in order to isolate it. I then hold the TB upside down and with the scissors I separate the foot from the tibia In order to obtain the femur.I cut the muscles around the femur and then I dislocate the femur from the hip. In order to isolate the hip, I cut the muscle around the hip bone on the side of the tail of the mouse and then I pull the hip away from the body of the mouth In order to isolate the spine. I cut through the tail as close as I can to the beginning of the back and then I cut on the two sides of the spine and below the spine, trying to stay as close as possible to the spine so that the peritoneum is not cut and the intestine is left untouched.A first round of cleaning of the bones is done with a scalpel, which is used to scrape the bone, the muscles away from the bone. The scalpel is good to clean the femurs, the hip and the spine. In order to clean the tibia, I hold them with forceps and I use the forceps to remove as much tissue as possible.A second round of cleaning is done using clean wipe to completely clean the bones outta the muscle, and I use the F wipe to clean the tibia, the femurs and the hips. So this is how bones look. After cleaning, I prefer 50 amount tubes with filters on top and I transfer the bones into the mortar.I add the section media and I crush the bones ask of the first round of crashing of the bones. I piped the mixture in order to release as many styles as possible into solution and reduce clumps. I transferred the mixture on the tubes through the filters and this is what the bone fragments look like after the first round of crushing.So I add more dissection medium to the bone fragments and I flash them again. I transferred the seline mixture to the tubes through the filters and at this point the remaining bone fragments are white and there is no bone marrow left. The tubes are filled with PBS 2%serum and in order to have them all with the same weight so that they're balanced in the centrifuge, but also in order to wash the filters so that we obtain as many cells as possible, I then centrifuge the cell mixture and after centrifugation, the palt includes the bone marrow cells.I aspirate the medium and I move back and forward the tube on the rack so that the pelle is becomes loose and fewer clamps are formed. When I add medium, at this point I add one ml of medium per tube and I ics since I'm sorting hematopoietic stem cells. Later on, I'm going to store an ALI output of total bone marrow sizes at this point, which I will use later for the fact single color control.I add lineage antibody cocktail. I ordered the samples to mix them well and I invaded four degrees for 15 minutes. In the meantime, I start preparing the columns for the lineage division.I put the columns on the magnet and I prepare Ian tubes under the columns. I also prepared the gas PBS using aster flip filter and attaching it to the vacuum so that all the bubbles of air move in the top part of the filter. I then add three ml of the gas DBS to each column in order for the column to become wet.After the incubation with the antibodies, I add medium to the cell samples and I centrifuge them in order to remove the excess of antibodies. After the centrifugation, the stain cells are in the pallet. I aspirate the medium and I suspend the pallet in one mile of the gas PBSI Add the strip tab beans, I mix the cells and I incubate for 15 minutes at four degrees.After the incubation, I put new elucian tubes under the columns. I add two ml of PBS to each tube with the cells and I transferred the cell mixture to the column through a 40 micron filter. I wash the tubes with more medium in order to collect all the cells remaining and I apply the remaining medium through the filters to the columns.The progenitor cells lineage low are alluded into the collection views. I pulled the luted samples and I sent tofu them. So after the centrifugation, the depleted cells are in a white pate.I aspirate the medium and re suspend the cells. I store an adequate of the depleted cells and I add the antibodies to the cell mixture for the sorting and also to all the single color controls. The antibodies are incubated in that with the size for 15 minutes in the fridge.After the ation, I add medium to the cells and and centrifuge them to remove the ex excess of antibodies. After the centrifugation, the cells are in the pt, I aspirate the media that I suspend the cells and I transfer the cells into fox tubes with a blue filter. At this point, the cells are ready to be sorted.I place, I place the mouse under a heating lamp for a few minutes so that the veins dilate and they are more easily seen. When preparing the syringe, you have to be careful to eliminate all the bubbles from the, the mixture that is in the syringe and then you bend the needle at 90 degrees. I put the mouse under a glass cup with a weight on top so that it can run away.I sterilize the tail with the alcohol pad so that the site of injection is sterile, but also it's easier to identify the vein. If you look at the tail of the mouse from the top in the middle and top of the tail, there is an artery while on the two sides there are the two veins and we inject the cells in one of the two veins. I insert the needle into the vein and I inject following injection.It is to wait for a couple of seconds before removing the needle, the needle, and after that I clean the side of injection. This is a representation of the syringe with the ben needle bent at 90 degrees with the knee, the at this ankle compared to the tail, which makes the injection the easiest. When you injecting the tail of the mouse, you have to keep in mind that the tail vein is extremely superficial, so really this is the orientation of the needle compared to the tail.And it looks like you will just keep sliding on top of the tail, but actually you will get into the tail then. I am Christina Ceso. I am a post in David Kaden lab, and I work on the hematopoietic stem cells.I usually use for animals to start with, and I had more variability at the beginning, but once you become consistent with your methods, I consistently get about 50, 000 to 60, 000 stem cells out for mice. I did my PhD in London with Dr.Fiona Wat working on derma stem cells. After that, I just wanted to have a wider knowledge of adult stem cells in various tissues, and so I decided to move to David Kaden lab to work on hematopoietic stem cells, mainly because the things that are known about hematopoietic stem cells are the things that are not known for the epidermic stem cells and a number of assays that can be done with epi.Epidermal stem cells are not really done yet with the hematopoietic stem cells, and so at this point I'm trying to put together the, the knowledge from the two different fields and ultimately I'm interested in the study of the mechanism to regulate adult tissue sensors in general, so not just the epidermis or the stem cells, but also different tissues because there are, there are similar mechanism that is, it's always the same genes that are involved in the regulation that just interact with each other in different ways, and it's just interesting to understand what makes each stem cell be a stem, but then ultimately a stem cell in a different tissue. So giving rise to a different protein.

분리 및 조혈 줄기 세포의 이식 (HSCs)

연구

생물학

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

작은 동물의 근육 Engraftment의 역학에 의해 추적 VIVO에서 형광 이미징

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

전 생체 내 공초점 현미경을 사용하여 림프절 구조 및 세포 국소화 시각화

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...